Articolo metodologico

Trasduzione ed espansione delle cellule T primarie in nove giorni con manutenzione del fenotipo della memoria centrale

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DOI:

10.3791/60400

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18 marzo 2020

 , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

In questo articolo

Sommario

Illustreremo un protocollo di 9 giorni per la trasduzione e l'espansione delle cellule mononucleari periferiche del macaco rhesus che produce cellule con un'eccellente co-espressione dei geni di interesse in numero sufficiente per gli studi di infusione dell'efficacia cellulare.

Abstract

Le immunoterapie emergenti per il trattamento di malattie infettive e tumori spesso comportano la trasduzione di popolazioni cellulari con geni che codificano proteine che mirano alle malattie. Ad esempio, le cellule chihimeric antigene (CAR)-T per trattare i tumori e le infezioni virali comportano la trasduzione delle cellule T con geni sintetici che codificano molecole CAR. Le molecole CAR rendono le cellule T specificamente riconoscere e uccidere il cancro o le cellule viralmente infette. Le cellule possono anche essere co-transdotte con altri geni di interesse. Ad esempio, le cellule possono essere co-tradotte con geni che codificano proteine che prendono di mira le cellule in posizioni specifiche. Qui, presentiamo un protocollo per trasdurre le cellule mononucleari primarie del sangue periferico (PBMC) con geni che codificano una CAR specifica del virus e il recettore chemiochina della molecola del follicolo delle cellule B tipo 5 (CXCR5). Questa procedura richiede nove giorni e si traduce in popolazioni di cellule T trasdotte che mantengono un fenotipo della memoria centrale. Il mantenimento di una memoria centrale o di un fenotipo meno differenziato ha dimostrato di associarsi alla persistenza delle cellule post-infusione. Inoltre, le cellule prodotte con questo metodo mostrano alti livelli di vitalità, alti livelli di coespressione dei due geni trasdotti e grandi quantità sufficienti di cellule per l'infusione immunoterapeutica. Questo protocollo di nove giorni può essere ampiamente utilizzato per le cellule CAR-T e altri approcci di immunoterapia a cellule T. I metodi qui descritti si basano su studi presentati nelle nostre precedenti pubblicazioni.

Introduzione

Le immunoterapie cellulari stanno emergendo come un nuovo mezzo per trattare malattie tra cui tumori e malattie infettive. Questi metodi di immunoterapia spesso comportano la manipolazione genetica delle cellule terapeutiche per esprimere molecole specifiche. Ad esempio, le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) sono progettate per esprimere una molecola CAR che ha un dominio extracellulare che lega specificamente le molecole sulle cellule malate e un dominio di segnalazione che attiva le cellule immunitarie per uccidere la cellula malata. Le cellule T CAR vengono utilizzate con successo nelle immunoterapie oncologiche e sono state particolarmente efficaci nel trattamento delle leucemie delle cellule B1,2,3. Anche le cellule CAR-T sono in fase di sviluppo per trattare infezioni virali come l'HIV. I CR specifici per l'HIV prendono di mira le proteine dell'involucro sulla superficie delle cellule infette viralmente4. Le cellule immunoterapeutiche possono anche essere progettate per esprimere molecole di homing per indirizzare le cellule terapeutiche a specifiche posizioni tissutali. Abbiamo sviluppato vettori che traducono sia una RCA specifica del virus che la molecola di sollevamento del follicolo linfoide CXCR55.

La replicazione virale di alcuni virus, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e il virus dell'immunodeficienza simiana (SIV), è concentrata all'interno dei follicoli cellulari B nei tessuti linfoidi secondari6. I follicoli cellulari B sono siti privilegiati in qualche modo immuni in cui bassi livelli di CTL specifici per virus consentono la replicazione virale in corso7,8. Per questi motivi, indirizzare le cellule T specifiche dell'HIV/SIV nel follicolo attraverso l'espressione di CXCR5 è una strategia per l'eliminazione del serbatoio follicolare di cellule viralmente infette9,10. In particolare, stiamo prendendo di mira le cellule T CAR specifiche del SIV ai follicoli cellulari B tramite la co-espressione CXCR5.

In questo protocollo viene descritto un metodo per trasdurre CAR/CXCR5 ed espandere i PBMC per produrre cellule T CAR/CXCR5 di quantità sufficienti per l'infusione terapeutica. Le cellule trasdotte con questi metodi mantengono un fenotipo della memoria centrale. Gli studi hanno dimostrato che le cellule con un fenotipo meno differenziato, come le cellule T a memoria centrale e le cellule staminali della memoria T persistono meglio rispetto alle cellule più differenziate11,12. Inoltre, molti protocolli progettati per produrre cellule trasferite adottivamente hanno tempi di coltura relativamente lunghi che si traducono in cellule che hanno un fenotipo più differenziato e ridotta persistenza13. Inoltre, apportata trasferito cellule con lunghi tempi di coltura accumulati all'interno dei polmoni invece di tessuti linfoidi bersaglio nel macaco rhesus14,15. Nei metodi che descriviamo e dimostriamo qui, trasduciamo rapidamente ed espandiamo i PBMCC del macaco rhesus per produrre cellule T trasdotte che mantengono un fenotipo della memoria centrale.

