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Articolo metodologico

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici

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DOI:

10.3791/60440

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12 novembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro presenta un protocollo per produrre colture cellulari omogenee dei motoneuroni primari oculomotori, trocleari e spinali. Queste colture possono essere utilizzate per analisi comparative delle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni oculari e spinali.

Abstract

I neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) mostrano una notevole resistenza alle malattie dei motoneuroni degenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) rispetto ai motoneuroni spinali (SMN). La capacità di isolare e coltura mouse primario CN3s, CN4s, e SMN fornirebbe un approccio allo studio dei meccanismi alla base di questa vulnerabilità selettiva. Ad oggi, la maggior parte dei protocolli utilizza colture cellulari eterogenee, che possono confondere l'interpretazione dei risultati sperimentali. Per ridurre al minimo i problemi associati alle popolazioni di cellule miste, le colture pure sono indispensabili. Qui, il primo protocollo descrive in dettaglio come purificare e coltivare in modo efficiente i CN3/CN4 insieme alle controparti SMN dagli stessi embrionali usando embrioni del giorno 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embrionali di topo transgenici. Il protocollo fornisce dettagli sulla dissezione e dissociazione dei tessuti, l'isolamento cellulare basato su FACS e la coltivazione in vitro di cellule dai nuclei CN3/CN4 e SMN. Questo protocollo aggiunge un nuovo sistema di coltura in vitro CN3/CN4 ai protocolli esistenti e fornisce contemporaneamente una cultura SMN pura e abbinata all'età per il confronto. Le analisi incentrate sulle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni sono realizzabili in questo sistema di coltura. Questo protocollo consentirà la ricerca sui meccanismi che definiscono lo sviluppo del motoneurone, la vulnerabilità selettiva e la malattia.

Introduzione

La coltura dei motoneuroni primari è un potente strumento che consente lo studio dello sviluppo neuronale, funzione, e suscettibilità a fattori di stress esogeni. Le colture di motoneuroni sono particolarmente utili per lo studio di malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)1,2, i cui meccanismi di malattia sono incompleti. È interessante notare che, nonostante la significativa morte cellulare dei motoneuroni spinali (SMN) sia nei pazienti affetti da SLA che nei topi modello di SLA, la morte cellulare nei neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) sono relativamente scarsi1,3,4,5,6,7,8,9. Pertanto, analisi comparative delle colture pure di CN3/CN4 e SM potrebbero fornire importanti indizi sui meccanismi alla base della vulnerabilità relativa. Sfortunatamente, un ostacolo importante a tali analisi è stata l'incapacità di coltivare colture purificate di questi motoneuroni.

Molti protocolli sono stati descritti per la purificazione delle sinistenzioni da modelli animali. La maggior parte di questi protocolli utilizza tecniche di panning di smistamento delle cellule basate su media di densità10,11,12 e/o p75NTR-anticorpi -anticorpi- base alle tecniche di panning13,14,15,16. La centrifugazione del gradiente di densità sfrutta le dimensioni maggiori delle snn rispetto ad altre cellule spinali, mentre p75NTR è una proteina extracellulare espressa esclusivamente dalle sren nel midollo spinale. Quasi 100% culture SMN pure sono state generate da uno o entrambi questi protocolli11,12,14. Tuttavia, questi protocolli non sono riusciti a generare impostazioni cultura CN3/CN4 perché i CN3/CN4 non esprimono p75NTRe non sono stati identificati altri marcatori CN3/CN4 specifici. Sono anche più piccole delle smin e, pertanto, più difficili da isolare in base alle dimensioni. Invece, studi in vitro di CN3 o CN4 si sono affidati a dissociati17,18 ,19,20,21, espianto17,22,23,24,25,26, e fetta27,28 culture, che sono composti da tipi di cellule eterogenee, e nessun protocollo sono esistiti per il isolamento e cultura dei CN3 primari o CN4.

In questo caso, viene descritto un protocollo per la visualizzazione, l'isolamento, la purificazione e la coltivazione di CN3, CN4 e SMN dello stesso giorno embrionale 11.5 (E11.5) IslMN:GFP topi transgenici29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con un GFP farnesillato che si localizza nella membrana cellulare. Questo protocollo consente il confronto di diversi tipi di motoneuroni per chiarire i meccanismi patologici nella malattia dei motoneuroni.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti che utilizzano animali da laboratorio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e con l'approvazione dell'Animal Care and Use Committee dell'Ospedale pediatrico di Boston.

