Clonal Genetic Tracing utilizzando il mouse Corfetti per studiare i tessuti mineralizzati

Sommario

Questo metodo descrive l'uso del modello murino R26R-Confetti (Coriandoli) per studiare i tessuti mineralizzati, coprendo tutte le fasi dalla strategia di allevamento all'acquisizione di immagini. Incluso è un protocollo generale che può essere applicato a tutti i tessuti molli e un protocollo modificato che può essere applicato ai tessuti mineralizzati.

Abstract

Etichettare una singola cellula nel corpo per monitorare quali tipi di cellule può dare origine e monitorare la sua migrazione attraverso l'organismo o determinare la sua longevità può essere un modo potente per rivelare i meccanismi di sviluppo e manutenzione dei tessuti. Uno degli strumenti più importanti attualmente disponibili per monitorare le celle in vivo è il modello di mouse Corfetti. Il modello Coriandoli può essere utilizzato per etichettare geneticamente singole cellule in topi viventi con varie proteine fluorescenti in modo specifico del tipo di cellula e monitorare il loro destino, così come il destino della loro progenie nel tempo, in un processo chiamato tracciazione genetica clonale o tracciamento del lignaggio clonale. Questo modello è stato generato quasi dieci anni fa e ha contribuito a una migliore comprensione di molti processi biologici, in particolare legati alla biologia delle cellule staminali, allo sviluppo e al rinnovamento dei tessuti adulti. Tuttavia, preservare il segnale fluorescente fino alla raccolta delle immagini e alla cattura simultanea di vari segnali fluorescenti è tecnicamente impegnativo, in particolare per i tessuti mineralizzati. Questa pubblicazione descrive un protocollo passo-passo per l'utilizzo del modello Coriandoli per analizzare la cartilagine della piastra di crescita che può essere applicata a qualsiasi tessuto mineralizzato o non mineralizzato.

Introduzione

Metodi migliorati per monitorare il comportamento delle cellule sono desiderabili per aumentare l'efficienza sperimentale quando si utilizzano modelli animali. Uno degli approcci più informativi per monitorare il comportamento delle cellule in vivo è il tracciamento del lignaggio clonale con ceppi di mouse reporter multicolore¹, incluso il mouse R26R-Confetti (Confetti)²ampiamente utilizzato. Etichettando geneticamente singole cellule con proteine fluorescenti e seguendo quelle cellule nel tempo, i ricercatori di molti campi hanno usato il topo coriandoli per rivelare informazioni su una moltitudine di diversi sistemi biologici.

Il mouse confetti è un sistema di reporter basato su loxP in cui la ricombinazione del DNA dipendente di Cre provoca l'espressione permanente di una delle diverse possibili proteine fluorescenti in modo stocastico². L'allelio R26R-Confetti comprende l'onnipresente promotore CAGG, che si trova immediatamente a monte di un Neo^R-cassette²fiancheggiato da loxP, la cui sequenza di poliadenzione termina la trascrizione³, seguita dalla Brainbow 2.1 costrutto⁴. Quindi, la ricombinazione mediata da Cre eccita contemporaneamente la Neo^R-cassettee porta alla produzione di alcune proteine fluorescenti a seconda di quali parti del costrutto Brainbow 2.1 vengono assoggettate. Questa caratteristica rende il mouse Coriamia estremamente adattabile perché può essere utilizzato per indirizzare qualsiasi popolazione cellulare in un mouse per il quale è disponibile una specifica deformazione Cre. L'attraversamento di un ceppo Cre specifico per tessuto con la varietà R26R-Confetti fornisce la specificità dell'etichettatura. Tuttavia, il ceppo Cre dovrebbe anche essere inducibile (ad esempio, CreERT o CreERT2, che richiedono l'associazione di tamoxifene per consentire loro di entrare nel nucleo e indurre la ricombinazione del DNA⁵⁾in modo che l'etichettatura possa essere ottenuta in punti temporali specificati. Così, una popolazione cellulare può essere etichettata iniettando la prole positiva e coriandola risultante con tamoxifene nel punto di tempo desiderato e monitorata a una certa età, quando i tessuti di interesse possono essere raccolti per l'analisi. Dopo l'elaborazione dei tessuti, le cellule etichettate fluorescentmente possono essere visualizzate direttamente mediante microscopia confocale in modo che la progenie di ciascuna cellula etichettata inizialmente possa essere separata dalla progenie generata da qualsiasi altra cellula etichettata in base alla loro fluorescente specifica etichette, consentendo in tal modo la clonalità da valutare (cioè il tracciamento genetico clonale).