Entrambe le cellule T CD4 e CD8 sono incluse nel nostro approccio immunoterapico. Questa popolazione di cellule miste è stata scelta perché, negli studi clinici, l'assenza di cellule T CD4 nel prodotto delle cellule T CD8 è stata correlata con un fallimento delle cellule T CD8 infuse per sistere 16. I metodi qui descritti iniziano attivando i PBMC con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 che stimolano potentemente il recettore delle cellule T e forniscono un segnale co-stimolante per evitare l'anergico clonale17,18.

Dopo l'attivazione, le cellule vengono trasdotte con un vettore gammaretrovirale che codifica una CAR specifica del virus e la molecola di homing linfoide CXCR5. Le cellule trasdotte vengono quindi espanse utilizzando piastre progettate per la propagazione delle cellule non aderenti che hanno una membrana permeabile al gas alla base. Questa membrana permette lo scambio di gas nella parte inferiore del pozzo che porta ad una maggiore sopravvivenza cellulare e disponibilità di nutrienti19. Utilizzando questi metodi, celle funzionali sufficienti possono essere prodotte in un lasso di tempo di 9 giorni per gli studi di infusione in vivo. Mentre questo protocollo è progettato per trasdurre ed espandere le cellule T del macaco rhesus, con una leggera modifica degli anticorpi attivanti specifici della specie, può essere utilizzato con cellule di altre specie. Questi metodi si basano sui nostri studi pubblicati in precedenza9,20.

Protocollo

NOTA: questo protocollo di trasduzione pbMC rhesus richiede l'uso di un vettore gammaretrovirale. Si noti che il gammaretrovirus può essere prodotto in laboratorio o esternalizzato a una società di produzione virale. Nella produzione di laboratorio può essere effettuata con il protocollo descritto al punto 1 e il virus può essere titerizzato come descritto nel passaggio 2. Se il virus è prodotto in loco o da una società di produzione, un MOI (rapporto di virioni infettivi e cellule in coltura) dovrebbe essere determinato, come descritto al punto 3, per ogni nuova preparazione virale e le cellule di interesse.

AGGIORNAMENTO: Lavorare con vettori gammaretrovirali o altri vettori retrovirali richiede adeguate precauzioni di sicurezza come l'uso di camice da laboratorio e doppi strati di guanti. Tutta la manipolazione del virus deve avvenire nel cofano di biosicurezza. Tutti i pipet devono essere decontaminati in una soluzione di candeggina del 10% per 30 min. Tutti i rifiuti infettivi liquidi devono essere decontaminati con una concentrazione finale di candeggina del 10%. Il contenimento secondario, con una guarnizione che impedisce il rilascio di aerosol microbiologici, è necessario per la centrifugazione

1. Produzione del materiale gammaretrovirale

  1. Piastra 293T cellule per la trasfezione. Una preparazione completa del virus richiede 12 flaconi T75 a 4,5 x 106 cellule/flacca nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) - 10% siero bovino fetale (FBS) senza antibiotici.
  2. Lasciare che le cellule crescano durante la notte a 37 gradi centigradi prima della trasfezione.
  3. Diluire 60 -L di reagente di trasfezione in 1,5 mL di supporto siero ridotto. Preparare un tubo per ogni pallone. Incubare per 5 minuti a RT.
  4. Per ogni pallone, preparare un tubo contenente 1,5 mL di supporti siero-interni e i seguenti plasmidi: 9,0 g di un plasmide di trasferimento contenente i geni di interesse, 3 g di RD114 e 1,2 g di VSV-G (plasmidi di inviluppo) e 3 g di gag/pol.
    NOTA: I geni busta e gag/pol sono necessari per l'imballaggio retrovirale. Per la nostra produzione retrovirale, aggiungiamo sia la busta RD114 che, per una maggiore stabilità, una piccola quantità di busta VSV-G.
  5. Aggiungere plasmidi diluiti (passaggio 1.4) al reagente dismissionario diluito (passaggio 1.3). Mescolare delicatamente. Incubare per 20 min a temperatura ambiente.
  6. Coltivare le celle 5 mL di supporti completi freschi e aggiungere 3 mL di miscela reagente/plasmide di trasfezione dropwise per fiaschetta e incubare per 5-6 h a 37 .
  7. Aggiungere altri 5 mL di mezzo fresco ai flaconi e incubare per 42-43 h a 37 gradi centigradi.
  8. Dopo un tempo totale di trasfezione di 48 h, raccogliere i supporti e la centrifuga a 1282 x g per 3 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i detriti cellulari.
  9. Aliquota in volumi appropriati per un uso futuro, flash congelare il virus in un bagno di ghiaccio etanolo / secco e conservare a -80 gradi centigradi.

2. Il titolo del Gammaretrovirus

NOTA: potrebbero essere necessarie diverse diluizioni di virus per ottenere un titro valido.