1. Impostazione degli accoppiamenti a tempo prima della dissezione

  1. Per generare topi embrionali prenatali per il raccolto del motoneurone, pesare ogni topo femmina e impostare l'accoppiamento a tempo tra topi transgenici adulti IslMN:GFP 11,5 giorni prima del giorno dell'isolamento del neurone. Allo scopo di sviluppare questo protocollo, sono stati utilizzati topi 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP, di età compresa tra 2 e 9 mesi, e l'accoppiamento a tempo è stato istituito la sera.
  2. Esaminare i topi femminili per i tappi vaginali la mattina seguente. Si consideri la data in cui la spina viene identificata come giorno embrionale (E) 0.5.
  3. Pesare topi di sesso femminile ed esaminare i cuccioli utilizzando ultrasuoni (vedi Tabella dei materiali)tra E8.5-11. Verificare la presenza di segni di accoppiamento riuscito.
    1. Confermare il successo dell'accoppiamento rilevando l'aumento di peso nei topi di sesso femminile (di solito >1,5 g su E9.5 se ci sono più di 5/6 embrioni).
    2. Confermare visivamente gli embrioni sotto ecografia. Gli embrioni sono facilmente rilevabili dagli ultrasuoni dopo l'E9.5. Gli ultrasuoni sono condotti solo su femmine che hanno guadagnato peso perché sono più spesso incinte di quelle che non lo fanno.
      NOT: I topi femminili possono aumentare di peso per motivi diversi dalla gravidanza, quindi l'aumento di peso da solo non è un indicatore affidabile della gravidanza. La conferma degli ultrasuoni impedisce il sacrificio non necessario delle femmine che non sono incinte, ma non è cruciale se non disponibile.

2. Condizioni di dissezione e preparazione degli strumenti

  1. Eseguire tutti i rivestimenti (ad eccezione della pulizia degli acidi di coverlips), la preparazione dei supporti, la dissociazione dei tessuti (ad eccezione della centrifugazione e dell'incubazione) e il lavoro di coltura in un cofano a flusso laminare per garantire la sterilità dei media e dei neuroni motori embrionali.
  2. Con un'attenta attenzione alla tecnica sterile, condurre la dissezione dei tessuti al di fuori di una cappa di flusso laminare con un rischio minimo di contaminazione.
  3. Sterilizza una piastra di dissezione, un paio di forbici microdissecting, un paio di pinze per medicazione del pollice, due paia di dumont #5 pinzette, un coltello microdisseco e un cucchiaio perforato Moria mini immergendosi nel 70% di etanolo prima dell'uso.

3. PDL/Laminin Coating di piatti/Coverslips

NOT: Coltura dissociato neuroni motori primari in 96 bene o 24 pozzi piastre, a seconda del numero di cellule necessarie per l'applicazione. Le cellule possono essere immagini direttamente nella piastra di coltura dei tessuti senza l'uso di copricapi se i pozze sono otticamente trasparenti e gli spessori sono compatibili con l'imaging.

  1. Per le applicazioni che richiedono coverlips, preparare le coversi lavate con acido, sterilizzati e essiccati all'aria almeno 2 giorni prima dell'isolamento del neurone, come descritto in precedenza30. I lotti di coverlips possono essere preparati in questo modo con largo anticipo rispetto agli esperimenti e possono essere conservati fino a 6 mesi senza alcun impatto sulla qualità sperimentale.
  2. Preparare una soluzione di lavoro di 20 g/mL poly D-lysine (PDL) in salina tampina buffered fosfato (PBS) 2 giorni prima dell'isolamento del neurone.
    1. Aliquota (1 mg/mL) in anticipo e conservare a -20 gradi centigradi come soluzione di stock.
  3. Coprire la superficie di ogni coperchio o il pozzo della piastra di coltura dei tessuti con soluzione di lavoro sufficiente per la soluzione PDL (ad esempio, 100 -L per pozzo su 96 piastre di pozzo o 500 -L per pozzo su 24 lastre di pozzo con o senza copricoproe). Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
  4. Il giorno seguente lavare 3x con acqua sterilizzata.
    1. Sigillare le piastre con pellicola di paraffina e conservare le piastre rivestite in PDL lavate a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese se vengono essiccate completamente dopo il lavaggio finale.
  5. Preparate una soluzione di lavoro con 10 gradi di laminina (1,1,2 mg/mL) in 1,2 mL di PBS.
    1. Le scorte di laminina dell'Aliquota (1,1,2 mg/mL) in anticipo e conservate a -80 gradi centigradi.
  6. Coprire la superficie di ogni coperchio o bene con sufficiente soluzione di laminina per rivestire uniformemente la superficie. Incubare per almeno 2 h a 37 gradi centigradi prima dell'uso.
    NOT: Le piastre e i coprilabbra rivestiti in PDL/laminin a possono essere conservati fino a 1 settimana a 37 gradi centigradi, ma è preferibile laminina appena rivestita. Rimuovere la laminina direttamente prima della placcatura30. Lamiinina non dovrebbe essere lasciato asciugare. Se le lastre devono essere conservate per più di diverse ore, devono essere avvolte in pellicola di paraffina.