Grazie alla flessibilità del modello Coriandoli, è stato applicato per studiare lo sviluppo e il mantenimento di molti tessuti diversi in salute e malattia^{2,6,7,8,9, 10,11}. Un modo comune per utilizzare il modello è quello di etichettare una certa popolazione di cellule e determinare a quali tessuti hanno contribuito (e/o la loro progenie). Una di queste scoperte utilizzando questo approccio è stato che il dente adulto è costituito da cellule con un'origine glial⁶. Un'altra applicazione del modello è quella di studiare l'omeostasi delle cellule staminali. Ad esempio, il modello Coriandoli ha rivelato che le nicchie di cellule staminali nelle cripte intestinali diventano gradualmente monoclonali perché alcuni cloni di cellule staminali sono dominanti durante la competizione tra le cellule staminali². Il modello può essere utilizzato anche per valutare la proliferazione cellulare, che è particolarmente utile per studiare lentamente le cellule che si dividono. Ad esempio, è stata valutata la formazione di clonale nella cartilagine articolare¹² ed è stato^studiatogli effetti a breve termine di un antagonista del riccio sulla placca di crescita condrociti in topi di cinque settimane.

Nonostante la relativa semplicità del modello Coriandoli, il segnale fluorescente può essere tecnicamente impegnativo da preservare fino alla raccolta delle immagini, in particolare quando si analizzano i tessuti mineralizzati. Qui, il protocollo descrive un modello ottimizzato per utilizzare il mouse Coriamia con l'osso postnatale (fino a 6 mesi di età), consentendo alle proteine fluorescenti di essere visualizzate direttamente mediante microscopia confocale senza la necessità di immunodiagnosi. Questo protocollo semplificato può essere applicato ai tessuti non mineralizzati. Inoltre, è inclusa una descrizione di come conservare i campioni al fine di preservare il segnale fluorescente per un periodo prolungato di almeno 3 anni. Nella figura 1viene presentato un contorno del protocollo.

Protocollo

Tutto il lavoro dei topi è stato approvato dal Comitato Etico per gli Esperimenti Animali (Comitato Nord di Stoccolma/Norra Djurra Djurf'ksetiska Nomd) e condotto in conformità con le disposizioni e le linee guida dell'Agenzia svedese per gli animali.

1. Allevamento di topi

1. Per generare la deformazione, attraversare il mouse R26R-Confetti con la linea di interesse Cre. Swean i cuccioli a 21 giorni di età.
   NOTA: I topi possono essere utilizzati per l'allevamento a partire da circa 8 settimane di età, o secondo le linee guida locali. La genotipizzazione (non descritta qui) può essere eseguita da biopsie raccolte allo svebronità. L'età dello svasamento può essere regolata in base alle linee guida locali.

2. Etichettatura dei coriandoli

NOTA: Questa strategia di etichettatura è appropriata per i ceppi Cre inducibili.

1. Preparare una soluzione fino a 2,5 mg/mL di tamoxifene in olio di mais in una bottiglia di vetro. Sciogliere riscaldando a 37 gradi centigradi in forno fino a 60 min, agitando ogni 5 min utilizzando un vortice fino a quando la polvere si è sciolta.
   NOTA: Per aumentare le dosi di tamoxifene, è possibile preparare soluzioni fino a 20 mg/mL utilizzando questo metodo.
2. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi, protetto dalla luce.
3. Indurre la ricombinazione somministrando 50 , l'l di 2,5 mg/mL tamoxifene sciolti nell'olio di mais intraperitonealmente nel primo giorno postnatale (P1).
   NOTA: In linea di principio, il tamoxifene può essere somministrato a qualsiasi età, già nella generazione Di F1. La dose di tamoxifene deve essere variata in base all'espressione Cre, all'età del topo e all'applicazione sperimentale. Ulteriori informazioni sono disponibili nella sezione discussione. I topi negativi Cre trattati allo stesso modo possono essere utilizzati come controllo negativo per i segnali fluorescenti di coriandoli.
   AVVISO: Assicurarsi che i gestori degli animali siano avvertiti dell'uso del tamoxifene e che i materiali della gabbia siano smaltiti secondo le linee guida locali per l'ambiente e la sicurezza.

