Espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR

Summary

Qui, presentiamo un flusso di lavoro per l'espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR in lievito.

Abstract

Le proteine SNX-BAR sono una classe evolutivamente conservata di proteine di rimodellamento della membrana che svolgono un ruolo chiave nella selezione e nel traffico di proteine e lipidi durante l'endocitosi, lo smistamento all'interno del sistema endosomico e l'autofagia. Fondamentale per la funzione della proteina SNX-BAR è la capacità di formare omodimeri o eterodimeri che legano le membrane utilizzando domini di fox-homologia (PX) e BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Inoltre, l'oligomerizzazione dei dimeri SNX-BAR sulle membrane può suscitare la formazione di tubuli e vesciche di membrana e questa attività è pensata per riflettere le loro funzioni come proteine del mantello per i portatori di trasporto derivati dall'endosoma. I ricercatori hanno a lungo utilizzato studi di legame in vitro utilizzando proteine SNX-BAR ricombinanti su liposomi sintetici o vescicle unilamellar giganti (GUT) per rivelare la marcatura precisa dei lipidi necessari per guidare il rimodellamento della membrana, rivelando così il loro meccanismo di azione. Tuttavia, a causa di sfide tecniche con sistemi a doppia espressione, tossicità dell'espressione proteica SNX-BAR nei batteri e scarsa solubilità delle singole proteine SNX-BAR, la maggior parte degli studi finora hanno esaminato gli omodimeri SNX-BAR, compresi i dimeri non fisiologici che si formano durante l'espressione nei batteri. Recentemente, abbiamo ottimizzato un protocollo per superare le principali carenze di un tipico sistema di espressione batterica. Utilizzando questo flusso di lavoro, dimostriamo come esprimere e purificare con successo grandi quantità di eterodimeri SNX-BAR e come ricostituirli su liposomi sintetici per i saggi di rilegatura e tubazione.

Introduction

Gli organelli legati a membrane come la membrana plasmatica, il reticolo endoplasmico, l'apparato Golgi, il lisosoma (vacuolo di lievito) e l'endosoma costituiscono il sistema endomembrano della cellula eucabolica. La maggior parte degli organelli ha la capacità di comunicare e scambiare materiale con altri organelli attraverso vettori di trasporto vescicolo. Il modo in cui la cellula coordina l'imballaggio e la formazione di vettori di trasporto vescicolo all'interno del sistema endomembrana non è ben compreso. Tuttavia, le proteine e i lipidi che costituiscono gran parte del sistema dell'endomembrana sono noti per provenire dall'interiorizzazione delle vesciche endocitiche dalla membrana plasmatica (PM). L'endosoma è l'organello accettatore primario per queste vescicle ed è composto da più set interconnessi di organelli tubolari. La funzione principale dell'endosoma è quella di facilitare l'acquisizione di nutrienti, regolare il turnover di proteine e lipidi, proteggere dall'infezione patogena e fungere da fonte primaria di rifornimento di lipidi per la membrana plasmatica. Poiché l'endosoma riceve la maggior parte delle proteine del carico e dei lipidi dalla membrana plasmatica, agisce come un compartimento di smistamento isolando i carichi in vettori di trasporto endosomici tubolari (ETC). Tutte le proteine non sequestrate negli ETC vengono lasciate degradare attraverso il sistema endososomico. La disregolazione dello smistamento del carico negli ETC può portare alla perdita di assorbimento di nutrienti, turnover proteico o omeostasi lipidica, con conseguente numerosa disturbi metabolici, di sviluppo e neurologici^1,2. Tuttavia, nonostante gli ETC ruolo centrale presso l'endosoma, il meccanismo sottostante di come l'endosoma può coordinare selettivamente l'imballaggio di una moltitudine di carichi eterogenei in vettori tubolari non è noto.