4. Preparazione di dissezione, Motor Neuron Culture Media e Soluzioni di dissociazione

NOT: Le concentrazioni tra parentesi indicano le concentrazioni finali di ciascun reagente.

  1. Preparare il mezzo di dissezione.
    1. Scongelare il siero di cavallo inattivato dal calore durante la notte a 4 gradi centigradi, preparare 1 mL e conservare a -20 gradi centigradi. Scongelare l'aliquota a RT direttamente prima dell'uso.
    2. Conservare B27-supplemento (50x) in 1 mL aliquote a -20 gradi centigradi. Scongelare gli aliquoti a RT immediatamente prima dell'uso. Evitare cicli di congelamento/scongelamento.
    3. Conservare il supplemento di glutammina (100x) a 4 gradi centigradi o -20 gradi centigradi. Dividere in 0,5 mLs se si conserva a -20 gradi centigradi.
    4. Conservare la penicillina-streptomycin (10.000 U/mL) in 1 mL a -20 gradi centigradi. Scongelare gli aliquoti a RT immediatamente prima dell'uso.
    5. Per rendere il mezzo di dissezione, mescolare 9,4 mL di Hibernate E con 200 l di siero di cavallo (2%), 200 l l di supplemento di 50x B27 (1x), 100 -L di supplemento di glutammina 100x (1x) (ad esempio, GlutaMAX) e 100 L di 10.000 U/mL penicillina-streptomicina (100 U/mL). Utilizzare questo mezzo per la raccolta di tessuti sezionati e la sospensione finale delle cellule dissociate.
    6. Aggiungere 500 l del mezzo di dissezione ai singoli tubi di microcentrifuga da 1,7 ml per la raccolta dei tessuti il giorno prima dell'isolamento del neurone. Preparare un tubo per ogni tipo di tessuto che verrà raccolto (ad esempio, controllo positivo, controllo negativo, CN3/CN4, SMN) e conservare a 4 gradi centigradi prima dell'uso.
    7. Combinare 49 mL di Hibernate E supporto a bassa fluorescenza con 1 mL di supplemento B27 (1x) e riempire una piastra 24 bene con questo mezzo (2 mL/bene) il giorno prima dell'isolamento del neurone. Utilizzare questo piatto per la raccolta di embrioni di topo. Conservare a 4 gradi centigradi prima dell'uso.
  2. Preparare il mezzo di coltura del motoneurone.
    1. Preparare 250 aliquote di 25 mM 2-mercaptoetanolo nel mezzo L15 di Leibovitz. Conservare a -20 gradi centigradi.
    2. Generare 5 aliquote di 100 g/mL di BDNF, CNTF e GDNF diluite in acqua sterilizzata. Conservare a -80 gradi centigradi e scongelare a RT immediatamente prima dell'uso.
    3. Preparare la soluzione forskolin da 10 mM aggiungendo 64 gradi di solforo dimetilo (DMSO) a 5 mg di forskolin e vortice per sciogliere completamente. Quindi aggiungere acqua sterilizzata (1.003 mL) alla soluzione DMSO e vortice bene. Conservare 12 aliquote di 10 m forskolin a -20 gradi centigradi e scongelare l'aliquota a RT immediatamente prima dell'uso.
    4. Preparare 12 aliquote di isobutylmethylxanthine (IBMX) diluite in DMSO. Conservare a -20 gradi centigradi e scongelare a RT immediatamente prima dell'uso.
    5. Per rendere il mezzo di coltura del motoneurone, mescolare 9,4 mL di mezzo neurobasale con 200 200 L di 50x B27 supplemento (1x), 100 -L di 100x integratore di glutammina (1x), 100 . Questo passaggio può essere eseguito fino a 1 giorno prima dell'isolamento del neurone.
    6. Poco prima dell'uso, aggiungere 1 lega ciascuno di 100 g/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) e GDNF (10 ng/mL) e 10L di 10 mM forskolin (10 m) e 10 -L di 100 mM IBMX (100 mM) al motoneurone medio. Preriscaldare il mezzo a 37 gradi centigradi.
  3. Preparare le soluzioni di dissociazione.
    1. Preparare la soluzione papain (20 U/mL papain e 0.005% DNase) e una soluzione di inibitore di albumin-ovomucoid (1 mg/mL ovomucoid inibitore, 1mg/mL albumin e 0.005% DNase) seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Preparare 500 aliquote di ciascuno degli inibitori ovomucoidi e soluzioni papaine e conservare a -80 gradi centigradi. Scongelare le aliquote a 37 gradi centigradi immediatamente prima dell'uso.