3. Raccolta di tessuti

1. Eutanasia dei topi il giorno postnatale 27 (P27) riempiendo gradualmente lo spazio contenente i topi con anidride carbonica fino ad almeno 80% in volume e mantenendo questa concentrazione per 3 min. Eseguire la lussazione cervicale. Tenere i topi sul ghiaccio durante la dissezione degli altri animali.
2. Distogliere il tessuto di interesse. Di seguito è riportato un protocollo per la raccolta delle piastre di crescita femorale e dissimale e della cartilagine articolare del ginocchio, adatto per i topi postnatali fino all'età di 6 mesi.
   1. Rimuovere la pelle intorno agli arti posteriori fino al piede, utilizzando forbici affilate e pinze dentate.
   2. Tagliare grossolanamente il muscolo e il tessuto adiposo dalle gambe con forbici affilate.
      NOTA: Non pulire perfettamente le ossa, perché i tessuti circostanti forniscono un certo supporto strutturale durante la sezionamento, ma assicurano che tutta la pelle venga rimossa.
   3. Utilizzando un bisturi, tagliare attraverso il tessuto molle dove la parte superiore della gamba incontra il corpo fino a quando la testa femorale è visibile, quindi tagliare i legamenti nell'articolazione dell'anca per rimuovere la gamba.
      NOTA: In alternativa, se non è possibile trovare la testa femorale, tagliare il femore vicino all'anca con forti forbici.
   4. Dissezionare il piede dal resto della gamba utilizzando un bisturi o forbici affilate.

4. Fissazione e lavorazione dei tessuti

NOTA: In base al tessuto di interesse, seguire uno dei due protocolli descritti di seguito (4.1 per i tessuti molli o 4,2 per i tessuti dei topi mineralizzati di età superiore ai 45 giorni, come descritto di seguito). Per entrambi i metodi, conservare i campioni sezionati nella soluzione pbina tamponata (PBS) del 3,7% di formaldeide/fosfato sul ghiaccio mentre si sezionano gli animali rimanenti.

1. Per i tessuti molli e le tibie e le femora mineralizzate fino all'età di circa P45, fissare il tessuto in preraffreddato 3,7% formaldeide/PBS per 6 h, rotolando delicatamente su un rotatore a 4 gradi centigradi. Utilizzare un volume almeno 10 volte superiore a quello del tessuto. Proseguire direttamente al passaggio 4.3.
2. Per i tessuti mineralizzati, tra cui la tibia e il femora oltre l'età di circa P45, è necessaria una fase di decalcificazione.
   1. Preparare 1 L di 10% EDTA/dH₂O soluzione con il pH regolato a 8,05 utilizzando idrossido di sodio. Successivamente, diluire la formaldeide al 3,7% utilizzando questa soluzione. La concentrazione di lavoro di EDTA sarà del 9%.
   2. Fissare il tessuto posizionandolo in preraffreddato 3,7% formaldeide/PBS durante la notte, rotolando delicatamente su un rotatore a 4 gradi centigradi.
   3. Posizionare il tessuto nella soluzione preraffreddata 3,7% formaldeide/9% EDTA/dH₂O (pH 8,05), e ruotare delicatamente a 4 gradi centigradi in un volume almeno 10 volte superiore a quello del tessuto. Ripetere questo passaggio posizionando le ossa in fresco, preraffreddato 3.7% formaldeide/9% EDTA/dH₂O per 3x sopra i prossimi 48 h.
      NOTA: Questa breve decalcificazione è sufficiente per consentire la sezionamento del femore e delle ossa di tibia fino a 6 mesi. Per i tessuti più densamente mineralizzati può essere necessaria un'ulteriore decalcificazione per migliorare l'istologia.
3. Trasferire il tessuto nel preraffreddamento 30% saccarosio/dH₂O. Assicurarsi di riempire il contenitore fino all'orlo, e ruotare delicatamente durante la notte a 4 gradi centigradi. Utilizzare un volume almeno 10 volte superiore a quello del tessuto. Il tessuto spesso galleggia quando viene posizionato per la prima volta in questa soluzione e affondare sul fondo della bottiglia entro la mattina.
4. Per rimuovere la soluzione residua di saccarosio, lavare brevemente il tessuto rimuovendolo dalla soluzione di saccarosio con pinze e coprendo completamente il campione con circa 5 ml di composto di temperatura di taglio ottimale (OCT) per alcuni secondi.
5. Riempire un criostampo preetichettato con OCT e posizionare il tessuto nella parte inferiore. Lavorare rapidamente per evitare che i campioni seduti a temperatura ambiente per troppo tempo.
   NOTA: è importante posizionare il campione in un orientamento conveniente per la fase di sezionamento. Per aumentare le probabilità di sezionamento attraverso intere colonne di piastra di crescita dopo aver tracciato con Col2CreERT:Confetti, posizionare il lato mediale rivolto verso il basso utilizzando la testa femorale come guida e posizionare il campione il più piatto possibile verso il fondo dello stampo.
6. Incorporare il campione posizionando lo stampo sul ghiaccio secco e in attesa che il PTOP si solidifichi completamente. Posizionare i criopoli più piatti possibile per evitare il movimento / scorrimento del tessuto nello stampo. Una volta terminato, conservare i campioni a -20 gradi centigradi, se non vengono utilizzati immediatamente.
   NOTA: Utilizzare entro 12 settimane, perché con l'età i blocchi diventano più difficili da sezionere.