  1. Piastra 293T cellule a 600.000 cellule / pozzo in una piastra 6-po ' e incubare le piastre per 24 h a 37 gradi centigradi.
  2. Rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere la quantità desiderata di DMEM - 10% FBS al 293T (2 mL volume totale del virus).
  3. Aggiungere il virus al pozzo corrispondente e girare delicatamente per mescolare. Ad esempio, aggiungere 200 l, 100 l, 50 l e 25 l rispettivamente a 4 pozze. Includere un pozzo senza virus per la citometria di flusso (esempio fittizio).
  4. Incubare per 48 h a 37 .
  5. Provare le cellule 293T aggiungendo 0,5 mL di Trypsin-EDTA e incubando per 4 min a 37 gradi centigradi. Arrestare la trypsin aggiungendo 1,5 mL di DMEM - 10% FBS. Contare le cellule e determinare la vitalità con un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro.
    1. Per utilizzare il contatore cellulare, aggiungere 10 celle a 10 o più l di trypan blu, mescolare, caricare il vetrino da camera e inserirlo nel contatore. Premere il pulsante "cattura" per contare le celle.
  6. Raccogliere 0,5-1 x 106 celle e valutare i livelli di CAR e CXCR5 per citometria di flusso (vedere il passaggio 9.5). L'espressione di CD4 o MBL insieme a CXCR5 identificherà le cellule 293T trasdotte che co-esprimevano la RCA e la CXCR5. Vedere gli anticorpi reattivi nel passaggio 9.5.1.
  7. Calcola il titro virale.
    NOTA: scegliere il campione con un livello di trasduzione del 20% o meno per il calcolo del titro.
    1. Utilizzare la seguente formula per calcolare il titro:
      unità di trasduzione/mL (numero di cellule in coltura)(% di cellule trasdotte)/volume del virus aggiunto alla coltura

3. Determinazione del MOI ottimale per una preparazione virale di nuova produzione e le cellule di interesse

  1. Seguire il protocollo di trasduzione (sezioni 4-9) con PBC primari e due diluazioni della preparazione gammaretrovirale.
  2. Valutare il livello di espressione dei geni di interesse per citometria di flusso (passaggio 9.5).
  3. Scegli una concentrazione di virus che consenta la trasduzione massima senza perdita di vitalità cellulare.

4. Preparazione piastre per l'attivazione di cellule T da pozzi di rivestimento con anticorpi anti-CD3

  1. Preparare l'anticorpo CD3 anti-macaca (FN18) diluindo il brodo a 10 g/mL in salina con buffer fosfato (PBS).
  2. Distribuisci 2 mL/pozzo in piastre a 6 benessere. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 h. In alternativa, le piastre possono essere incubate durante la notte a 4 gradi centigradi.
  3. Aspirati il PBS e gli anticorpi non legati. Risciacquare i pozzi due volte con 2 mL di PBS e utilizzarli immediatamente per placcare PBMC.

5. Stimolare i RHEsus PBMC con Anti-CD3 e Soluble Anti-CD28

  1. Scongelare i PBMC rhesus primari in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi, con agitazione delicata, fino a quando rimane solo una piccola quantità di ghiaccio.
  2. Nel cofano, delicatamente pipette cellule in un tubo conico. Sciacquare la fiala con 1 mL di mezzo di base e aggiungerlo lentamente alle cellule. Successivamente, aggiungere lentamente altri 9 mL di mezzo di base caldo alle cellule.
    NOTA: questo passaggio può essere aumentato ma mai scongelare più di 4 fiale contemporaneamente.
  3. Centrifuga a 600 x g per 5 min a 22 gradi centigradi per pelletare le cellule. Aspirare il supernatante e poi risospendere il pellet in una piccola quantità di mezzo di crescita. Scegliere un volume tale che la concentrazione di cellule superi 2 x 106 cellule / mL a questo punto poiché la concentrazione finale dovrebbe essere 2 x 106 cellule / mL.
  4. Stain cellule con trypan blu e contare le cellule per determinare il numero di cellule vitali.
    NOTA: Questo può essere fatto con un emocitometro standard o un contatore cellulare automatizzato. Usiamo un contatore cellulare automatizzato che mostra la fattibilità e il numero di cellule vive.
    1. Per utilizzare il contatore, aggiungere 10 l di celle a 10 l trypan blu, mescolare, caricare il vetrino camera e inserire nel contatore. Premere il pulsante "cattura" per contare le celle.
  5. Calcolare il numero totale di cellule moltiplicando la concentrazione cellulare per volume e quindi diluire le cellule a 2 x 106 cellule / mL nel mezzo di crescita. Prima della placcatura, aggiungere anti-CD28 ad una concentrazione finale di 5 g/mL al fine di fornire un segnale di co-stimolazione necessario per l'attivazione delle cellule T.
  6. Cellule di pipetta in lastre rivestite anti-CD3. Aggiungere 3-6 x 106 cellule per pozzo (un buon obiettivo è 4 x 106 cellule in 2 mL di supporti per pozzo) e incubare per 2 giorni a 37 gradi centigradi nel 5% DI CO2.

6. Preparazione di piastre rivestite di fibronectina

NOTA: Le cellule PBMC e T esprimono i recettori dell'integrina VLA-4 o VLA-5 e sono buoni bersagli per la trasduzione mediata dalla fibronectina.