5. Midbrain ventrale e dissezione del midollo spinale

NOT: Eseguire tutti i passaggi seguenti, ad eccezione dei passaggi 5.1.1,1,1 e 5.1.5.5.1.6 sotto uno stereomicroscopio di dissezione di fluorescenza. Il tempo totale di dissezione per esperimento è tipicamente di 3/5 h, a seconda della competenza della tecnica di dissezione e del numero di motoneuroni necessari per ogni esperimento.

  1. Dissezione cerebrale ventrale
    1. Eutanasia un topo incinta circa 11,5 giorni dopo la fecondazione da gas di biossido di carbonio e lussazione cervicale.
    2. Spruzzare accuratamente l'addome con etanolo e rimuovere l'utero utilizzando forbici sterili microdissecting e pinze per medicazione del pollice. Lavare l'utero brevemente in PBS sterile, quindi trasferirlo sulla piastra di dissezione riempita con PBS sterile prefreddo.
    3. Rimuovere gli embrioni positivi di IslMN:GFPcon attenzione dall'utero utilizzando forbici sterili microdissecting, pinze per medicazione del pollice e pinzette #5 Dumont in PBS sterile ghiacciato sotto la luce brillante del microscopio. Utilizzando un cucchiaio sterile Moria mini-perforato, trasferire ogni embrione in un pozzo separato di un pozzo di 24 ben riempito con prechilled Hibernate-E low fluorescence medium integrato con 1x B27. Tenere il 24 ben piatto sul ghiaccio.
    4. Trasferire un embrione in una piastra sterile di dissezione e coprirlo completamente con la soluzione di sale bilanciato di Hank (HBSS) sterile a freddo ghiaccio (HBSS).
    5. Assicurarsi che i passaggi di dissezione siano eseguiti sotto l'illuminazione dell'isotociocinata fluoresceina (FITC) del microscopio. Utilizzando una pinzetta, rimuovere la coda e la faccia dell'embrione senza danneggiare il midbrain (Figura 2Ba). Posizionare l'embrione incline con arti a cavallo sotto e coda che puntano verso la parte anteriore del microscopio, verso il dissettore (indicato da un asterisco, Figura 2Bb).
    6. Utilizzando una pinzetta, aprire il tetto del quarto ventricolo al fine di generare una piccola apertura. Utilizzare questa apertura per agganciare le pinzette nello spazio creato tra il quarto ventricolo e il suo tetto. Dissezio lungo la superficie dorsale dell'embrione rostral alla corteccia e laterale alla piastra del pavimento e alla colonna motoria (Figura 2Ca,b). Aprire il tessuto sezionato in modo open-book per rivelare i nuclei CN3 e CN4 positivi alla GFP.
      NOT: Un piccolo pezzo di tessuto dal midbrain ventrale contenente mesenchyme, CN3 e CN4 sarà ora esposto.
    7. Separare con cura il midbrain ventrale dall'embrione e rimuovere il tessuto meningeo con una pinzetta e un coltello microdissecting. Dissezionare i nuclei bilaterali GFP-positivi CN3 e CN4 lontano dalla piastra del pavimento e altri tessuti circostanti GFP-negativi utilizzando pinzette e un coltello microdissecting (Figura 2D). Massimizzare il numero di neuroni motori GFP-positivi nel tessuto ascinato, ma evitare di toccarli o danneggiarli.
    8. Se si desidera una raccolta di nuclei CN3 e CN4 separati, tagliare lungo la linea mediana di questi due nuclei (linea tratteggiata gialla nella figura 2D). Utilizzando una pipetta P1000, raccogliere il tessuto midbrain ventrale sezionato con HBSS minimo e posizionarlo in un tubo di microcentrismo da 1,7 mL etichettato riempito con mezzo di dissezione (vedere il punto 4.1.5). Conservare sul ghiaccio fino alla dissociazione.
    9. Continuare a raggruppare i midbrain ventrali da embrioni aggiuntivi nello stesso tubo fino a quando il numero totale soddisfa il requisito sperimentale (fare riferimento al passaggio 8 per il numero di cellule ideali).