5. Sezionamento

NOTA: Eseguire la criosezione utilizzando un criostato con lame usa e getta adatte per i tessuti duri. Qualsiasi criostato standard è adatto.

1. Rimuovere il blocco dallo stampo e fissarlo al mandrino applicando lo strumento di personalizzazione di Office tra la parte superiore del blocco e il mandrino e raffreddandosi nel criostat a -20 gradi centigradi per almeno 5 min, in modo che lo Oct si sia completamente solidificato.
2. Precool sia il supporto del campione che il supporto della lama a -20 gradi centigradi, quindi posizionare il campione/chuck nel supporto mandrino e la lama nel supporto della lama per eclarire per diversi minuti.
   NOTA: Le temperature specificate possono variare di diversi gradi a seconda del criostato e del tessuto di interesse.
3. Utilizzare il criostato per tagliare le sezioni del blocco e tagliare i tessuti di uno spessore adatto per consentire la visualizzazione dei cloni nel tessuto di interesse.
   1. Per l'analisi della piastra di crescita postnatale, preparate sezioni di 30-160 m e raccoglietele sugli scivoli. Alcuni modelli criostati possono consentire la raccolta di sezioni spesse solo utilizzando l'impostazione di taglio.
4. Asciugare all'aria i vetrini a temperatura ambiente fino a quando non sono completamente asciutti.
   NOTA: la durata di questo passaggio può variare in base alle proprietà del tessuto e allo spessore della sezione. La temperatura della stanza è anche probabile che influenzano la velocità di questo passo.
5. Conservare i vetrini a -20 gradi centigradi per un massimo di 36 mesi o, se elaborazione immediata, procedere al passaggio 6.2.

6. Preparazione e montaggio del vetrino

1. Rimuovere il vetrino dal congelatore e portare a temperatura ambiente orizzontalmente in un supporto scorrevole. Lasciar evaporare qualsiasi condensa.
2. Rimuovere lo Oct utilizzando una pipetta Pasteur per applicare delicatamente PBS a temperatura ambiente sulla diapositiva. Più spessa è la sezione, più tempo è richiesto. Per le sezioni spesse 160 m, eseguite due risciacquo: incubate una volta per 15 min e rimuovete il liquido, quindi applicate PBS fresche per 5 min e rimuovete il liquido.
   NOTA: questo passaggio consiste nel rimuovere lo Strumento di personalizzazione di Office e può essere variato in base alle proprietà dei tessuti e allo spessore della sezione, a seconda dei casi. La temperatura della stanza può influenzare la velocità di questo passaggio.
3. Montare i vetrini in una soluzione del 75% 2,2-thiodiethanol/dH₂O a temperatura ambiente con scivoli di copertura lunghi 60 mm.
   NOTA: I vetrini possono essere preparati immediatamente prima dell'imaging, ma il segnale fluorescente è stabile per 1/2 settimane se tenuto fuori dalla luce in una camera umidificata a 4 gradi centigradi.