  1. Prima di rivestire le piastre, preparare il reagente fibronectina diluindolo 1:100 in PBS sterile.
  2. Pipette 2 mL della soluzione fibronectina sterile in ogni pozzo di una piastra di 6 pozzetti. Piastre di roccia delicatamente per 2 h a temperatura ambiente.
    NOTA: in questo passaggio è necessario utilizzare piatti o piatti di coltura tissutale non trattati e di grado cellulare.
  3. Rimuovere la soluzione fibronectina per aspirazione e quindi bloccare con 1 mL di sterile 2% siero bovino albumina (BSA, frazione V) in PBS. Cullare le piastre a temperatura ambiente per 30 min.
  4. Aspirati la soluzione BSA e lavate la piastra con 2 mL di PBS. Dopo l'aspirazione del PBS, le piastre rivestite di fibronectina possono essere sigillate con involucro di guarnigione e conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana.
    NOTA: Di solito prepariamo le piastre un giorno prima della trasduzione.

7. Trasduzione dei RMCs attivati

AVVISO: Lavorare con vettori virali o con Rhesus macaque PBMC richiede l'uso di precauzioni adeguate come l'uso di camice da laboratorio e doppi strati di guanti. Tutta la manipolazione del virus e delle cellule deve avvenire nel cofano di biosicurezza. Tutti i pipet devono essere decontaminati in una soluzione di candeggina del 10% per 30 min. Tutti i rifiuti infettivi liquidi devono essere decontaminati con una concentrazione finale di candeggina del 10%. Il contenimento secondario con una guarnizione che impedisce il rilascio di aerosol microbiologici, è necessario per la centrifugazione.

  1. Attaccare il vettore trasdutto gammaretrovirale al pozzo rivestito di fibronectina.
    1. Riscaldare una centrifuga a 32 gradi centigradi correndo a 2000 x g per circa 30 min.
    2. Riscaldare sia il siero libero che i mezzi di crescita in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
    3. Scongelare il virus sul ghiaccio o ruotando delicatamente la fiala in un bagno d'acqua a 37 gradi fino a quando rimane solo una piccola quantità di ghiaccio. Per evitare la degradazione della preparazione virale, non consentire al contenuto di riscaldarsi.
    4. Diluire il retrovirus per una predeterminata molteplicità ottimale di infezione (MOI) in mezzo senza siero.
      NOTA: Con il nostro gammaretrovirus e rhesus PBMC, abbiamo scoperto che un MOI di 0,5 è ottimale.
      1. Esempio di diluizione: per rivestire 4 pozzi con il virus e aggiungere 1,5 x 106 cellule, sono necessari (4)(1,5 x 106)(0,5) - 3 x 106 TU. Se il tibieto virale è 1,1 TU/mL, utilizzare il virus 2,7 mL in supporti da 5,3 mL per un volume totale di 8 mL.
    5. Aggiungere 2 mL di retrovirus diluito ad ogni pozzo della piastra rivestita di fibronectina.
    6. Per le cellule trasdotte in modo simulato di controllo negativo, aggiungere i supporti da soli ai pozzi rivestiti di fibronectina.
    7. Collocare le piastre nella centrifuga preriscaldata a 32 gradi centigradi in supporti a micropiastra con coperture biosicure e centrifugare a 2000 x g per 2 h.
      NOTA: Le lastre rivestite di virus possono essere utilizzate immediatamente o conservate, con virus, a 4 gradi centigradi durante la notte.
    8. Per un uso immediato, aspirare la preparazione del virus dai pozzi e aggiungere 2 mL di mezzo di crescita. Mantenere i pozzi rivestiti di virus dall'essiccazione.
  2. Piastrare i PBMC stimolati.
    1. Controllare le cellule utilizzando un microscopio invertito. Le cellule dovrebbero apparire sane, il che significa che sono luce rotonda, luminosa e rifrange. Dovrebbero anche mostrare un aspetto agglomerato che indica la stimolazione.
    2. Raccogliere le celle bersaglio e trasferirle in un tubo conico da 50 mL. Sciacquare il pozzo una volta con 1 mL supporti di crescita e aggiungere al tubo conico. Contare il numero di celle viventi con il contatore cellulare automatizzato come nel passaggio 5.4.
      NOTA: Le cellule stimolate saranno raggruppate e questo agglomeramento può portare a difficoltà nel conteggio accurato delle cellule.
    3. Pellet le cellule nei tubi centrifugando a 600 x g per 5 min a 32 gradi centigradi. Aspirare i media dal pellet cellulare e risospendere le cellule nel mezzo di crescita ad una concentrazione di 1,5 x 106 cellule / mL.
    4. Ad ogni pozzo rivestito di virus (preparato nel passaggio 7.1) aggiungere 1 mL di sospensione cellulare per un totale di 1,5 x 106 cellule/3 mL. Si noti che ogni pozzo contiene già 2 mL mezzo di crescita. Eseguire gli stessi passaggi per le cellule trasdotte finte, ma metterle su pozzi rivestiti di fibronectina che non hanno ricevuto alcun virus.
    5. Centrifugare le piastre a 1000 x g per 10 min a 32 gradi centigradi.
    6. Incubare le piastre per 48 h a 37 gradi sotto il 5% di CO2.

