Articolo metodologico

Aumentare la durabilità delle colture di cellule neurali dissociate utilizzando la matrice corallina biologicamente attiva

DOI:

10.3791/60443

⸱

3 giugno 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La coltura cellulare ippocampale dissociata è uno strumento sperimentale fondamentale nelle neuroscienze. La sopravvivenza e la funzione delle cellule neurali in coltura sono migliorate quando gli scheletri corallini sono usati come matrici, a causa dei loro ruoli neuroprotettivi e neuromodulativi. Quindi, le cellule neurali cresciute sulla matrice corallina mostrano una maggiore durata e quindi sono più adeguate per la coltivazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le colture di cellule neuronali e gliali dissociate dell'ippocampo sono un prezioso modello sperimentale per studiare la crescita e la funzione neurale fornendo un elevato isolamento cellulare e un ambiente controllato. Tuttavia, la sopravvivenza delle cellule ippocampali in vitro è compromessa: la maggior parte delle cellule muore durante la prima settimana di coltura. È quindi di grande importanza identificare modi per aumentare la durata delle cellule neurali in coltura.

Il carbonato di calcio sotto forma di aragonite cristallina derivata dallo scheletro dei coralli può essere utilizzato come matrice attiva superiore per colture neurali. Nutrendo, proteggendo e attivando le cellule gliali, lo scheletro di corallo migliora la sopravvivenza e la crescita di queste cellule in vitro meglio di altre matrici.

Questo protocollo descrive un metodo per coltivare cellule ippocampali su una matrice corallina. Questa matrice viene generata attaccando granelli di scheletri di corallo a piatti di coltura, fiaschi e vetrine. I grani aiutano a migliorare l'ambiente delle cellule introducendole in un ambiente tridimensionale (3D) per crescere e formare strutture simili ai tessuti. L'ambiente 3D introdotto dallo scheletro di corallo può essere ottimizzato per le cellule mediante macinazione, che consente il controllo sulla dimensione e la densità dei grani (cioè la rugosità della matrice), una proprietà che è stata trovata per influenzare l'attività delle cellule gliali. Inoltre, l'uso dei grani facilita l'osservazione e l'analisi delle colture, soprattutto quando si utilizza la microscopia ottica. Quindi, il protocollo include procedure per la generazione e l'ottimizzazione della matrice corallina come strumento per migliorare il mantenimento e la funzionalità delle cellule neurali in vitro.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le colture di cellule neurali dissociate, in questo caso cellule ippocampali, sono un valido modello sperimentale per studiare la crescita e la funzione neurale fornendo un elevato isolamento cellulare e accessibilità 1,2,3. Questo tipo di coltura è frequentemente utilizzato nelle neuroscienze, nello sviluppo di farmaci e nell'ingegneria tissutale a causa della grande quantità di informazioni che possono essere raccolte, come tassi di crescita e vitalità, neurotossicità, crescita e networking dei neuriti, connettività sinaptica e plasticità, modifiche morfologiche, organizzazione e cablaggio dei neuriti, ecc.1,4,5,6,7.

Nonostante l'importanza delle colture, le cellule coltivate sono solitamente costrette a crescere su vetrini in un monostrato bidimensionale. Queste rigide modifiche ambientali riducono significativamente la capacità delle cellule neurali di sopravvivere nel tempo, perché i vetrini di copertura sono substrati non nutritivi con una bassa forza di adesione, esibendo una minore capacità di sostenere la crescita cellulare 8,9,10,11.

Poiché le cellule neurali coltivate sono costrette a crescere in condizioni difficili, un approccio essenziale per migliorare la loro sopravvivenza sarebbe quello di imitare il loro ambiente naturale il più possibile12,13. Ciò potrebbe essere ottenuto utilizzando biomateriali che agiranno come matrici e imiteranno la matrice extracellulare delle cellule, consentendo loro di formare una struttura simile a un tessuto e assistere nel loro nutrimento14.