La famiglia di nexin a cinta (SNX) è una classe evolutivamente conservata di proteine che sono state trovate critiche per molte reazioni di trasporto vescicle nella cella^3,4,5. Le nexine di smistamento vengono reclutate nella membrana endosomicosa e aiutano nella cattura del carico attraverso il loro caratteristico dominio di omologia fox (PX), che lega fosfatoylinostolo-3-monofosfato (PtdIns(3)P), un lipido arricchito sulla membrana endosoma. I mammiferi codificano trentatré proteine SNX, che possono essere ulteriormente suddivise in più sottofamiglie, in base alla presenza di altri domini¹. In particolare, la sottofamiglia SNX-BAR è la più grande sottofamiglia composta da dodici in umani, mentre in lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, la sottofamiglia è ridotta a soli sette SNX-BAR. Le proteine SNX-BAR hanno sia un dominio PX che un dominio Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) che attiva serbatoi lipidici per legare membrane di curvatura positive. Di conseguenza, la famiglia SNX-BAR ha una naturale affinità per l'endosoma e può mediare la formazione etc attraverso le loro capacità di rimodellamento della membrana. In vitro, le proprietà di rimodellamento delle SNX-BAR possono essere indotte dall'aggiunta di SNX-BAR purificati ai liposomi sintetici e la successiva formazione di tubuli stretti e rivestiti può essere visualizzata mediante microscopia elettronica. Utilizzando questi metodi, i ricercatori hanno determinato che sia la concentrazione di oligomerizzazione che la forza di costrizione sembrano variare tra la famiglia SNX-BAR suggerendo che potrebbero aiutare sia nella formazione che nella scissione degli ETC.

Gli SNX-BAR possono essere ulteriormente classificati in base alle loro esclusive proprietà di dimerizzazione. I saggi e gli studi strutturali che legano in vitro che le proteine SNX-BAR possono formare solo omodimeri o eterodimeri specifici. Pertanto, in linea di principio, ogni potenziale dimero-oligomero SNX-BAR potrebbe fornire un rivestimento tubulo per un percorso di traffico specifico del carico e, allo stesso modo, l'oligomerizzazione limitata degli altri protomeri SNX-BAR, può anche definire percorsi di esportazione distinti. Tuttavia, a causa del gran numero di SNX-BAR e della diversità all'interno della famiglia SNX, una specifica che smista l'ipotesi del carico nexin-one è altamente improbabile. Invece uno sforzo coordinato utilizzando una moltitudine di fattori come SNX-BAR, carico, specificità lipidica e altre dipendenze è più probabile. Allo stesso modo, recenti studi della famiglia lievito SNX4 hanno rivelato prove di ulteriore specificità dei lipidi, oltre PtdIns(3)P, per potenziare i vettori di trasporto endosomi⁶. In questo studio, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 è stato purificato da batteri e eterodimeri nativi Snx4-Atg20 e Vps5-Vps17 sono stati espressi e purificati in alta resa da lievito, mentre solo Snx4-Atg20 è stato trovato per legare preferibilmente phosphatidylserine (PS) e formare stretta-tubo come le strutture di legame^6. Mentre altri nel campo hanno rivelato importanti proprietà delle SNX-BAR utilizzando omodimeri SNX-BAR ricombinanti purificati dai batteri, la tossicità associata all'espressione di eterodimeri SNX-BAR in sistemi simili hanno ostacolato la loro caratterizzazione nativa^7,8,9,10. Pertanto, senza un sistema affidabile per ottenere eterodimeri nativi puramente espressi in modo ricombinante, i ricercatori devono rinunciare a queste linee di indagine. Nella Figura 1, presentiamo un flusso di lavoro in quattro parti a 1) costruire un ceppo di lievito sovraesprimendo eterodimeri SNX-BAR per la purificazione dell'affinità tandem, 2) esprimere e purificare gli eterodimeri nativi SNX-BAR, 3) preparare liposomi sintetici unilamellar, e 4) impostare un sussidio di tubulazione o sedimentazioni liposomiche, fornendo uno strumento vitale per i ricercatori per studiare il crescente catalogo di retissine di smistamento presenti in natura.