8. Espansione delle cellule trasdotte

  1. Disegnare il contenuto dei pozzi su e giù con un pipet da 5 mL al fine di riattivare le cellule e poi trasferire in un tubo conico 50 mL.
  2. Aggiungere 1 mL di mezzi di crescita ad ogni bene e disegnare su e giù con un pipet di trasferimento sterile per rimuovere le cellule aderenti.
  3. Contare le celle per determinare il numero totale di celle e la fattibilità utilizzando un contatore cellulare automatizzato come nel passaggio 5.4.
  4. Se lo si desidera, rimuovere 1 x 106 cellule per la citometria a flusso per valutare l'espressione genica e il fenotipo. Vedere il passaggio 9.5.1 e la Tabella dei Materiali per gli anticorpi consigliati e la strategia di gating.
  5. Centrifugare le cellule a 600 x g per 10 min a 25 gradi centigradi.
  6. Aspirare il supporto e risospendere le cellule in espansione media ad una concentrazione di 1 x 106 cellule / mL. Semina ogni pozzo permeabile a gas di una piastra di 6 pozzetti con 5 mL di cellule. Sovrapporre con attenzione altri 25 mL di supporti di espansione per pozzo.
    NOTA: Aggiungiamo le celle in un piccolo volume e poi sovrappuntiamo i supporti rimanenti in modo che le celle rimangano sul fondo del pozzo.
  7. Incubare le cellule indisturbate a 37 gradi centigradi nel 5% di incubatrice di CO2 per 4 giorni.

9. Raccolta di cellule espanse e valutazione del fenotipo della popolazione cellulare trasdotta

  1. Raccogliere le cellule da pozzi permeabili a gas rimuovendo e scartando supporti da 20 mL. Prestare attenzione per evitare di disturbare le cellule.
    NOTA: Espandiamo le celle solo per 4 giorni e raccogliamo le celle a questo punto. Tuttavia, se si desiderano ulteriori giorni di cultura, rimuovere 20 mL di supporti senza disturbare le cellule e sostituirlo con 20 mL di supporti di espansione nuovi.
  2. Tubo il supporto rimanente su e giù per spostare le cellule. I media dovrebbero essere molto torbidi se le cellule sono cresciute bene.
  3. Utilizzando un pipet di trasferimento sterile, risciacquare ogni pozzo con supporti da 3 mL per raccogliere eventuali cellule residue.
  4. Contare le celle con il contatore automatico o un emocitometro per verificare la fattibilità e il numero di cella.
  5. Eseguire la citometria di flusso per determinare l'espressione genica trasdotta e il fenotipo cellulare.
    1. In questo esempio, determinare il fenotipo PBMC macaca rhesus utilizzando anticorpi diretti contro CD4 (M-T477), un clone reattivo sia con rhCD4 endogeno che con rhCD4-MBL CAR; contro CD3 (SP34-2) e CD8 (RPA-T8) che macchiano rispettivamente le cellule T totali e le cellule T CD8; contro il recettore della morte CD95 (DX2) e la molecola co-stimolante CD28 (CD28.2) che vengono utilizzati per determinare il fenotipo di memoria delle cellule; e contro CXCR5 (MU5UBEE) e MBL (3E7) per rilevare CXCR5 e CD4-MBL CAR sulle cellule trasdotte.
    2. Valutare la redditività è stata valutata con un tinio di redditività fissabile.
    3. Preparare le cellule per la citometria di flusso.
      1. Costituisci un mix master anticorpale per il numero totale di tubi. Portare fino al volume totale utilizzando PBS.
      2. Aggiungere le celle ai tubi di flusso. Posizionare 0,5–1 x 106 celle per tubo. Includere controlli negativi come le cellule non colorate e le cellule trasdotte colorate.
      3. Aggiungere 2 mL di PBS alle cellule, centrifugare a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) e decantare.
      4. Aggiungere 100 l di miscela di anticorpi ai tubi e incubare per 30 min a RT.
      5. Aggiungere 2 mL di PBS, centrifugare a 400 x g per 5 min a RT e decant.
      6. Aggiungere 300 l di 1% di paraformaldeide e incubare per 15 min.
      7. Centrifuga a 400 x g per 5 min a RT e decant. Aggiungere 300 l di PBS e mescolare.
    4. In un citometro a flusso, acquisire 150.000 eventi per ogni campione.
    5. Analizzare i dati con il software di analisi del flusso.
      NOTA: La strategia di gating è stata pubblicata in precedenza20.
      1. Per l'identificazione delle cellule trasdotte, le cellule di cancello su linfociti, camono, live, CD3 e MBL-CXCR5.
      2. Per l'identificazione della popolazione di memoria centrale, le celle del cancello su linfociti, camono, CD3 in diretta, CD8, CD28 CD95.
  6. Utilizzare le celle in base alle esigenze. Le cellule possono essere utilizzate per saggi in vitro di funzione, come un saggio di migrazione trascurare9 o in vitro uccidendo i saggi5,9. Le cellule possono essere utilizzate per l'infusione in animali. In alternativa, congelare le cellule rimanenti in 90% FBS con 10% di zolfo dimetile (DMSO) per un uso o un'analisi successiva
    NOTA: Mentre non è ancora stata stabilita una dose mirata per l'infusione di cellule trasferite adottiva in un macaco rhesus, studi di trasferimento adottivi pubblicati in primati non umani hanno utilizzato da 0,6 a 1,2 x 107 celle/kg21, da 1 a 5 x 108 cellule/kg22 e da 1,4 a 8 x 108 celle/kg10. Con questa gamma come linea guida, è possibile produrre abbastanza cellule per l'infusione con questo protocollo di 9 giorni.