L'uso di biomateriali è un approccio promettente per migliorare le colture cellulari, perché agiscono come scaffold biocompatibili, fornendo stabilità meccanica e migliorando una varietà di proprietà cellulari, tra cui adesione, sopravvivenza, proliferazione, migrazione, morfogenesi e differenziazione15,16,17. Diversi tipi di biomateriali sono utilizzati per migliorare le condizioni delle cellule in vitro. Tra questi ci sono i biopolimeri o componenti biologici che di solito fanno parte della matrice extracellulare delle cellule. Questi biomateriali sono utilizzati principalmente come forma di agenti di rivestimento polimerizzati o idrogel18,19,20. Da un lato, le matrici sopra menzionate danno alle cellule un ambiente 3D familiare in cui crescere, incoraggiano la loro adesione al piatto e danno loro supporto meccanico21,22. D'altra parte, la loro forma polimerizzata e il confinamento delle cellule all'interno degli idrogel disturba l'accesso delle cellule ai componenti nutritivi presenti nei mezzi di crescita e rende anche più difficile il follow-up delle cellule con metodi microscopici23.

Gli esoscheletri corallini sono matrici biologiche di origine marina. Sono fatti di carbonato di calcio, hanno stabilità meccanica e sono biodegradabili. Studi precedenti che utilizzavano lo scheletro di corallo come matrice per la crescita di cellule neurali in coltura hanno mostrato un'adesione molto maggiore, rispetto ai vetrini24,25. Inoltre, le cellule neurali cresciute sullo scheletro di corallo hanno dimostrato la loro capacità di assumere il calcio di cui è composto lo scheletro, che protegge le cellule neurali in condizioni di privazione di nutrienti26. Inoltre, lo scheletro di corallo è una matrice di supporto e nutrimento che aumenta la sopravvivenza delle cellule neurali, incoraggia la formazione di reti neurali, eleva il tasso di connettività sinaptica e consente la formazione di strutture simili a tessuti27,28. Recenti studi hanno anche dimostrato che la topografia superficiale della matrice dello scheletro di corallo gioca un ruolo cruciale nella distribuzione e nell'attivazione delle cellule gliali 8,29. Inoltre, lo scheletro di corallo è efficace come matrice per la coltivazione di altri tipi cellulari, come gli osteociti30,31, gli epatociti e i cardiomiociti in coltura (dati non pubblicati).

Quindi, lo scheletro di corallo è una matrice promettente per la coltivazione di cellule in vitro. Pertanto, il protocollo descritto di seguito descrive la tecnica di coltivazione di cellule neurali su scheletro di corallo per produrre colture neurali più stabili e prospere di quelle ottenute con i metodi esistenti. Questo protocollo può anche essere utile per la coltivazione di cardiomiociti, epatociti e altri tipi di cellule.

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Protocollo

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L'uso di animali in questo protocollo è stato approvato dal National Animal Care and Use Committee.

NOTA: Gli scheletri di corallo carbonato di calcio devono essere usati nella forma cristallina di aragonite. I tipi di corallo testati finora per le colture neurali sono Porites Lutea, Stylophora Pistillata e Trachyphyllia Geoffroyi. Gli scheletri possono essere acquistati interi o macinati.

1. Pulizia dei pezzi dello scheletro di corallo

ATTENZIONE: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in una cappa chimica a temperatura ambiente, poiché le soluzioni descritte di seguito sono pericolose e possono causare ustioni e irritazioni.

  1. Usa un martello per rompere lo scheletro di corallo e dividerlo in frammenti di 0,5-2 cm. Per sciogliere i residui organici e non organici, immergere i frammenti dello scheletro di corallo in una soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per 10 minuti, quindi lavare una volta con acqua distillata doppia (DDW).
  2. Per rimuovere i residui organici rimanenti, immergere i frammenti in una soluzione 1M NaOH per 5 minuti, quindi lavare una volta con DDW. Continuare con la rimozione dei depositi organici immergendo i frammenti in soluzione di H 2O 2al 30% per 10 minuti, quindi lavare i frammenti 3x con DDW.
  3. Rimuovere quanto più DDW in eccesso possibile e lasciare asciugare i frammenti di corallo nel cappuccio (1-8 ore).

