Qui, presentiamo un protocollo per indurre ipertensione oculare e neurodegenerazione glaucomatosa negli occhi del topo mediante iniezione intracamerale di olio di silicone e la procedura per la rimozione dell'olio di silicone dalla camera anteriore per restituire una pressione intraoculare elevata a Normale.
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Articolo metodologico
Un modello di ipertensione oculare indotta da olio di silicone reversibile nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elevata pressione intraoculare (IOP) è un fattore di rischio ben documentato per il glaucoma. Qui descriviamo un nuovo metodo efficace per indurre costantemente l'elevazione stabile dell'IOP nei topi che imita la complicazione post-operatoria dell'uso dell'olio di silicone (SO) come agente tamponamento nella chirurgia vitreoretinica umana. In questo protocollo, SO viene iniettato nella camera anteriore dell'occhio del mouse per bloccare la pupilla e prevenire l'afflusso di umorismo acquoso. La camera posteriore accumula umorismo acquoso e questo a sua volta aumenta l'IOP del segmento posteriore. Una singola iniezione di SO produce un'altitudine IOP affidabile, sufficiente e stabile, che induce una significativa neurodegenerazione glaucomatosa. Questo modello è una vera replica del glaucoma secondario nella clinica oculistica. Per imitare ulteriormente l'ambiente clinico, SO può essere rimosso dalla camera anteriore per riaprire il percorso di drenaggio e consentire l'afflusso di umorismo acquoso, che viene drenato attraverso la rete trabecolare (TM) all'angolo della camera anteriore. Poiché IOP torna rapidamente alla normalità, il modello può essere utilizzato per testare l'effetto dell'abbassamento di IOP sulle cellule gangliari della retina glaucomatous. Questo metodo è semplice, non richiede attrezzature speciali o procedure di ripetizione, simula da vicino situazioni cliniche e può essere applicabile a diverse specie animali. Tuttavia, potrebbero essere necessarie modifiche minori.
Introduzione
La progressiva perdita di cellule gangliari retiniche (RGC) e dei loro assoni è il segno distintivo del glaucoma, una malattia neurodegenerativa comune nella retina1. Colpisce più di 100 milioni di individui di età superiore ai 40-80 anni entro il 20402. L'IOP rimane l'unico fattore di rischio modificabile nello sviluppo e nella progressione del glaucoma. Per esplorare la patogenesi, la progressione e i potenziali trattamenti del glaucoma, è imperativo un modello sperimentale affidabile, riproducibile e inducibile di ipertensione/glaucoma sperimentale.
IOP dipende dall'afflusso di umorismo acquoso alla camera anteriore dal corpo ciliario nella camera posteriore e dal deflusso attraverso la mesh trabecolare (TM) all'angolo della camera anteriore. Al raggiungimento di uno stato stabile, IOP viene mantenuto. Quando il flusso in ingresso supera o è inferiore al deflusso, IOP aumenta o scende rispettivamente. Diminuendo il deflusso acquoso sia occludendo l'angolo della camera anteriore o danneggiando la TM, diversi modelli di glaucoma sono stati stabiliti3,4,5,6,7,8,9,10. Questi modelli sono normalmente associati a danni irreversibili ai tessuti oculari, e l'alto IOP nella camera anteriore causa anche complicazioni indesiderate come l'edema corneale e l'infiammazione intraoculare, che rendono difficile eseguire e interpretare l'imaging retinico e i saggi delle funzioni visive.
Per sviluppare un modello che superi queste carenze, ci siamo concentrati sul glaucoma secondario ben dichiarato causato dall'olio di silicone (SO) che si verifica come una complicanza postoperatoria della chirurgia vitreoretinica umana11,12. SO è usato come tamponadio in interventi chirurgici alla retina a causa della sua alta tensione superficiale. Tuttavia, SO può fisicamente occludere la pupilla perché è più leggera dei fluidi acquosi e vitrei, che impedisce il flusso acquoso nella camera anteriore. L'ostruzione causa l'elevazione di IOP nella camera posteriore a causa dell'accumulo di umorismo acquoso. Questo ci ha motivati a sviluppare e caratterizzare un nuovo modello di topo di ipertensione oculare basato su iniezione intracamerale SO e blocco pupillare13, con caratteristiche chiave del glaucoma secondario: blocco pupillare efficace, significativa elevazione IOP che può tornare alla normalità dopo la rimozione di SO, e neurodegenerazione glaucomatous.
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'ipertensione oculare indotta da SO nell'occhio del topo, tra cui l'iniezione e la rimozione di SO e la misurazione IOP.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.