7. Imaging mediante microscopia confocale

1. Impostare il microscopio.
   1. Accendere il microscopio e aprire il software. Fare clic sul pulsante Start System (Avvia sistema).
   2. Selezionare i canali facendo prima clic su Configurazione intelligente nella scheda Acquisizione e quindi selezionando i tre canali corrispondenti alla proteina fluorescente rossa (RFP), alla proteina fluorescente gialla (YFP) e alla proteina cianescente (CFP) sotto il Intestazione della tinri. Fare clic su Miglior segnale, quindi su Applica per selezionare i laser.
      NOTA: il contenuto della scheda Acquisizione viene visualizzato nel file supplementare 1A. Se i canali richiesti non sono presenti, aggiungerli utilizzando il pulsante'' ' sotto l'intestazione Dye. Le informazioni necessarie per quanto riguarda il laser, le lunghezze d'onda di eccitazione e la gamma di lunghezze d'onda di emissione registrate sono mostrate per le tre proteine fluorescenti dei coriandoli nel file supplementare 1B-D.
   3. Selezionare l'obiettivo 20x sotto l'intestazione Obiettivo nella scheda Modalità acquisizione.
2. Individuare la piastra di crescita o altro tessuto di interesse.
   1. Per fornire una vista distinta, selezionare prima il canale RFP facendo clic sul suo nome nella scheda Canali. In questo modo i dettagli del canale RFP da visualizzare nella scheda Percorso luce .
      NOTA: il canale T-PMT mostra la luce laser non riflessa, che viene utilizzata per visualizzare le parti non fluorescenti del tessuto.
   2. Posizionare la diapositiva nel supporto della diapositiva e posizionare la piastra di crescita o altro tessuto di interesse direttamente tra il percorso della luce e l'obiettivo.
   3. Per semplificare la localizzazione del tessuto, deselezionate i canali YFP e CFP utilizzando le caselle di controllo sotto l'intestazione Tracce della scheda Canali.
   4. Selezionare il canale T-PMT facendo clic sul suo nome nell'intestazione Tracce. Fare clic su Live nella scheda Acquisizione e aumentare il guadagno (Master) per il canale T-PMT per visualizzare la sezione dei tessuti sullo schermo, visualizzata in scala di grigi.
   5. Spostare la posizione della diapositiva utilizzando il joystick per individuare la regione di interesse, quindi mettere a fuoco utilizzando la manopola del microscopio appropriata.
   6. Fare clic su Interrompi nella scheda Acquisizione per disattivare l'esposizione al laser.
3. Definire i parametri di imaging.
   1. Utilizzate le caselle di controllo nella scheda Canali per selezionare uno dei canali e fate clic su Dal vivo nella scheda Acquisizione per visualizzare l'immagine di tale canale sullo schermo. Quindi, utilizzando il pulsante sinistro del mouse, regolare le barre di scorrimento per impostare l'intervallo di segnale fluorescente emesso che viene raccolto, la potenza laser (barra scorrevole sotto direzione Laser), guadagno (Master) e Scostamento digitale nel Scheda Canali per visualizzare le celle con etichetta Confetti' sullo schermo. I valori delle linee guida per tutti questi parametri sono disponibili nel file supplementare 1B-D per RFP, YFP e CFP. Completa questo passaggio per ogni canale, uno per uno.
      NOTA: Per garantire che il segnale visualizzato non sia autofluorescenza, una sezione di un animale negativo Cre può essere utilizzata come controllo negativo durante questa fase. Poiché T-PMT è stato combinato con il laser RFP (passaggio 7.2.1) la regolazione della potenza laser per RFP influirà sul segnale T-PMT.
   2. Regolare la dimensione del foro per aumentare il rilevamento della fluorescenza, se necessario.
      NOTA: maggiore è la dimensione del foro stenopeico, maggiore è il segnale fluorescente rilevato nella direzione z. Una linea guida per questo è la risultante Airy Unit (AU), che viene automaticamente indicata sotto l'indicatore Pinhole, dove 1 UA è ottimale per la qualità di imaging. Aumentare troppo l'UA comprometterà l'analisi successiva perché diventa più difficile distinguere le singole cellule nella direzione z).
   3. Controllare l'impostazione per assicurarsi che i segnali registrati non si sovrappongano.
      1. Fare clic sulle caselle di controllo nella scheda Canali per selezionare tutti e tre i canali e premere il pulsante Snap nella scheda Acquisizione.
      2. Nell'immagine risultante, scorrere tra i canali visualizzati facendo clic sulle caselle evidenziate in blu sopra ogni canale elencato nella scheda Dimensioni. Verificare manualmente la sovrapposizione tra i canali sullo schermo. Se i segnali si sovrappongono (ad esempio, se ogni cella rossa è anche gialla), tornare all'inizio del passaggio 7.3 e ripetere, regolando i parametri per i canali sovrapposti fino a quando non possono essere distinti l'uno dall'altro. Assicurarsi che per ogni etichetta (ad esempio, RFP, YFP o CFP) sia possibile visualizzare almeno un clone contenente solo una delle etichette.
4. Acquisire l'immagine.
   1. Selezionare la scheda Modalità acquisizione per specificare la qualità dell'immagine utilizzando i valori Dimensioni fotogramma, Velocitàe Numero media.
      NOTA: le impostazioni tipiche di questi esperimenti sono indicate nel file supplementare 1A. Riducendo lo zoom sotto l'intestazione Area di scansione all'interno della scheda Acquisizione è possibile aumentare il campo visivo senza alterare il tempo necessario per l'acquisizione dell'immagine.
   2. Nella scheda Acquisizione, sotto l'intestazione Acquisizione dimensionale, fare clic sulla casella di controllo Stack z. Aprite a 2,5 m l'intervallo di impilamento z per impostare l'intervallo tra le immagini nella direzione z.
   3. Per impostare le posizioni corrette, selezionare solo la funzione RFP/T-PMT nella scheda Canali e fare clic su Live per visualizzare i cloni rossi con un contorno visibile del tessuto. Impostare la prima e l'ultima sezione facendo clic su Imposta prima e Imposta ultima sulla sezione corrispondente, regolando la messa a fuoco utilizzando la manopola del microscopio.
   4. Fare clic sulla scheda Scansione affiancata all'interno della scheda Acquisizione e immettere il numero totale di riquadri nelle direzioni orizzontale e verticale nelle rispettive caselle.
   5. Per l'acquisizione dell'immagine, selezionare tutti i canali desiderati nella scheda Canali, quindi fare clic sul pulsante Snap per raccogliere una singola immagine o sul pulsante Avvia esperimento per raccogliere una scansione di stack/tile.
5. Una volta acquisita l'immagine, fare clic su File, quindi su Salva con nome e salvare l'immagine in un tipo di file che conserva il maggior numero possibile di informazioni sulle impostazioni del microscopio, per consentire una revisione e un riutilizzo successivi.
6. Eseguire ulteriori analisi utilizzando il software di analisi delle immagini.