2. Pulizia dei vetrini

  1. Trasferire i coperchi di vetro in una capsula di Petri di vetro da 100 mm. Aggiungere 10 ml di etanolo al 95% per 15 minuti.
  2. Rimuovere l'etanolo e lavare con DDW 3x, aspettando 10 minuti tra ogni lavaggio. Posizionare il piatto su una piastra riscaldante preriscaldata a 80 °C fino a quando il DDW evapora. Mescolare delicatamente i coperchi all'interno del piatto più volte mentre si asciugano per evitare che si attacchino l'uno all'altro.
  3. Autoclavare i coprivetrini.

3. Preparazione dei grani dello scheletro di corallo

  1. Macinare i frammenti dello scheletro di corallo usando un mortaio e un pestello (macinazione manuale) fino alla completa rottura. Il risultato è una miscela di grani con dimensioni comprese tra 20 μm e 200 μm.
  2. In alternativa, macinare i frammenti dello scheletro di corallo utilizzando una rettificatrice elettrica a una velocità di 1.000 giri / min per 30 s (lunghezza della lama = 6 cm; larghezza = 0,5 cm-1,0 cm). La granulometria risultante è simile alla gamma di dimensioni prodotta dalla macinazione manuale.

4. Purificazione dei grani di una gamma granulometrica specifica

NOTA: se si desidera controllare la dimensione dei grani in una matrice, utilizzare la seguente procedura di purificazione del grano basata sulla filtrazione.

  1. Trasferire i grani su un filtro manuale o elettrico da 40 μm.
  2. Dividere i grani in due intervalli specifici setacciando i grani attraverso il filtro (se si utilizza un filtro elettrico, si raccomandano le seguenti condizioni: scuotimento = 600 ampiezze / min, rimbalzo = 6 / s). Questa procedura produce due gruppi di granulometrie, uno <40 μm e il secondo >40 μm.
    NOTA: le due dimensioni possono essere determinate utilizzando filtri di maglie diverse. Se si desidera un intervallo più ristretto, selezionare nuovamente ciascun gruppo dal punto 4.2 attraverso filtri con maglie diverse.
  3. Autoclavare i grani.

5. Preparazione di piatti o coprivetrine rivestiti di grani di corallo

  1. Per il rivestimento di palloni, piastre o piastre di Petri
    NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti in condizioni sterili.
    1. Aggiungere i grani dello scheletro di corallo in una soluzione di poli-D-lisina (PDL) da 20 μg/mL disciolta nella soluzione di Hanks. La concentrazione raccomandata è di 5 mg/10 mg di grani per 1 mL di soluzione PDL.
    2. Versare la soluzione in matraccio e piatti (circa 2 ml/25 cm2) e incubare per una notte a 4 °C. I grani affondano e si attaccano al fondo.
    3. Il giorno dopo, lavare le borracce e i piatti una volta con DDW sterile. Lasciare asciugare le fiasche e i piatti nel cappuccio.
      NOTA: È preferibile utilizzare fiaschi e piatti appena rivestiti. I palloni e i piatti rivestiti possono essere utilizzati fino a una settimana dopo il rivestimento se conservati a 4 °C. Tuttavia, l'efficacia della matrice può essere compromessa.
  2. Rivestimento vetrini (diametro 12 mm, spessore 0,17 mm)
    1. Aggiungi grani di scheletro di corallo a DDW a qualsiasi concentrazione desiderata. Le densità comuni utilizzate per le cellule neurali sono 5 mg/ml e 10 mg/ml. Versare 40 μL della soluzione di grani al centro del vetrino di copertura (Figura 4).
    2. Posizionare i vetrini su una piastra riscaldante preriscaldata a 80 °C e attendere la completa evaporazione (di solito 15 min). In queste condizioni, i grani aderiscono al coprifoglio. Autoclavare i coprivetrini rivestiti. Conservare in condizioni sterili.
    3. Un giorno prima della cultura, posizionare i vetrini sul coperchio di una piastra sterile da 24 pozzetti. Aggiungere 100 μL di soluzione PDL da 20 μg/mL a ciascun vetrino. Utilizzare la punta per assicurarsi che il liquido copra l'intera regione del grano e il resto della superficie del coprifoglio.
    4. Coprire il coperchio con il fondo del piatto. Avvolgere i lati dei piatti con pellicola di paraffina. Incubare per una notte a 4 °C.
    5. Il giorno dopo, lavare una volta con DDW e asciugare nel cappuccio.
      NOTA: È preferibile utilizzare copertine appena rivestite.

