Espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR

Sommario

Qui, presentiamo un flusso di lavoro per l'espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR in lievito.

Abstract

Le proteine SNX-BAR sono una classe evolutivamente conservata di proteine di rimodellamento della membrana che svolgono un ruolo chiave nella selezione e nel traffico di proteine e lipidi durante l'endocitosi, lo smistamento all'interno del sistema endosomico e l'autofagia. Fondamentale per la funzione della proteina SNX-BAR è la capacità di formare omodimeri o eterodimeri che legano le membrane utilizzando domini di fox-homologia (PX) e BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Inoltre, l'oligomerizzazione dei dimeri SNX-BAR sulle membrane può suscitare la formazione di tubuli e vesciche di membrana e questa attività è pensata per riflettere le loro funzioni come proteine del mantello per i portatori di trasporto derivati dall'endosoma. I ricercatori hanno a lungo utilizzato studi di legame in vitro utilizzando proteine SNX-BAR ricombinanti su liposomi sintetici o vescicle unilamellar giganti (GUT) per rivelare la marcatura precisa dei lipidi necessari per guidare il rimodellamento della membrana, rivelando così il loro meccanismo di azione. Tuttavia, a causa di sfide tecniche con sistemi a doppia espressione, tossicità dell'espressione proteica SNX-BAR nei batteri e scarsa solubilità delle singole proteine SNX-BAR, la maggior parte degli studi finora hanno esaminato gli omodimeri SNX-BAR, compresi i dimeri non fisiologici che si formano durante l'espressione nei batteri. Recentemente, abbiamo ottimizzato un protocollo per superare le principali carenze di un tipico sistema di espressione batterica. Utilizzando questo flusso di lavoro, dimostriamo come esprimere e purificare con successo grandi quantità di eterodimeri SNX-BAR e come ricostituirli su liposomi sintetici per i saggi di rilegatura e tubazione.

Introduzione

Gli organelli legati a membrane come la membrana plasmatica, il reticolo endoplasmico, l'apparato Golgi, il lisosoma (vacuolo di lievito) e l'endosoma costituiscono il sistema endomembrano della cellula eucabolica. La maggior parte degli organelli ha la capacità di comunicare e scambiare materiale con altri organelli attraverso vettori di trasporto vescicolo. Il modo in cui la cellula coordina l'imballaggio e la formazione di vettori di trasporto vescicolo all'interno del sistema endomembrana non è ben compreso. Tuttavia, le proteine e i lipidi che costituiscono gran parte del sistema dell'endomembrana sono noti per provenire dall'interiorizzazione delle vesciche endo....

Protocollo

1. Costruzione del ceppo di lievito

1. Iniziare con TVY614 (pep4:::LEU2 prb1::hisG prc1 :::HIS3)¹¹ come ceppo padre. Questo ceppo è carente per le proteasi vacuolare, che contribuiscono alla maggior parte della degradazione delle proteine dopo la lisi cellulare, e quindi consente una purificazione più pulita ed efficiente.
2. Progetta primer¹² e integra il tag TAP (TL) di affinità tandem al C-terminus di Atg20 (SNX-BAR ORF 1) utilizzando la ricombinazione omologa. Utilizzare la reazione a catena della polimerasi (PCR) per confermare le integrazioni (Figura 2

Risultati

Questo protocollo descrive un metodo per la produzione riproducibile e robusta di complessi SNX-BAR di lievito endogeno che possono essere utilizzati per i saggi di rimodellamento della membrana a valle (Figura 1). La costruzione del ceppo di lievito utilizzato per la purificazione sfrutta l'efficienza della ricombinazione omologa nel lievito in erba, consentendo modifiche ai loci genomici della SNX-BAR mirata (Figura 2). Questo .......

Discussione

Qui, dimostriamo un flusso di lavoro ottimizzato per purificare i dimeri SNX-BAR nel lievito e due saggi per valutare le loro proprietà biofisiche sui liposomi sintetici. Il vantaggio principale rispetto alla tipica espressione proteica ricombinante in Escherichia coli o in altri sistemi è la capacità di esprimere uniformemente le proteine SNX-BAR in un host nativo, evitando così i problemi di tossicità e insolubilità riscontrati nella purificazione delle SNX-BAR in altri sistemi. È anche da notare che il nostro.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,2 μ m Membrane PC	Avanti	610006
Colonna per cromatografia Poly-Prep da 10 mL (Bio-Rad)	Bio-Rad	731-1550
Ago da 27 G	BD Biosciences	301629
Filtro ultra centrifugo Amicon con cutoff 10K	Amicon	UFC501024
Omogeneizzatore Avestin EmulsiFlex-C3 Saggio
	Pierce	23225
Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuga	Beckman Coulter	393315
Inibitore completo della proteasi Cocktail	Roche	4693116001
DOPC	Avanti	850375
DOPS	Avanti	840035
Ergosterolo (Sigma)	Sigma	47130-U
Set di estrusori con Blocco 0.2 μ L/1 mL	Avanti	610000
FEI Tecnai F20 microscopio elettronico a trasmissione (200 kV)
Provette per coltura in vetro	VWR	47729-570
IgG sepharose beads (GE Healthcare)	GE Healthcare	17-0969-01
Microltro siringhe in vetro	Hamilton	7637-01
New Brunswick Excella E25	Eppendorf	M1353-0000	o agitazione equivalente di 30 gradi C
Perle magnetiche di agarosio Ni-NTA	Pierce	78605
Optima XE-90 Ultracentrifuga	Beckman Coulter	A94516
Parafilm M	VWR	52858-076
PI3P	Echelon	P-3016	o Echelon equivalente
Assemblaggio bottiglia in policarbonato	Beckman Coulter	355622
TLA-100 ad angolo fisso Rotore	Beckman Coulter	343840
Tipo 45 Ti Rotore	Beckman Coulter
Essiccatore a vuoto, fondo e coperchio con valvola a bussola VWR		75871-436
Pompa a vuoto Alcatel (Pascal 2005 C1)	A& J Vacuum	PN07050
Vortex con supporto schiuma	VWR	10153-838
VWR KIT MICROTUBO	VWR	12620-880

BCA Avestin EF-C3