Risultati

Produzione cellulare
I risultati presentati in questa pubblicazione sono simili a quelli del nostro lavoro pubblicato in precedenza9,20. Utilizzando il protocollo qui presentato, ci aspettiamo almeno un'espansione di 8 volte delle celle tra i giorni 5 e 9 (mediana 11,1 volte, intervallo 8.7–13 piega). I pozzi permeabili al gas sono stati seminati ad una densità iniziale di 5 x 106 cellule e dopo 4 giorni di crescita, abbiamo raggiunto una densità mediana di 55,6 x 106 celle per pozzo (intervallo 43,5–64,8 x 106) (Figura 1A). Il conteggio cellulare con l'esclusione Trypan Blue mostra che le cellule mantengono un'elevata redditività per tutto il protocollo (giorno 9 mediana 85,8%, intervallo 83-95%) (Figura 1B). Troviamo variabilità animale-animale nella capacità delle cellule di espandersi; tuttavia, con una popolazione iniziale di 50–100 x 106 cellule il giorno 1, abbiamo usato questo protocollo per produrre abbastanza cellule per l'infusione del macaco rhesus di 1-2 x 108 cellule/kg.

La co-espressione dei geni trasdotti è stata monitorata con citometria a flusso (Figura 2A). L'espressione delle CAR e CXCR5 sulla superficie delle cellule trasdotte era relativamente stabile tra i giorni 5 e 9 di questo protocollo di espansione. Il giorno 5, una mediana del 42,8% (range 36,5–46,9%) delle cellule sono state tradusse sia con CD4-MBL CAR che con CXCR5 mentre il giorno 9 l'espressione mediana era del 47,6% (intervallo 44,5–64,5%) con un singolo giro di trasduzione (Figura 2B). Anche se alcuni protocolli richiedono un secondo ciclo di trasduzione, non abbiamo visto un beneficio in termini di cellule tradotte totali alla conclusione del protocollo (dati non mostrati).

Fenotipo cellulare
Le cellule trasdotte sono state analizzate dalla citometria del flusso per monitorare il loro fenotipo della memoria. Prima della trasduzione e dell'espansione, vengono identificate le popolazioni ingenue, di memoria centrale e di memoria efecusia (dati non mostrati), ma la popolazione ingenua viene persa con la coltura e le cellule sono principalmente celle di memoria centrali entro il giorno 5 (Figura 3A) e giorno 9 (Figura 3B) come identificato da CD95- CD28- espressione. L'uso di questo protocollo di rapida trasduzione ed espansione ha prodotto cellule che sono principalmente cellule di memoria centrali e quindi saranno più propense a proliferare e persistere quando infuse in un animale di prova.

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Figura 1: Il protocollo di trasduzione ed espansione produce abbondanti cellule trasdotte che sono altamente vitali. (A) Espansione delle cellule trandotte da 6 animali diversi dai 5 ai 9 giorni nei recipienti permeabili al gas e(B)della vitalità del PBMC trasdotto dagli stessi 6 animali. L'esclusione blu Trypan utilizzando un contatore cellulare automatizzato è stata utilizzata per monitorare il numero di celle e la fattibilità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Il protocollo di trasduzione produce cellule che mantengono la coespressione dei due geni trasdotti. (A) Una trama di flusso rappresentativa del PBMC rhesus il giorno 9 del protocollo di trasduzione ed espansione che dimostra l'espressione sia della CAR CD4-MBL che del CXCR5. (B) Espressione della CAR CD4-MBL e del CXCR5 sul PBMC resus tradusse da 6 animali diversi nei giorni 5 e 9 nella coltura misurata dalla citometria di flusso. I cancelli sono stati fissati in diretta, CD3- cellule. Le cellule trasdotte sono identificate come MBL, CXCR5,. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: La maggior parte delle cellule prodotte nel protocollo di 9 giorni hanno un fenotipo della memoria centrale. Grafici di citometria di flusso rappresentativi di (A) giorno 5 e(B)giorno 9 CAR/CXCR5-transdotta rhesus PBMC. I cancelli sono stati impostati in diretta, CD3,CD8, cellule. La memoria centrale è stata definita come CD28, CD95e. La memoria per l'effetto è stata definita come CD28-, CD95. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo delinea una strategia di produzione di immunoterapia a cellule T che utilizza un vettore gammaretrovirale per trasdurre il macaco rhesus PBMC che conduce alla popolazione di cellule T che esprime una CAR antivirale e il recettore dell'homing follicolare, CXCR5. Con un totale di 8 giorni di tempo di coltura ex vivo, cellule CAR T vitali e funzionali sono prodotte in una quantità che è all'interno dell'intervallo pubblicato10,21,22 utilizzati per l'infusione in primati non umani per test di efficacia preclinica.