6. Coltivazione di cellule dissociate ippocampali su vetrine rivestite di grani di corallo

NOTA: Il metodo per la coltura cellulare dissociata dell'ippocampo è stato modificato rispetto alle procedure precedentemente pubblicate24,27. La preparazione della cultura è descritta per quattro cuccioli di ratto. La resa attesa da ciascun ippocampo è di 1-1,5 x 106 cellule.

  1. Apparecchio
    1. Preparare una capsula di Petri vuota da 60 mm. Versare 2 ml di mezzo essenziale minimo (MEM) in una capsula di Petri da 60 mm e mettere su ghiaccio.
    2. Versare 2 mL di MEM in un piatto da 35 mm e metterlo in un incubatore a 37 °C, 5-10% CO2. Versare 2 mL di MEM in una provetta da 15 mL e mantenerla a 4 °C.
    3. Versare 1 mL di First Day Medium in un tubo da 15 mL e metterlo in un incubatore a 37 °C, 5-10% CO2.
      NOTA: La composizione del mezzo del primo giorno è descritta nella tabella dei materiali.
    4. Scongelare 200 μL di una soluzione di tripsina al 2,5% e incubare a 37 °C.
    5. Preparare tre pipette Pasteur in vetro con teste da 0,5 mm, 0,75 mm e 1,0 mm di diametro utilizzando una fiamma.
    6. Preparare strumenti chirurgici adeguati: una grande forbice, due piccole forbici, una grande pinzetta, quattro piccole pinzette e un bisturi.
    7. Preparare uno stereomicroscopio nel cappuccio.
  2. Usando una grande forbice, sacrifica cuccioli di ratto Sprague Dawley di 0-3 giorni separando le loro teste dai loro corpi in una capsula di Petri vuota da 60 mm (passo 6.1.1). Smaltire i corpi.
  3. Raccogli la testa tenendola dalla bocca con una grande pinzetta. Taglia la pelle che copre il cranio con una piccola forbice.
  4. Con una forbice pulita, entra sotto il cranio (sul lato del cervelletto) e taglia il cranio a destra e a sinistra per consentirne la rimozione. Usando una piccola pinzetta, staccare il cranio dal cervello.
  5. Con una pinzetta pulita, separare il cervello dalla testa e metterlo in una capsula di Petri da 60 mm contenente 2 ml di MEM freddo (vedere punto 6.1.2).
  6. Usando due piccole pinzette, sezionare l'ippocampo sotto uno stereomicroscopio. Trasferire l'ippocampo nel piatto preparato da 35 mm (dal punto 6.1.2) contenente MEM.
    NOTA: i passaggi da 6.3 a 6.6 devono essere ripetuti per ogni cucciolo.
  7. Tagliare l'ippocampo a fette di circa 1 mm usando il bisturi. Aggiungere 200 μL della soluzione di tripsina (diluita ad una concentrazione finale dello 0,25%). Mescolare delicatamente e incubare a 37 °C, 5-10% CO2 per 30 minuti.
  8. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 mL di MEM freddo (punto 6.1.2) al piatto per disattivare la tripsina. Trasferire il tessuto tripsinizzato in una provetta da 15 mL contenente 1 mL di Primo Giorno di Mezzo preriscaldato a 37 °C (punto 6.1.3) utilizzando la pipetta Pasteur in vetro con il diametro maggiore (fase 6.1.5).
    NOTA: Il miglior rapporto mezzo-tessuto (v:v) per un'ulteriore lavorazione del tessuto è di 1 mL/8 ippocampi. Evitare il più possibile di trasferire il mezzo con il tessuto.
  9. Triturare il tessuto facendolo passare attraverso la pipetta di vetro di diametro maggiore 10-15 volte. Quindi, ripetere questo processo utilizzando la pipetta di vetro con il diametro medio. Continuare a triturare con la pipetta di diametro più piccolo. Evitare il gorgogliamento per ridurre la morte cellulare.
  10. Lasciare affondare i pezzi di tessuto rimanenti per 2-5 minuti, quindi trasferire il surnatante in un altro tubo da 15 ml. Contare le cellule usando un emocitometro.
    NOTA: La densità cellulare preferibile è 200.000-400.000 cellule/ml. Utilizzare First Day Medium per diluire o centrifugare a 470 x g per concentrare le cellule.
  11. Seminare 100 μL di cellule su ogni vetrino. Durante la semina, assicurati di coprire l'intero coprislip con le celle. Incubare a 37 °C, 5–10% CO2.
  12. Il giorno successivo, aggiungere 500 μL di terreno di crescita neuronale ai pozzetti.
    NOTA: La composizione del Terreno di Crescita Neuronale è descritta nella Tabella dei Materiali.
  13. Trasferire delicatamente ogni coprislip nel suo pozzetto appropriato usando una pinzetta mentre si rimuove il First Day Medium inclinando il coprifoglio. Aspirare il supporto rimanente dal coperchio.
  14. Incubare a 37 °C, 5–10% CO2. Evitare di sostituire il mezzo durante l'incubazione. Le colture possono essere mantenute in queste condizioni fino a 1 mese. La preoccupazione principale è l'umidità. Pertanto, assicurarsi di mantenere l'incubatore umidificato al massimo.