Protocol

1. Costruzione del ceppo di lievito

1. Iniziare con TVY614 (pep4:::LEU2 prb1::hisG prc1 :::HIS3)¹¹ come ceppo padre. Questo ceppo è carente per le proteasi vacuolare, che contribuiscono alla maggior parte della degradazione delle proteine dopo la lisi cellulare, e quindi consente una purificazione più pulita ed efficiente.
2. Progetta primer¹² e integra il tag TAP (TL) di affinità tandem al C-terminus di Atg20 (SNX-BAR ORF 1) utilizzando la ricombinazione omologa. Utilizzare la reazione a catena della polimerasi (PCR) per confermare le integrazioni (Figura 2).
3. Eseguire una macchia occidentale di lisa tollei cella sul tag TAP per confermare la corretta integrazione¹³.
   NOT: Per la verifica delle macchie occidentali e SDS, si consiglia di raccogliere 3 OD (1 OD x 1 x 10⁷ celle) di celle. Si noti che l'integrazione del tag TAP deve avvenire prima di sostituire i promotori endogeni con il promotore GAL1 per consentire una più facile verifica del tag TAP tramite una macchia occidentale.
4. Sostituire i promotori endogeni Snx4 (SNX-BAR ORF1) e Atg20 (SNX-BAR ORF 2) con promotori GAL1 senza tag utilizzando passaggi sequenziali di ricombinazione omologa e trasformazione di ogni singolo ORF¹⁴.
5. Utilizzare i numeri di rete flanking al di fuori dei siti di integrazione per PCR per confermare le integrazioni riuscite (Figura 2). Ciò si tradurrà in un fenotipo nullo delle SNX-FORR mirate in assenza di galactosi nel mezzo di crescita.

2. Induzione del lievito e purificazione del dimero SNX-BAR

NOT: Le cellule di lievito possono essere propagate su piastre di agar YPD standard (estratto di lievito, peptone e 2% di glucosio) poiché le modifiche sono cromosomiche integrate.