Il successo del protocollo di trasduzione si basa sia su PFC sani e stimolati che su preparati di qualità di gammaretrovirus. Al fine di ottenere una stimolazione e una trasduzione efficaci, è essenziale prestare particolare attenzione al congelamento e al trasporto dei PBMCC dopo la raccolta. Idealmente, se le cellule vengono raccolte fuori sede, vengono spedite in azoto liquido e rapidamente collocate nello stoccaggio di azoto liquido a lungo termine. Le PBMC devono essere mitoticamente attive per essere trasdotte con successo da un gammaretrovirus. Si dovrebbe monitorare visivamente per il clustering delle cellule dopo la stimolazione con anti-CD3/anti-CD28. Un mancato attivazione corretta causerà una bassa efficienza di trasduzione. È anche importante monitorare la vitalità nelle cellule stimolate. Scarsa vitalità dopo la fase di stimolazione di solito porta ad una trasduzione meno riuscita. Indipendentemente dal fatto che i preparati per i virus siano prodotti in laboratorio o in outsourcing, devono essere immagazzinati a -80 gradi centigradi in uso singolo per evitare cicli di congelamento del gelo che possono danneggiare il virus e compromettere l'efficienza della trasduzione. Il virus deve essere titered in modo che quantità coerenti di virus possono essere utilizzati in ogni esperimento. Quando si utilizza il virus per la trasduzione, scongelare il virus rapidamente e conservare sul ghiaccio fino a quando necessario. La scelta delle proteine promotore, potenziatore e involucro può influire sull'efficienza della trasduzione e sull'espressione del transgene nelle cellule bersaglio. Pertanto, un MOI deve essere determinato empiricamente. Inoltre, l'uso di un supporto progettato per supportare le cellule T e le piastre con pozzi permeabili al gas per l'espansione hanno portato a un'eccellente espansione delle cellule trasdotte. Tuttavia, c'è variabilità animale-animale nel tasso di espansione cellulare. Si consiglia uno studio di prova per determinare la capacità di una particolare preparazione cellulare da trasdurre ed espandere. I livelli di espansione sono coerenti sia nelle trasduzioni su piccola che in quello su larga scala.

Con l'uso di questo protocollo, abbiamo prodotto fino a 2,5 x 109 cellule per l'infusione in animali da esame. Anche se abbiamo ritenuto inutile aumentare il protocollo in questo momento, l'uso di 6 piastre di pozzo è una limitazione alla preparazione di celle su larga scala e il protocollo richiederebbe una modifica per produrre un maggior numero di cellule. Esempi di potenziali modifiche includono l'esecuzione della trasduzione in un sacchetto di coltura rivestito di fibronectina per aumentare il numero di cellule tradotte e utilizzare un vaso di coltura permeabile per gas più grande per la fase di espansione. Anche se non abbiamo ancora apportato queste modifiche, esse utilizzano prodotti disponibili in commercio e sono modifiche possibili al protocollo attuale.

Utilizzando questo metodo, abbiamo prodotto cellule trasdotte da PBMC isolati da animali non infetti, animali infetti da SIV e da animali infettati da SIV trattati con terapia antiretrovirale (ART). Tuttavia, abbiamo notato una riduzione dell'efficienza di trasduzione nelle cellule trattate con ART20. Questa riduzione è presumibilmente dovuta all'inibizione della trascrizione inversa e/o dell'integrasi da parte dei farmaci. Le trasduzioni di cellule da animali trattati con ART richiederanno modifiche a questo protocollo, come la riduzione dei livelli intracellulari dei farmaci ART, interrompendo ART per diversi giorni prima di raccogliere il PBMC o attraverso l'uso di un vettore alternativo che non è influenzato dai farmaci ART comunemente in uso.

È importante che le cellule prodotte per l'immunoterapia siano di un fenotipo minimamente differenziato in modo che persistano post-infusione12. Anche se molti protocolli per il trasferimento adottivo delle cellule richiedono tempi di coltura lunghi, un tempo di coltura ex vivo ridotto è stato correlato sia con una riduzione della differenziazione che con un miglioramento della funzione delle cellule CAR T13. Il lasso di tempo relativamente rapido di questo protocollo di trasduzione ed espansione consente il mantenimento del fenotipo della memoria centrale desiderato, pur producendo cellule sufficienti per testare il loro potenziale immunoterapeutico20.

L'obiettivo della strategia di produzione per questo prodotto di immunoterapia a cellule T è quello di produrre cellule T che riconosceranno le cellule infettate da SIV, si trasporterà verso il sito di replicazione virale nel follicolo delle cellule B e persisterà nell'animale con conseguente un lungo periodo cura funzionale senza bisogno di farmaci anti-retrovirali. Per la traduzione in un prodotto immunoterapico umano, questo protocollo può essere modificato per trasdurre le cellule T umane attraverso l'uso di anticorpi e citochine specifiche dell'uomo e l'attuazione di standard GMP con l'obiettivo finale di produrre una cura funzionale per Hiv.