      NOT: Si raccomanda una raccolta di almeno 10 midbrain ventrali che producono circa 1 x 104 neuroni motori CN3/CN4 perché i tessuti sono soggetti a stress durante la dissociazione e lo smistamento.
  2. Dissezione del midollo spinale ventrale
    1. Mantenere l'embrione incline con la testa rivolta verso la parte anteriore del microscopio, verso il dissettore. Tenere l'embrione con una coppia di pinzette e inserire la punta dell'altra coppia di pinzette nella parte caudale non aperta del quarto ventricolo.
    2. Aprire il resto del cervello posteriore e del midollo spinale dorsalmente su tutta l'estensione rostrocaudale dell'embrione. Aperto tagliando il tessuto dorsale, partendo dal quarto ventricolo e lavorando verso il canale centrale del midollo spinale caudale utilizzando le pinze come forbici (Figura 2Ca,b). Fare attenzione a evitare di toccare o danneggiare il midollo spinale ventrale durante questa procedura.
    3. Tenere l'embrione con un paio di pinzette e pizzicare il lembo del tessuto dorsale su ogni lato con l'altra coppia di pinzette (Figura 2Ea,b).
      NOT: I tessuti dorsali eccitati contengono pelle dorsale, mesenchyme, gangli della radice dorsale (DRG), cervello posteriore dorsale e midollo spinale. Rimuovere la maggior parte di questi tessuti possibile senza danneggiare i nuclei SMN, perché sono adesivi e possono intrappolare le sregge durante il filtraggio o causare intasamento durante lo smistamento FACS.
    4. Rimuovere il midollo spinale ventrale utilizzando il coltello a microdissezione per forare direttamente sotto la SMN gFP-positiva. Sollevare il midollo spinale ventrale con movimenti sega-come su entrambi i lati(Figura 2Fa,b). Tagliare il midollo spinale ventrale galleggiante trasversalmente direttamente sopra C1, dove il primo corno anteriore GFP-positivo proietta (Figura 2G). Inoltre, tagliare trasversalmente al contorno superiore dell'arto inferiore (Figura 2G). Rimuovere la parte cervicale (C1)-lombare (L2-L3) del midollo spinale ventrale dopo questa procedura.
    5. Posizionare il lato dorsale del midollo spinale ventrale verso l'alto e tenere premuto premendo il tessuto negativo GFP tra le colonne SMN GFP-positive con una coppia di pinzette. Rimuovere il restante compostoda, DRG e midollo spinale dorsale tagliando entrambi i lati della colonna SMN GFP-positiva con il coltello a microdissezione (Figura 2H). Fare attenzione a massimizzare i motoneuroni GFP-positivi senza danneggiarli.
    6. Utilizzando una pipetta P1000, raccogliere il tessuto del midollo spinale ventrale sezionato con HBSS minima e posizionare nel tubo di microcentrifuga da 1,7 mL con etichetta SMN, riempito con mezzo di dissezione. Conservare sul ghiaccio fino alla dissociazione. Continuare a raggruppare i midollo spinali ventrali da embrioni aggiuntivi nello stesso tubo fino a quando il numero totale soddisfa i requisiti sperimentali.
      NOT: La raccolta di almeno tre midollo spinale ventrale che producono circa 2,1 x 104 SMN è raccomandata perché i tessuti sono soggetti a stress durante la dissociazione e lo smistamento.
    7. Raccogliere i motoneuroni facciali e le estremità degli embrioni di topo IslMN:GFP come controlli positivi alla GFP e GFP-negativi per lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS). Le estremità sono negative da GFP perché gli assoni negativi della GFP delle SBN non si sono ancora estesi fino alle estremità a questa età embrionale.