1. Inoculare un grande tampone di cellule in 50 mL di YP standard (estratto di lievito e peptone) medio con 2% raffinose e 0,1% glucosio come fonte di carbonio in un flacone almeno 4x il volume della coltura e crescere durante la notte in 30 sshaker c per consentire una corretta aerazione. Aspettatevi che la crescita in questo mezzo sarà più lenta rispetto allo YPD standard.
2. La mattina successiva, utilizzare la precultura di 50 mL per inoculare in 1 L del mezzo standard YP con 2% raffinose e 0.1% glucosio e crescere per 4-5 h in 30 sshaker.
   NOT: Il volume della precultura utilizzato per inoculare 1 coltura L può essere regolato a seconda dell'OD₆₀₀ della precultura. L'OD₆₀₀ della coltura 1 L dopo l'inoculazione dovrebbe essere di circa 0,2 per consentire almeno due raddoppi durante la crescita di 4-5 h.
   1. Utilizzare una fiaschetta Fernbach sconcertata per la crescita per consentire una corretta aerazione, un pallone di volume da 2,8 L è sufficiente. Una minore aerazione può provocare una crescita più lenta e un pellet cellulare più piccolo al momento della raccolta.
3. Controllare OD₆₀₀ per assicurarsi che le impostazioni cultura siano nella fase di log (0,5-1) dopo 4-5 h di crescita. A seconda della crescita della deformazione, apportare modifiche al tempo di crescita per consentire almeno due raddoppi. Aggiungete al 2% di galactose e cresconate durante la notte in agitatore a 30 gradi centigradi.
   NOT: L'OD₆₀₀ dopo la crescita overnight può variare, ma la coltura dovrebbe essere satura. Si noti che le cellule non hanno bisogno di essere rimossi da 0.1% glucosio prima di aggiunta di 2% galactose per questo protocollo di crescita. Si consiglia di raccogliere 3 OD di cellule non indotte e indotte in questo passaggio per SDS-PAGE e western blot per la verifica(Figura 3A, B, Corsia 1-2).
4. Raccogliere cellule per centrifugazione a 4500 x g per 15 min. Qui può essere utilizzato un rotore a benna oscillante che ospita la coltura del volume 1 L.
5. Trasferire il pellet di lievito in un tubo conico da 50 mL; un secondo passo di centrifugazione può essere eseguito in base alle esigenze. Il pellet cellulare sarà generalmente di circa 10-15 mL di volume come misurato dalla marcatura di graduazione e può essere utilizzato immediatamente o immagazzinato a -80 gradi centigradi.
   1. Resuspend pellet in buffer di purificazione da 15 mL (50 mM MM PH 7.4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT), cocktail inibitore della proteasi) per fare il volume finale intorno ai 30 mL.
6. Raffreddare un omogeneizzatore di 4 gradi centigradi prima dell'uso e abtenerlo con tampone di purificazione. Le cellule di Lyse utilizzando un disgregatore a cellule meccaniche o omogeneizzatore. Caricare il campione nell'omogeneizzatore e la liscite a 20.000-25.000 psi per 2-3 giri; Si noti che man mano che le cellule vengono lizzate, è necessaria una maggiore pressione di input per mantenere 20.000-25.000 psi. Raccogliere il lisato cellulare in un tubo conico da 50 mL sul ghiaccio.
   NOT: Se è necessario eseguire l'unlza mento, l'omogeneizzatore deve essere accuratamente pulito ed equilibrato prima di caricare il campione successivo. Tenere tutti i lismi cellulari sul ghiaccio.
7. Cancellare immediatamente il lisato cellulare a 35.000 x g per 1 h a 4 gradi centigradi. Trasferire con attenzione il supernatante in un nuovo tubo. Si noti che i lipidi dalla lisi cellulare galleggiano verso l'alto durante la centrifugazione e non influenzeranno la purificazione.
   NOT: Si consiglia di risparmiare lo 0,5-1% del lisate e del pellet per i campioni SDS-PAGE. In genere, non si osservano differenze importanti e si può fare una macchia occidentale aggiuntiva per confermare la solubilità della proteina TAP (Figura 4, Corsie 1 e 2, rispettivamente).
8. Equilibrate 300 -L di Perline sepharose IgG con tampone di purificazione. Aggiungere alla cella cancellata lisata e incubare per 2 h, ruotando a 4 gradi centigradi.
9. Raccogliere perline in una colonna di cromatografia da 10 mL e consentire il flusso di lisa non vincolata.
10. Lavare perline utilizzando 10 mL di buffer di lavaggio (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT), aggiungendo 1 mL alla volta e permettendogli di fluire completamente.
    NOT: Si consiglia di risparmiare il 2% delle perline IgG rilegate per il campione SDS-PAGE. Tipicamente, osserviamo quattro bande principali; due proteine SNX-BAR e IgG Heavy e Light Chains(Figura 4, Corsia 3). Consigliamo di risparmiare quantità equivalenti di perline "eluate" e "IgG dopo TEV" per confrontarle con l'efficienza della scissione TEV.
11. Raccogliere le perline e trasferirle in un tubo di microcentrifuga. Aggiungete fino a 500 l di volume totale con tampone di lavaggio fresco e 2 10 mg/mL di proteasi TEV da 10 mg/mL e incubate durante la notte, ruotando a 4 gradi centigradi.
12. La mattina successiva, rimuovere completamente il supernatante utilizzando un ago da 27 G e valutare la purezza delle proteine del 10% poliacrilammide SDS-PAGE (Figura 4, Corsia 4).
    NOT: In genere si ottengono 500 L di 0,5-1 mg/mL del 95% di eterodimero puro(Figura 4, Corsia 4). Ulteriore purificazione utilizzando resina calmodulin può anche essere fatto, tuttavia in genere vediamo una significativa riduzione della resa e consigliamo di fermarsi qui se la purezza è >90%. TEV non interferisce con i saggi di legame liposoma, anche se TEV può essere rimosso ulteriormente utilizzando Ni-NTA agarose perline¹⁵.
13. Per concentrarsi, trasferire il campione a un filtro centrifugo da 0,5 mL con 10 cutoff kDa e centrifuga secondo le istruzioni del produttore a 50 o meno l. Quantificare le proteine concentrate utilizzando l'analizzatore di proteine Bradford. Conservare a 4 gradi centigradi e utilizzare entro una settimana.