Risultati

Per etichettare i condrociti nella cartilagine epifita e visualizzare la loro espansione clonale con l'età usando la somministrazione di tamoxifene su P1, i topi Col2CreERT:Confetti sono stati etichettati e i loro arti posteriori sono stati raccolti su P27. La sezione centrale è stata determinata visualizzando il legamento crociato (Figura 2A) e sono stati visualizzati i cloni nella piastra di crescita tibiale prossimale (Figura 2B). Questi dati mostrano che le singole cellule che sono state Col2-positive su P1 e sono diventate etichettate con proteine fluorescenti Coriandoli quando il tamoxifen è stato somministrato, ha subito l'espansione clonale e successivamente è rimasto nella piastra di crescita fino al P27. Le prime modifiche nell'espansione clonale da un momento di sviluppo simile sono riportate nella Figura 1 di una recente pubblicazione¹³.

Per fare un esempio del segnale fluorescente dopo l'archiviazione a lungo termine (passaggio 5.5), la sezione raccolta è stata memorizzata immediatamente dopo (vedere la figura 2A,B) per più di 3 anni prima di essere preparata e visualizzata (Figura 2C, Video 1) .

Per dimostrare alcuni problemi comuni con il protocollo, una sezione interrotta durante la fase di criosezione è illustrata nella Figura 3A. La regione della sezione (tra la piastra di crescita e la cartilagine articolare) espansa nella Figura 3B mostra che questa dose di tamoxifene porta ad un livello di ricombinazione così elevato in quest'area che precluderebbe l'analisi clonale.

Figura 1: Panoramica sperimentale. Diagramma di flusso che riepiloga le fasi chiave del metodo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini di coriandoli da un mouse Col2CreERT:Confetti. (A) I campioni di topi Col2CreERT:Confetti sono stati elaborati senza decalcificazione o con la fase di conservazione a lungo termine. La sezione centrale era situata utilizzando il legamento crociato come marcatore. Questa immagine è stata visualizzata utilizzando una scansione del riquadro dopo aver rilevato RFP con T-PMT (barra di scala : 300 m). (B) Le colonne clonali sono mostrate all'interno della tibia prossimale della piastra di crescita visibile in (A), dopo la ricostruzione 3D. (C) Per la creazione di immagini e la ricostruzione 3D è stata elaborata una diapositiva adiacente a quella indicata in (A) e (B)conservata in deposito a lungo termine per più di 3 anni. RFP, YFP e CFP vengono visualizzati in (B) e (C) (barre di scala : 50 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Sfide quando si utilizza il metodo. (A) Le linee tratteggiate bianche delineano una divisione nella sezione attraverso la piastra di crescita dei topi Col2CreERT:Confetti (barra di scala n. 50 m). L'area all'interno della casella bianca viene visualizzata in (B) (barra di scala - 25 m). RFP, YFP e CFP sono mostrati in entrambi i pannelli e il canale di luce laser non riflesso (T-PMT) è mostrato anche in (A) per visualizzare il tessuto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Ricostruzione tridimensionale di una piastra di crescita da Col2CreERT: Mouse coriandoli. Una diapositiva preparata da un Col2CreERT: Il mouse confetti è stato tenuto in deposito a lungo termine dopo la sezionamento per più di 3 anni, e poi elaborato per l'imaging. La ricostruzione tridimensionale è stata condotta automaticamente con un software di analisi delle immagini ed esportata come video. Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: configurazione tipica del microscopio confocale. (A) I principali controlli presenti nella scheda Acquisizione. (B)I parametri laser, la lunghezza d'onda dell'eccitazione e la gamma delle lunghezze d'onda di emissione registrate sono mostrati per tre proteine fluorescenti coriandoli. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Il modello Confetti è stato ampiamente utilizzato per studiare i tessuti della cartilagine mineralizzati^12,13,14 e per descrivere il protocollo ottimizzato. I topi di coriandoli² con una o due copie dell'allelica R26R-Confetti possono essere utilizzati per l'allevamento e gli esperimenti. La ricombinazione dei topi con un allele del costrutto brainbow 2.1 fornirà quattro etichette potenziali: proteina fluorescente rossa (RFP, citoplasma), proteina fluorescente gialla (YFP, citoplasma, proteina fluorescente cianale (CFP, membrana-localizzata) e verde proteine fluorescenti (GFP, nucleo-localizzato), mentre la ricombinazione nei topi omozigagi coriandoli (cioè, contenenti due copie del costrutto Brainbow 2.1) fornirà 10 possibili output di colore (RFP-RFP, RFP-YFP, RFP CFP, CFP, CFP, GFP, GFP- GFP). Tuttavia, poiché gli eventi di escissione e inversione del DNA si verificano in modo stocastico, la ricombinazione per produrre GFP si verifica solo in una piccola frazione di cellule, come riportato in precedenza², e apparentemente differisce per tipo di cellula o linea Cre utilizzata^{2, 12,13}. Quindi, data la bassa occorrenza di eventi di ricombinazione che portano all'espressione GFP, sei uscite di colore sono le più comuni nei topi coriandoli omozici.