6. Dissociazione dei tessuti

NOT: Il tempo totale di dissociazione è in genere di 1,5 h per esperimento.

  1. La calda soluzione per papaina e inibizione dell'albumina-ovomucoide è a 37 gradi centigradi prima della dissociazione.
  2. Brevemente girare giù tessuti microdissected a bassa velocità.
  3. Utilizzando una pipetta P100, rimuovere con attenzione il maggior numero possibile di Hibernate E senza aspirare i tessuti.
    NOT: Assicurarsi di rimuovere tutti i residui Hibernate E dopo questo passaggio per evitare di ridurre l'efficacia della dissociazione papaina nel passaggio successivo.
  4. Aggiungere il volume appropriato della soluzione papaina (Tabella 1) a ciascuno dei tubi di microcentrifuga da 1,7 ml contenenti i campioni di tessuto microconcio.
    NOT: Il volume appropriato di papaina per la dissociazione è stato determinato al fine di massimizzare la dissociazione efficace riducendo al minimo lo stress sulle cellule.
  5. Triturare delicatamente 8x con una pipetta P200. Eseguire delicatamente tutti i passaggi di triturazione per preservare la vitalità del motoneurone.
  6. Incubare i tubi contenenti i tessuti per 30 minuti a 37 gradi centigradi, agitando con le dita segnando 10 volte ogni 10 minuti. triturare delicatamente ciascuna sospensione 8x con una pipetta P200 dopo l'incubazione. Girare verso il basso le cellule a 300 x g per 5 min.
  7. Per garantire l'efficacia dell'inibizione degli ovomucoidi nella fase successiva, utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere e scartare il maggior numero possibile di supernatali senza aspirare i tessuti.
  8. Resuspend pellets nel volume appropriato della soluzione inibitore albumin-ovomucoid (Tabella 1) triturando delicatamente 8x con una pipetta P200.
  9. Attendere 2 min per consentire a eventuali pezzi rimanenti di tessuto non sociatto di depositarsi sul fondo del tubo.
  10. Raccogli il maggior numero possibile di supernatali senza aspirare tessuti non dissociati usando una pipetta P200. Trasferire il supernatante ai tubi di microcentrifuga freschi da 1,7 mL.
  11. Se alcuni pezzi di tessuto rimangono non divulgati dopo il passaggio 6.10, ripetere i passaggi 6.8-6.10 per i tessuti non dissociati che rimangono nei tubi originali di microcentrifuga da 1,7 mL per massimizzare la resa finale delle cellule dissociate riducendo al minimo lo stress sulle cellule dissociato in precedenza, contenuto nel sovrlente del passo 6.10.
  12. Ruotare le celle a 300 x g per 5 min. rimuovere e scartare con attenzione il supernatante utilizzando una pipetta P1000.
  13. Risospendere il pellet nel volume appropriato del supporto di dissezione (Tabella 1) tramite pipetta 8x utilizzando una pipetta P1000. Il volume appropriato della sospensione finale è stato determinato in modo che la densità cellulare non superi 107 celle/mL, che possono bloccare il flusso della macchina di citometria di flusso, ma anche in modo che le cellule non siano eccessivamente diluite, il che si traduce in una velocità di selezione rallentata.
  14. Filtrare le sospensioni attraverso ceppi cellulari da 70 m per eliminare eventuali grossi grumi o tessuti non digeriti. Trasferire le sospensioni in provette in polistirolo rotondo da 5 mL e conservarle sul ghiaccio fino a quando necessario.

7. Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)

NOT: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando una selezionatrice FACS dotata di un laser viola da 15 mw 405 nm, un laser blu da 100 mw 488 nm, un laser arancione da 75 mw da 594 nm e un laser rosso da 40 mw 640 nm. Le cellule sono state ordinate come liquido di fasiaglia in PBS sterile in condizioni asettiche attraverso un ugello di 100 m. Al fine di ridurre al minimo lo stress cellulare, la portata è stata impostata su una pressione del campione di 1/3, in modo che sia stato acquisito un massimo di 1.000-4.000 eventi al secondo. Il tempo totale faCS è in genere di 1 h per esperimento.

  1. Impostare le tensioni per la dispersione in avanti e laterale in modo che la popolazione cellulare possa essere visualizzata correttamente. L'impostazione di tensioni appropriate per lo smistamento delle celle è complessa e richiede un operatore FACS esperto.
  2. Per distinguere le diverse popolazioni di cellule, tracciare le celle in base alle dimensioni determinate dall'area di dispersione in avanti (FSC-A) rispetto alla complessità interna determinata dall'area di dispersione laterale (SSC-A). Disegnare un cancello intorno alle celle vive come indicato nella figura 3Aa e Figura Ba per escludere detriti e cellule morte. Raggruppare le celle all'interno della regione recintata come popolazione 1 (P1).
  3. Per escludere i ggdi e i doppi e i doppi e i doppi, tracciare le celle P1 successivamente in base alla larghezza di dispersione laterale (SSC-W) rispetto alla SSC-A. Cancellare la popolazione di singole celle come popolazione 2 (P2) (Figura 3Ab e Figura Bb).
  4. Tracciare le celle P2 in base alla larghezza della dispersione in avanti (FSC-W) rispetto all'FSC-A e a classificare la popolazione delle singole celle come popolazione 3 (P3)(Figura 3Ac e Figura Bc).
    NOTA: l'uso di due gate consecutivi in 7.3 e 7.4 esclude i gruppi cellulari e i doppietti (alto FSC-W e alto FSC-A).
  5. Celle Gate P3 basate su GFP contro allophycocyanin (APC). Il canale APC rileva l'autofluorescenza. Gating su questo canale evita di catturare celle autofluorescenti. Utilizzare celle negative GFP per regolare la tensione per i canali fluorescenti FITC/GFP. Idealmente, porte di posizione per queste popolazioni di cellule intorno a 102. Selezionare le soglie di gate per la popolazione GFP-positiva 4 (P4) singolarmente per ogni tipo di motoneurone(Figura 3Ad e Figura Bd).
    NOT: Impostare il gate GFP molto più alto per le SM che per i CN3/CN4 per ottenere una cultura pura (Figura 3Ad e Figura Bd). Una porta GFP inferiore per le colture SMN porta alla contaminazione delle colture da parte di glia e neuroni non motori. Questo è probabile perché c'è espressione GFP di basso livello in alcuni valori glia e non-motore a causa di un promotore che perde. La percentuale di cellule GFP-positive rispetto alle celle totali è in genere 0,5,1,5% per CN3/CN4 e 1,5,2,5% per le smog. Se la dissezione ha avuto esito positivo, questi numeri possono essere utilizzati come punto di riferimento per determinare la posizione appropriata per il cancello gFP-positivo (Figura 3Ae e Figura Be).
  6. Eseguire FACS in base al protocollo del produttore. Raccogliere le cellule P4 in tubi freschi di microcentrifuga da 1,7 mL riempiti con 500 - L di mezzo di coltura del motoneurone. Conservare sul ghiaccio fino a quando non placcatura.
    NOT: Anche se le cellule possono essere ordinate direttamente nei pozzi, questo si traduce in un numero irregolare di cellule per bene. Ordinare le cellule in tubi di microcentrifuga da 1,75 mL e quindi piastrare manualmente per ottenere una distribuzione di placcatura più uniforme.