3. Preparazione del liposoma

1. Acquistare lipidi disponibili in commercio: fosfhatidylserine (PS), PI3P, ergosterolo e fosfatidicicolina (PC). Se necessario, risospendere nel solvente consigliato per fare lipidi di riserva.
   NOT: I lipidi vengono risospesi in una miscela di metanolo/cloroformio per le raccomandazioni del produttore. Assicurarsi che le scorte di lipidi siano chiare e riscaldate a temperatura ambiente prima dell'uso. I lipidi risospesi possono essere conservati sotto gas argon e sigillati con pellicola di cera (o equivalente) a -20 gradi centigradi per 6-12 mesi o fino a quando non si osserva la perdita di attività.
2. Calcolare il volume richiesto di ogni brodo lipidico per creare una miscela con la composizione lipidistica desiderata (vedere la tabella 1). Assumere un totale di 1 talpa di lipidi nella miscela di lipidi.
3. Eseguire questo passaggio in una cappa di fumi chimici. Pulire le siringhe di vetro elaborando un volume di siringhe completo di cloroformio e scartandolo in un contenitore di rifiuti. Ripetere altre due volte. Quando si trasferisce il cloroformio, utilizzare solo siringhe di vetro o pipette. Quando si rediga il cloroformio, tirare lentamente il tappo per evitare l'introduzione di bolle di gas nella siringa.
4. Utilizzare siringhe di vetro per trasferire i lipidi di riserva calcolati in un tubo di coltura del vetro pulito per creare una miscela di lipidi finale dell'1% PI3P, del 20% di ergosterolo, del 30% PS, del PC (Tabella 1). A seconda dei solventi in cui ogni lipido viene risospeso, la miscela può diventare torbida dopo l'aggiunta di ogni lipido.
   NOT: Per variare le concentrazioni di PS (0-30%), regolare i volumi di conseguenza e compensare con PC variabile (Tabella 1).
5. Asciugare accuratamente la miscela lipidiconica utilizzando gas di azoto diretto alla miscela lipidida in un movimento circolare per asciugare uniformemente i lipidi. Utilizzare un basso flusso di gas per mantenere i lipidi nella parte inferiore del tubo di vetro durante il processo di essiccazione. Avvolgere il tubo di coltura del vetro con un foglio, lasciando scoperta l'apertura, e disidratare ulteriormente nel vuoto per 1 h.
6. Aggiungere 400 l di buffer di legame (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl₂) per disidratare completamente i lipidi per fare una concentrazione liposografica finale di 2,5 mM.
   NOT: La concentrazione liposomafinale finale può essere regolata aggiungendo più o meno buffer di legame. Ad esempio, è possibile aggiungere 200 buffer di rilegatura ll per produrre una concentrazione lipososo di 5 mM, se necessario (vedere di seguito).
   1. Risospendere i lipidi agitando la velocità media su un vortice a temperatura ambiente per 30 minuti.
7. Trasferire i liposomi sospesi in un tubo di microcentrifuga. Da questo punto in poi, le punte di pipetta di plastica possono essere utilizzate poiché i lipidi non vengono più sospesi nel cloroformio. Si noti che la soluzione lipososo dovrebbe apparire nuvoloso.
8. Congelare i liposomi da sette a otto volte immergendo il tubo di microcentrifuga prima in azoto liquido, poi in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. La miscela lipososo dovrebbe apparire completamente congelato e solido ad occhio prima dello scongelamento.
9. Eseguire passi che coinvolgono il cloroformio in una cappa di fumi chimici. Pulire due siringhe di vetro da 1 mL redimando e scartando tutti i volumi di siringhe di cloroformio, tre volte ciascuna, per rimuovere eventuali lipidi residui. Ogni siringa di vetro con acqua ultrapura con l'elaborazione di due volumi di siringa, poi eclita con tampone di rilegatura elaborando due volumi di siringa.
10. Assemblare il mini-estrusore secondo le raccomandazioni del produttore. Un Equilibrate da 200 nm e due pezzi di supporti filtranti (vedi Tabella dei materiali)unendoli in un buffer di rilegatura.
11. Sandwich la membrana tra i supporti del filtro e posto nel mini-estrusore. Per ridurre il volume morto nel mini-estrusore assemblato e per assicurarsi che l'assemblaggio sia a tenuta d'aria, passare un volume di tampone di legame paragonabile al volume della miscela lipososo
12. Utilizzare una delle siringhe di vetro da 1 mL e redigere la miscela lipososo. Invertire il tubo di microcentrifuga per raccogliere l'ultima miscela lipososo societa' nel tappo del tubo per l'attingmento nella siringa di vetro.
13. Estrusioni liposomi passando attraverso la membrana di 200 nm 19-21 volte. Raccogliere liposomi estruso in un nuovo tubo di microcentrifuga.
    NOT: I liposomi estrusi dovrebbero apparire meno torbidi dei liposomi prima dell'estrusione. I liposomi devono essere usati lo stesso giorno e conservati sul ghiaccio. L'ultima estrusione dovrebbe mettere i liposomi nella siringa di fronte a quella in cui è iniziata.