Una considerazione importante quando si pianificano esperimenti con il mouse Coriamie è quello di trovare un ceppo Cre adatto. In primo luogo, dal momento che l'allele Corfetti ha diversi siti loxP, un evento di ricombinazione non preclude un secondo⁴. Ciò significa che se una cella viene etichettata e si divide per produrre un clone di un colore, un secondo evento di ricombinazione in una delle sue cellule figlie genererebbe un colore diverso, mascherando così la vera espansione clonale. Pertanto, i ceppi Cre non inducibili, dove l'enzima è sempre attivo se il promotore corrispondente è attivo, non sono consigliabili. In secondo luogo, in alcuni ceppi l'espressione di Cre ricombinase spesso va a scapito di una proteina endogena, creando così un fenotipo proprio (ad esempio, per la varietà del topo Knock-in Prg4-GFPCreERT2 in cui i topi ospitano due alleli Cre^(15), quindi una singola copia dell'allele Del Cre è auspicabile. In tutti gli esperimenti descritti, una singola copia del Col2CreERT¹⁶ è stata trasportata dal maschio o dal genitore femmina per generare topi Col2CreERT:Confetti, come descritto¹³. Successivamente, la specificità della linea Cre per il tipo di cella di interesse è una considerazione importante. Ad esempio, Col2CreERT è specifico di condrociti, ma etichetta diverse popolazioni distinte di condrociti nella cartilagine postnatale¹⁷. Infine, l'attività di diversi ceppi Di Cre può cambiare considerevolmente con l'età animale, in quanto l'attività endogena del promotore utilizzata per i cambiamenti di espressione Del Cre, anche nelle cellule dello stesso tipo (ad esempio, Prg4-GFPCreERT2, che può richiedere un aumento numero di dosi di tamoxifene per etichettare le cellule superficiali della zona come topi di^{età compresa}tra 15 anni ).

Il numero di cellule etichettate sarà riflesso dalla quantità di tamoxifene data, quindi non è sempre auspicabile dare la dose massima perché distinguere i cloni l'uno dall'altro può essere difficile. Perché l'espressione Cre varierà sotto la regolazione di diversi promotori così come con l'età, il dosaggio di tamoxifene dovrà essere regolato per ottimizzare l'etichettatura. È importante notare che le cellule non sono immediatamente fluorescenti al momento dell'attivazione della ricombinazione perché è necessario tempo perché la ricombinazione si verifichi e le proteine fluorescenti risultanti si accumulino sufficientemente per l'imaging. È necessaria un'ampia gamma di ore (tra i 24 e i 72 h), che sembra essere influenzata dalla linea Cre, dal tipo di cellula e dall'età animale. Poiché il tamoxifene può essere biologicamente attivo molto tempo dopo la somministrazione¹⁸ è sempre consigliabile controllare a fondo l'efficienza di ricombinazione in ogni modello.