8. Cultura dei Motoneuroni primari purificati

  1. Diluire le sospensioni FACS-isolated CN3/CN4 e SMN con motore di coltura del motoneurone medio preriscaldato a 37 gradi centigradi a densità di 5 x 103 e 1 x 104 cellule/mL, rispettivamente.
    NOT: Un embrione E11.5 produce circa 1 x 103 CN3/CN4 e 7 x 103 SMN. Tuttavia, questi rendimenti dipendono fortemente dalla purezza dei tessuti sezionati, dalla completezza della dissociazione cellulare e dall'appropriata soglia dei cancelli GFP durante la FACS.
  2. Trasferire 96 piastre di pozzo prerivestite con PDL e laminina dall'incubatrice di coltura dei tessuti 37 gradi centigradi al cofano a flusso laminare e alla lamininina aspirata da ogni pozzo. Utilizzare piastre e coprilabbra immediatamente senza lavaggio.
  3. Aggiungere 200 l di sospensioni diluite CN3/CN4 e SMN in ogni pozzo di 96 lastre di pozzo rivestite in PDL/laminin. Densità di cellule finali devono essere 1 x 103 e 2 x 103 cellule / bene per CN3 / CN4 e SMN, rispettivamente.
    NOT: La densità di placcatura iniziale delle SMN in 96 pozzetti (2 x 103 celle/pozzo) è doppia quella di CN3s/CN4s (1 x 103 cellule/pozzo) al fine di ottenere numeri di motoneuroni finali simili e densità a 2 e 9 giorni in vitro (DIV) (rispettivamente 4x6 x 102 x 10 x 102 celle).
  4. Neuroni della coltura in un incubatore di 37 gradi centigradi, 5% di CO2.
  5. Alimentare i neuroni ogni 5 giorni rimuovendo metà dei vecchi supporti (100 l) e sostituendo con lo stesso volume di mezzo di coltura del motoneurone fresco. Assicurarsi che i processi neuronali diventino visibili su 1 DIV e diventino più spessi e più lunghi di 14 DIV (Figura 4). I corpi cellulari neuronali si ingrandiscono e tendono ad aggregarsi nelle colture a lungo termine, in particolare per le sMN (Figura 4).
    NOT: Eseguire tutte le modifiche medie e di soluzione lasciando metà del volume medio originale per evitare lo scollegamento delle celle coltivate. Questo include passaggi di fissazione e immunocitochimica (ICC). Se tutti i supporti vengono rimossi, indipendentemente dalla delicatezza della maggior parte delle cellule si staccheranno e vengono lavati via.

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Risultati

L'obiettivo di questo protocollo era quello di purificare e coltura sia i CN3/CN4 primari a lungo termine che le SMN a lungo termine per consentire analisi comparative dei meccanismi alla base dei disturbi del motoneurone (vedere Figura 1 e Figura 2 per una panoramica).

Una volta che i neuroni sono stati isolati con successo e cresciuti in coltura, quasi puro primario C...