4. Rilegatura e tubazione Liposoma SNX-BAR

1. Proteina purificata preclear a 100.000 x g in un'ultracentrifuga per 20 minuti a 4 gradi centigradi prima di condurre esperimenti di legame e sedimentazione liposomici. Rimuovere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifuga; non disturbare il pellet se ce n'è uno.
2. Per eseguire saggi di legame e tubazione liposoma, incubare 4 spurdati Snx4-Atg20 e 2,5 mM di liposomi in un volume di reazione totale di 20 gradi, variando il volume dei liposomi aggiunti.
   NOT: Nello stesso esperimento, si dovrebbe usare lo stesso volume di liposomi.
3. Incubare la reazione a 30 gradi centigradi per 30 min.
   NOT: Si consiglia di massimizzare la quantità di rossesomi da 2,5 mm aggiunti a ogni reazione utilizzando non meno di 10 liposomi l per consentire la visualizzazione durante la sedimentazione. Se in una reazione di 20 m viene utilizzato 10 ll di 2,5 m di liposomi, la concentrazione finale di liposomi sarà di 1,25 mM. Se le proteine purificate sono diluite e è necessario più volume per 4 proteine M, i lipidi possono essere risospesi in 200 gradi durante la fase di reidratazione per raddoppiare la concentrazione di liposomi (vedere Passo 3.6); tuttavia, questo richiederà conoscere la concentrazione proteica prima di fare i liposomi.
4. Visualizza e quantifica la tubazione liposoma.
   1. Reazioni di legame lipososo del processo immediatamente per l'analisi della microscopia elettronica. Avvistare i campioni su una griglia di maglie di rame rivestite in carbonio e una macchia negativa utilizzando l'1% di acetato uranilo (Figura 5B)¹⁶.
   2. Analizzare i campioni su un microscopio elettronico a trasmissione (200 kV).
   3. Utilizzare il software di analisi delle immagini per misurare e quantificare il diametro del tubulo. Per quantificare con precisione il diametro del tubulo di un singolo tubulo, adottare tre misure di diametro lungo la lunghezza di un tubulo e la media (Figura 5B).
      NOT: L'analisi bidirezionale della varianza è stata utilizzata per determinare la significatività statistica (Figura 5E). L'acetato di urane è sia radioattivo che tossico. Per eseguire questo passaggio è necessaria una certificazione di sicurezza di laboratorio adeguata.
5. Rilegatura e sedimentazione liposoma.
   1. Trasferire la reazione (20 , dal gradino 4,3) a un tubo di centrifuga di policarbonato e utilizzare un rotore compatibile per girare a 100.000 x g in un ultracentrifuga per 20 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione il supernatante e trasferirlo nel nuovo tubo di microcentrifuga. Si noti che il pellet deve rimanere intatto.
   2. Risospendere il pellet in SDS-PAGE 40 - L di buffer campione e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifuga. Aggiungere 20 l di buffer di campionamento al supernatante. Caricare quantità equivalenti di pellet e supernatant in un gel SDS-PAGE poliacrilamide del 10% ed eseguire la colorazione Coomassie per visualizzare SNX-BAR vincolati ai liposomi (Figura 5A).
   3. Per quantificare la quantità di complesso SNX-BAR nella frazione di pellet, quantificare le intensità della banda utilizzando densitometria e quantificare la proporzione delle proteine SNX-BAR nella frazione di pellet.
      NOT: L'analisi bidirezionale della varianza è stata utilizzata per determinare la significatività statistica (Figura 5C).