Durante la fase di microscopia confocale, l'eccitazione delle proteine fluorescenti Coriandoli richiede la penetrazione del tessuto da parte della luce laser. Poiché tessuti diversi hanno proprietà diverse, la luce laser potrebbe non penetrare sezioni spesse 160 m di tutti i tessuti. Tuttavia, tali sezioni spesse possono essere utilizzate per la cartilagine della piastra di crescita, come utilizzato in Figura 2, Figura 3. Si noti che ogni microscopio è diverso ed è improbabile che le impostazioni descritte (File supplementare 1) funzionino perfettamente senza piccole regolazioni. Una delle principali sfide è distinguere le diverse proteine fluorescenti per garantire che non vi sia contaminazione da un canale all'altro. Ad esempio, il segnale nel canale YFP causato dalla fluorescenza proveniente da GFP si sovrappone tra i canali YFP e RFP. Anche i canali YFP e CFP devono essere attentamente controllati. Questo può essere fatto in diversi modi. In primo luogo, la gamma di emissione di lunghezze d'onda luminose fluorescenti registrate per ogni proteina fluorescente può essere ridotta. In secondo luogo, regolare la potenza del laser in combinazione con il guadagno digitale può ottimizzare il segnale. In questo studio questi passaggi erano sufficienti, ma si basano su un forte segnale fluorescente. Ciò significa che in teoria, l'elaborazione dei tessuti inefficiente può ridurre l'attività delle proteine fluorescenti, o una debole fonte di luce laser può compromettere la separazione dei canali.

Uno dei vantaggi del topo Corfetti è che può essere combinato con un gran numero di ceppi geneticamente mutanti che sono disponibili in modo che l'impatto di geni specifici sulla dinamica clonale possa essere studiato^{10,11,12 ,13,14,19,20}, anche se con alcune limitazioni. Ad esempio, la ricombinazione degli alleli Coriandoli e del gene di interesse non può essere separata quando si utilizzano mutanti a base di Cre loxP combinati con la tracciatura del lignaggio clonale. Tuttavia, tali eventi di ricombinazione coincidente possono essere efficaci^10,14,20. Per esempio, questa possibilità è stata utilizzata per esplorare l'aumento del numero di cellule nella zona di riposo dei topi in seguito all'ablazione postnatale specifica di TSC1 nella piastra di crescita²¹ e ha rivelato la relazione clonale tra queste cellule nel tempo ^13.Inoltre, l'analisi clonale specifica del tessuto utilizzando i topi Corfetti può essere utilizzata con topi mutanti non-Cre loxP¹¹, ed è anche possibile combinare questi approcci con i^microfonifarmacologici⁸,^{9 ,13} e/o modelli chirurgici⁸ per visualizzare le risposte clonali ad altre perturbazioni funzionali. Ulteriori opportunità sorgono quando si combinano sezioni etichettate Confetti con il rilevamento immuno-rilevamento di proteine endogene per immunofluorescenza. Tale analisi consente l'identificazione delle cellule tracciate e la loro co-localizzazione con un marcatore noto. Con il metodo di fissazione descritto qui, è possibile condurre l'immunofluorescenza e visualizzare ancora la fluorescenza dalle proteine fluorescenti dei coriandoli^12,13. Tuttavia, nei documenti menzionati, il recupero dell'antigene non era necessario. I metodi di recupero dell'antigene duro, come l'ebollizione nel tampone di citrati, porta ad una completa perdita di fluorescenza dei coriandoli. Anche se le proteine fluorescenti Coriandoli possono quindi essere rilevate utilizzando anticorpi²², può verificarsi una perdita di identità clonale.

In sintesi, l'utilizzo del modello Coriandoli per etichettare le celle in vivo è uno strumento informativo per analizzare il destino di tali cellule nel tempo. Il metodo descritto fornisce un modo rapido ed efficiente per visualizzare direttamente l'espressione delle proteine fluorescenti nei tessuti mineralizzati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2,2-tiodietanolo	Sigma	MKCF9328
vetrini coprioggetti lunghi 60 mm	Mendel-Glä zer	220588
Microscopio a scansione laser confocale	Zeiss	LSM 710
Olio di mais	Sigma	C8267
Cryomold (standard)	Sakura	4557
Cryostat	Thermo	Modello: NX70
Lame per criostato monouso	Histolab	207500014	Specificamente per l'uso con tessuti duri
EDTA	Scharlan	AC0960005P
Concentrato di formaldeide	Merck	8.18708.1000
Flaconi di vetro	Sigma	V7130	Può essere utilizzato per la diluizione del tamoxifene e per la fissazione e la lavorazione dei tessuti
Software Imaris	Oxford Instruments	N/A Software	analisi delle immagini per la ricostruzione 3D
Isoflurano	Zoetis	11-8162
OCT	Sakura	102094-104
Pipetta Pasteur	Sarstedt	86.1171
PBS	Gibco	14200075
Idrossido di sodio	Merck	1.06498.1000
Saccarosio	Sigma	S0389
Vetrini Superfrost UltraPlus	Mendel-Glä zer	J3800AMNZ
Tamoxifen	Sigma	T5648
Zen2 software	Zeiss	N/A	Freeware per microscopia a scansione laser confocale