1. Induzione dell'ipertensione oculare mediante iniezione intracamerale di SO
- Preparare una micropipetta di vetro per l'iniezione intracamerale SO tirando un capillare di vetro con un tiratore pipetta per generare una micropipetta. Tagliare un'apertura sulla punta della micropipetta e affilare ulteriormente la punta con una macchina a sferzatura microgrinder per fare una sferzata di 35-40 gradi.
- Polacco i bordi della svegliata e rimuovere tutti i detriti lavando con acqua. Autoclave la micropipetta prima dell'uso.
- Preparare l'ago della paracentesi per l'ingresso corneale. Per farlo, attaccare un ago da 32 G a una siringa da 5 mL su una serratura Luer e fissarlo ulteriormente con del nastro adesivo. Piegare la punta di smusso dell'ago a faccia in su a 30 gradi.
- Preparare l'iniettore SO attaccando e fissando un ago di estremità smussata 18 G su una siringa da 10 mL prima. Quindi collegare un tubo di plastica con l'ago 18 G su un'estremità e riempire con SO come necessario attraverso l'altra estremità.
- Attaccare la micropipetta sterilizzata al tubo di plastica e spingere lo stantuffo di siringa per riempire l'intera micropipetta con SO.
2. Iniezione SO intracamerale per un occhio
- Mettete un topo maschio C57B6/J di 9-10 settimane in una camera di induzione con il 3% di isoflurane mescolato con ossigeno a 2 L/min per 3 min.
- Intraperitonealmente iniettare 2,2,2-tribromoetanolo a 0,3 mg/g peso corporeo.
NOTA: A differenza della chetamina/xylazina, 2,2,2 tribromoetanolo non causa dilatazione della pupilla evidente. - Controllare la mancanza di risposta a un pizzico di punta e la mancanza di movimento dei baffi o della coda per determinare la forza anestetica.
- Posizionare il mouse in posizione laterale su una piattaforma chirurgica. Per ridurre la sua sensibilità durante la procedura, applicare una goccia di 0,5% di cloruro proparacaina alla cornea prima dell'iniezione.
- Fare un'incisione di ingresso con l'ago di paracentesi 32 G al quadrante superotemporale, a circa 0,5 mm dal limbo.
- Tunnel attraverso gli strati della cornea per circa 0,3 mm prima di piercing nella camera anteriore. Fare attenzione a non toccare l'obiettivo o l'iride.
- Ritirare lentamente l'ago per liberare un umore acquoso (circa 1/2 -L) dalla camera anteriore attraverso il tunnel (paracentesi).
- Attendere 8 min per diminuire ulteriormente l'IOP. Questo può essere determinato misurando l'occhio di controllo contraplaterale.
- Inserire la micropipetta di vetro precaricata con SO attraverso il tunnel corneale nella camera anteriore, con la svella rivolta verso la superficie dell'iride.
- Spingere lentamente lo stantuffo della siringa per iniettare SO nella camera anteriore fino a quando la goccia SO copre la maggior parte della superficie dell'iride, con un diametro di 2,2,4 mm.
- Lasciare la micropipetta nella camera anteriore per altri 10 s prima di ritirarla lentamente.
- Spingere delicatamente la palpebra superiore per chiudere l'incisione della cornea per ridurre al minimo la perdita di SO.
- Applicare unguento antibiotico (bacitracina-neomicina-polimyxin) sulla superficie dell'occhio.
- Durante la procedura, spesso inumidire la cornea con lacrime artificiali.
- Tenere il mouse sulla piastra di riscaldamento fino a quando completamente recuperato dall'anestesia.
3. Rimozione SO
- Preparare il sistema di irrigazione.
- Preparare la soluzione di irrigazione secondo le istruzioni del produttore e inserirla nella bottiglia di irrigazione. Eleva la bottiglia della soluzione di irrigazione a 110-120 cm (81-88 mmHg) sopra la piattaforma di chirurgia.
- Attaccare un set di somministrazione IV alla bottiglia della soluzione di irrigazione. Rimuovere le bolle d'aria dal tubo IV. Collegare un ago da 33 G piegato a 20 gradi faccia a faccia in su fino al tubo IV.
- Per preparare il sistema di drenaggio, rimuovere lo stantuffo da una siringa da 1 mL. Fissare un ago da 33 G alla siringa e piegare l'ago a 20 gradi.
- Rimuovere SO dalla camera anteriore.
- Intraperitonealmente iniettare 2,2,2-tribromoetanolo (0,3 mg/g di peso corporeo). Controllare la mancanza di risposta al pizzico della punta per determinare la forza anestetica e la mancanza di movimento dei baffi o della coda.
- Posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica e fissarlo in posizione laterale con nastro adesivo. Applicare una goccia di 0,5% di cloruro proparacaina alla cornea per ridurne la sensibilità.
- Fare due incisioni nel quadrante temporale della cornea tra i 2 e le 5 dollari sul bordo della gocciolina SO utilizzando l'ago prefatto da 32 G paracentesi.
- Inserire un ago di irrigazione da 33 G collegato alla soluzione di irrigazione attraverso un'incisione corneale, velocità massima.
- Inserire un altro ago di drenaggio da 33 G attaccato alla siringa senza uno stantuffo attraverso l'altra incisione corneale per consentire alla goccia SO di uscire dalla camera anteriore durante l'irrigazione con soluzione di irrigazione.
- Ritirare l'ago di drenaggio, quindi l'ago di irrigazione.
- Iniettare una bolla d'aria nella camera anteriore per mantenere la profondità normale e premere per chiudere l'incisione corneale.
- Applicare unguento antibiotico su entrambi gli occhi.
- Tenere il mouse sul pad di recupero di riscaldamento fino a quando completamente recuperato dall'anestesia.
4. Misurazione IOP una volta alla settimana
- Posizionare il topo in una camera di induzione perfusa con 3% isoflurane mescolato con ossigeno a 2L/min per 3 min.
- Intraperitonealmente iniettare xillazina e ketamina (0,01 mg di xilolazina/g, 0,08 mg di ketamina/g).
- Mantenere la cornea umida applicando lacrime artificiali per tutta la procedura.
- Attendere circa 15 min per consentire alla pupilla di dilatarsi completamente.
- Misurare l'IOP di entrambi gli occhi utilizzando un tonometro secondo le istruzioni del prodotto. Portare il tonometro vicino all'occhio del mouse. Mantenere la distanza dalla punta della sonda alla cornea del topo a circa 3,4 mm. Premere il pulsante di misurazione 6x per generare una lettura. Da ogni occhio si ottengono tre letture generate dalla macchina per acquisire l'IOP medio.
- Sacrificare gli animali a 8 settimane dopo l'iniezione di SO ed eseguire l'immunosofia della retina a montaggio intero, il conteggio RGC, le sezioni semi-sottili nervo ottico (ON) e la quantificazione degli assoni sopravvissuti, che sono stati descritti prima delle13.
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Risultati
Subito dopo l'iniezione possiamo facilmente identificare i topi che non producono ipertensione oculare stabile a causa delle goccioline SO troppo piccole (1,5 mm)13. Questi animali sono esclusi dai successivi esperimenti. Dopo le procedure di iniezione, più dell'80% dei topi so iniettati finisce con goccioline più grandi di 1,6 mm. Abbiamo misurato l'IOP di questi occhi del topo una volta alla settimana per 8 settimane dopo una singola iniezione SO. L'IOP dell'occhio che riceve SO è rimasto alto, ...
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Discussione
Qui dimostriamo una procedura semplice ma efficace per indurre l'elevazione prolungata di IOP nell'occhio del mouse mediante iniezione intracamerale di SO. Questa procedura può essere appresa rapidamente da chiunque abbia esperienza nella microdissezione al microscopio. Il rischio potenziale primario di fallimento è la perdita di SO dall'incisione corneale. Tuttavia, uno dei vantaggi dell'utilizzo di SO è che, poiché la goccia d'olio è visibile e misurabile, possiamo facilmente identificare i topi che hanno ricevuto gocc...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni NIH EY024932, EY023295 ed EY028106 a YH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5% proparacaina cloridrato | Akorn, Somerset | ||
| 10mL siinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G ago | BD | con smusso regolare, Lunghezza ago: 25,4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoetanolo (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| Ago per ofalmologia 33G | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| Siinge da 5 ml | BD | Luer-Lok | |
| Tip AnaSed Injection (xilazina) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| lacrime artificiali | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Soluzione irrigua | Alcon Laboratories | ||
| Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Sistema classico | Sistema EZ Sistema | ||
| Isoflurano | VetOne | 502017 | isoflurano, USP, 250 ml/flacone |
| IV Set di somministrazione | EXELint / Fisher | 29081 | |
| KETAMINA CLORIDRATO INIEZIONE | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| macchina per smussatura a micromacinazione | NARISHIGE | EG-401 | |
| Tubo EVA in miniatura | McMaster-Carr | 1883T4 | 0,05" ID, 0,09" OD, 10 piedi di lunghezza |
| olio siliconico (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1.000 mPa.s |
| Capillari in vetro standard | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| Tonometro TonoLab | Colonial Medical Supply, Finlandia | ||
| unguento antibiotico veterinario | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP unguento oftalmico, Vetropolycin |
Riferimenti
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