Results

Questo protocollo descrive un metodo per la produzione riproducibile e robusta di complessi SNX-BAR di lievito endogeno che possono essere utilizzati per i saggi di rimodellamento della membrana a valle (Figura 1). La costruzione del ceppo di lievito utilizzato per la purificazione sfrutta l'efficienza della ricombinazione omologa nel lievito in erba, consentendo modifiche ai loci genomici della SNX-BAR mirata (Figura 2). Questo ...

Discussion

Qui, dimostriamo un flusso di lavoro ottimizzato per purificare i dimeri SNX-BAR nel lievito e due saggi per valutare le loro proprietà biofisiche sui liposomi sintetici. Il vantaggio principale rispetto alla tipica espressione proteica ricombinante in Escherichia coli o in altri sistemi è la capacità di esprimere uniformemente le proteine SNX-BAR in un host nativo, evitando così i problemi di tossicità e insolubilità riscontrati nella purificazione delle SNX-BAR in altri sistemi. È anche da notare che il nostro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 μ m Membrane PC	Avanti	610006
Colonna per cromatografia Poly-Prep da 10 mL (Bio-Rad)	Bio-Rad	731-1550
Ago da 27 G	BD Biosciences	301629
Filtro ultra centrifugo Amicon con cutoff 10K	Amicon	UFC501024
Omogeneizzatore Avestin EmulsiFlex-C3 Saggio
	Pierce	23225
Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuga	Beckman Coulter	393315
Inibitore completo della proteasi Cocktail	Roche	4693116001
DOPC	Avanti	850375
DOPS	Avanti	840035
Ergosterolo (Sigma)	Sigma	47130-U
Set di estrusori con Blocco 0.2 μ L/1 mL	Avanti	610000
FEI Tecnai F20 microscopio elettronico a trasmissione (200 kV)
Provette per coltura in vetro	VWR	47729-570
IgG sepharose beads (GE Healthcare)	GE Healthcare	17-0969-01
Microltro siringhe in vetro	Hamilton	7637-01
New Brunswick Excella E25	Eppendorf	M1353-0000	o agitazione equivalente di 30 gradi C
Perle magnetiche di agarosio Ni-NTA	Pierce	78605
Optima XE-90 Ultracentrifuga	Beckman Coulter	A94516
Parafilm M	VWR	52858-076
PI3P	Echelon	P-3016	o Echelon equivalente
Assemblaggio bottiglia in policarbonato	Beckman Coulter	355622
TLA-100 ad angolo fisso Rotore	Beckman Coulter	343840
Tipo 45 Ti Rotore	Beckman Coulter
Essiccatore a vuoto, fondo e coperchio con valvola a bussola VWR		75871-436
Pompa a vuoto Alcatel (Pascal 2005 C1)	A& J Vacuum	PN07050
Vortex con supporto schiuma	VWR	10153-838
VWR KIT MICROTUBO	VWR	12620-880