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Discussione

Storicamente, gli studi in vitro dei motoneuroni CN3 e/o CN4 si sono affidati a culture eterogenee come dissociate17,18,19,20,21, espiantare17,22,23,24,25,26e tagl...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) per l'istruzione nelle tecniche di dissezione SMN; il Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, il Centro di Citometry di flusso della divisione immunologia della Harvard Medical School, il Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core e il Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility per l'isolamento FACS dei motovini primari; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membri del laboratorio Engle aggiuntivi e membri del consorzio Project ALS per assistenza tecnica e discussione ponderata. Questo studio è stato sostenuto dal Progetto SLA. Inoltre, R.F. è stato finanziato dalla Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad e dalla NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. è stato supportato dal programma di formazione NIH/NEI nelle basi molecolari delle malattie oculari (5T32EY007145-16) attraverso lo Schepens Eye Research Institute e lo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) attraverso il Boston Children's Hospital; M.C.W è stato supportato da NEI (5K08EY027850) e Children's Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e E.C.E. è un investigatore dell'Howard Hughes Medical Institute.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 488-capra coniugata anti-topo IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-coniugato F(ab')2 capra anti-coniglio IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Integratore (50x), senza sieroThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow CytometerBD Bioscience- Questo ha 4 sistemi laser dotati di laser da 405, 488, 594 e 640 nm.
BD Falcon 70μ m Filtri cellulari in nylonCORNING352350Per filtrare le cellule dissocianti prima del FACS.
Provette a fondo tondo BD Falcon con tappo a scattoCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
Micropiastra per colture cellulari, 96 pozzetti, PS, fondo F (pozzetto camino)Greiner Bio-One International655090Abbiamo provato più piastre da 96 pozzetti e questa è stata la migliore per la coltura e le analisi dopo ICC
Occhiali di copertura circolari per microscopiaKarl Hecht & Assistent1001/14Abbiamo utilizzato questo vetrino coprioggetti poiché l'area era ampia (diametro: 14 mm).
CNTF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-272
Acido ciclopiazonico da Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA. Uno dei fattori di stress del pronto soccorso.
4′,6-diamidino-2-fenilinodele (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Dimetil solfossidoSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 Pinze Inox Dimensioni della punta 0,05 mm x 0,01 mm Punte BiologieStrumento chirurgico RobozRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-305
GlutaMAX integratoreThermo Fisher Scientific35050-061
Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Ibernazione EBrainBitsHE
Ibernazione E a bassa fluorescenzaBrainBitsHELFLa fluorescenza che ostacola l'osservazione dell'espressione GFP dell'embrione deve essere bassa.
Siero di cavallo, inattivato a caldo, origine neozelandeseThermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Isobutilmetilxantina
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz' s L15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM6250
Forbici per micro dissezioneStrumento chirurgico RobozRS-5913
Micro coltello 4,75" lama da 1,7 mm x 27 mmStrumento chirurgico RobozRS-6272
Moria Mini cucchiaio perforatoStrumenti per la scienza10370-19
Anticorpo monoclonale di topo contro la classe neuronale III β-tubulina (TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti microscopio a fluorescenza per cellule vive e software Elementsimmagini di contrasto per interferenza differenziale Nikon e le immagini immunocitochimiche delle colture cellulari sono state catturate con queste apparecchiature
Acido nitrico 90%, Fuming (ACS certificato)Fisher ScientificA202-212Per il risciacquo dei vetrini coprioggetti
Olympus 1.7 mL Microtubes, ClearGenesee Scientific22-281Queste sono le provette che abbiamo descritto come "provette per microcentrifuga da 1.7 mL" nel contesto.
sistema di dissociazione della papainaWorthington Biochemical CorpLK003150la soluzione di papaina e la soluzione di inibitore dell'alubumina-ovomucoide.
Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly D-lysin (PDL)MilliporeSigmaA-003-E
Anticorpo monoclonale di coniglio contro Islet1Abcamab1095171:200
SMZ18 e SMZ1500 stereomicroscopi zoom con DS-Ri1 è stata eseguita la dissezione con telecameraNikone le immagini di embrioni e tessuti sezionati vengono catturate con questi microscopi a fluorescenza.
Sylgard 170 Incapsulante in silicone nero - Kit A+B da 0,9 kgDow Corning1696157Produciamo piatti di dissezione utilizzando questo kit.
Piastre trattate TC, 100 mm x 20 mmGenesee Scientific25-202Realizziamo piastre di dissezione utilizzando questa piastra.
Pinze per medicazione Thum 4,5" seghettate Larghezza punta 2,2 mmStrumento chirurgico RobozRS-8100
per LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSPer ultrasuoni su topi femmina
Ecografo veterinarioGE HealthcareLOGOQ e VETPer ultrasuoni su topi femmina
Microscopio confocale a scansione laser Zeiss serie LSM 700 e Zen SoftwareCarl Zeiss-L'immagine confocale dell'embrione è stata catturata con queste apparecchiature
Le Da questo kit vengono preparati il Trasduttore

Riferimenti

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