Dichiarazioni

La dott.ssa Pamela Skinner è la co-fondatrice e Chief scientific Officer di MarPam Pharma.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH 5R01AI096966-06S1 (PS, CE ed EB), 1UM1AI26617 (PS, EC ed EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH grant 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A14 3380-01 (PS ed EB), 1UM14126617 (PS e EC) nonché fondi forniti dalla Divisione NIAID di Ricerca Intramurale e dal Programma Antivirale mirate NIH Intramurale AIDS. Anti-CD3 e anti-CD28 utilizzati in questi studi è stato fornito dal NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). Il-2 utilizzato in questi studi è stato fornito da The NCI Preclinical Repository. Ringraziamo i nostri collaboratori in questo progetto CD4-MBL CAR/CXCR5, la dott.ssa Elizabeth Connick presso l'Università dell'Arizona, il Dr. Edward A Berger presso NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz presso il Wisconsin National Primate Research Center e la dott.ssa Geoff Hart e la signora Preethi Haran presso l'Università del Minnesota, il dottor Leslie Kean presso la Harvard Medical School e la dott.ssa Catherine Bollard presso il Children's Research Institute. Ringraziamo anche il Dr. Scott McIvore presso l'Università del Minnesota, il Dr. Christopher Peterson al Fred Hutchinson Cancer Center, il Dr. Matthew Trivett al NIH, Dr. Agne Taraseviciute presso il Seattle Children's Hospital, e il Dr. Conrad Russell Cruz presso il Children's Research Institute per la loro assistenza molto utile nell'ottimizzazione di questo protocollo. Ringraziamo anche la signora Chi Phan e la signora Jhomary Alegria-Berrocal dell'Università del Minnesota per la produzione gammaretrovirale, e Kim Weisgrau presso l'Università del Wisconsin-Madison per l'isolamento del macaco rhesus PBMC.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Preparazione di retrovirus gamma
0,025% tripsina, 0,01% EDTAGibcoR-001-100
293T celluleATCCCRL-3216
piastre a 6 pozzetti, trattateCytoOneCC7682-7506
DMEMGibco10569-010
Hyclone FBS inattivato termicamenteSh30088.03
LipofectamineInvitrogen11668019reagente di trasfezione
Opti-MemInvitrogen31985070a siero ridotto
pBS-CMV-gagpolAddgene35614Un regalo del Dr. Patrick Salmon
pMSGV1 contenente CAR P2A CXCR5ordine personalizzato da GenScript
RD114Un regalo del Dr. Ed Berger
Palloni T75CytoOneCC7682-4875
VSV-GpMD.GUn regalo del Dr. Scott McIvor
Stimolazione delle cellule T
6 pozzetti, non trattatiCytoOneCC7672-7506
Anti-CD28NHP ReagenteClone: CD28.2
Anti-macaco CD3NHP Reagente Clone della risorsaFN18
Gibco14190-144
Macaco Rhesus PBMC o cellule T CD8WNPRCCellule primarie
Per rivestimento di fibronectina
6 pozzetti, non trattateCytoOneCC7672-7506
BSA (Frazione V)HyCloneSH 30574.02
RetroNectina (1 mg/ml)TaKaRaT100A
Per cellule T Espansione
G-Rex Piastra a 6 pozzettiWilson WolfP/N 80240MPiastre con pozzetti permeabili ai gas
Media Components
b mercaptoetanoloGibco21985-023
Heat-inactivated FBSHycloneSh30088.03
IL-2NCI Archivio
Penicillina/Streptomicina/GlutamminaGibco10378-016
X-Vivo-15 mediumLonza04-418Q
Variazioni dei terreni utilizzati
Terreno di base: Terreno X-Vivo 15, FBS inattivato termicamente al 10%, 1 x Penicillina/Streptomicina/L-Glutammina
Terreno di dilatazione:Terreno di crescita + 50 mM b mercaptoetanolo
Terreno di crescita:Terreno basico + 50 UI/ml IL-2Il completamento del terreno mediante aggiunta di anti-CD28, IL-2 o b-mercaptoetanolo dovrebbe avvenire il giorno dell'uso.
Conteggio cellulare
Countess Camere di conteggio cellulareInvitrogenAMQAF1000
Countess II FL Contatore di cellule automatizzatoInvitrogenT10282
Trypan blue, soluzione allo 0,4%InvitrogenT10282
Citometria a flusso
Kit di etichettatura degli anticorpi Alexa Fluor 647InvitrogenA20186per la coniugazione dell'anticorpo MBL
anti-CD28-BV605BD Biosciences562976
anti-CD3-AF700BD Biosciences557917
anti-CD4-FITCBD Biosciences556615
anti-CD8-BV788BD Biosciences563824
anti-CD95-PerCP Cy5.5BD Biosciences561655
anti-CXCR5-PEeBioscience12-1985-42
anti-MBLInvitrogenMA1-40145-S6
Software di analisi del flussoFlowJo, LLCCitometro a flusso FlowJo v10
BeckmanCytoFlex
Live/Dead Near IRInvitrogenL10119
Altre apparecchiature
Bombole Aerosolve per contenere le perdite di aerosolBeckmanSX4750Attrezzatura di sicurezza
Beckman Allegra CentrifugaBeckmanSterilgard e3
Incubatore per colture cellulariThermo FisherEverlast 247
Classe II Cappa a flusso laminareBakerHeracell Vios 160i
Camice da laboratorio monouso extra-sicuroFisher Scientific359232Dispositivi di protezione individuale
Portapiastre con coperture biocertificateBeckmanSX4750AAttrezzatura di sicurezza
Piattaforma a dondoloBenchmarkC10228
Rotore a secchio oscillanteGuanti in nitrile BeckmanX13-R
X-GenGeneseeEquipaggiamento per la protezione personale
: Soluzione salina tamponata con fosfato preclinico

Riferimenti

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