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Risultati

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Al fine di preparare la matrice dello scheletro di corallo, l'intero scheletro di corallo (Figura 1A) è stato rotto in frammenti di 0,5-2 cm usando un martello (Figura 1B) e accuratamente pulito dai residui organici attraverso tre fasi (fase 1 del protocollo) utilizzando una soluzione di ipoclorito al 10%, una soluzione di NaOH al 10% e una soluzione di H 2 O2al 30% (Figura 1C). I frammenti di corallo sono stat...

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Discussione

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La tecnica qui presentata descrive un modo per migliorare il mantenimento e la funzionalità delle cellule neurali in coltura. Ciò si ottiene facendo aderire le cellule a una matrice fatta di grani di scheletro di corallo che nutre le cellule e ne promuove la crescita e l'attività. L'uso di questa tecnica aumenta la capacità del modello di coltura neurale di imitare l'ambiente delle cellule nel cervello.

L'introduzione della matrice come substrato di coltura presenta diversi vantaggi rispetto a...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dal programma KAMIN del Ministero del Commercio e del Lavoro israeliano e da Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, Stati Uniti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre a 24 pozzettiGreiner#60-662160
B-27Gibco#17504-044
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma#A4503
D – glucosioSigma#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)Sigma#D5796
Setaccio elettricoAri Levy#3700
Fetale Bovino Serun (FBS)Industrie Biologiche#04-007-1A
Primo Giorno Medio85,1% Minimo Essenziale Aquila' (MEM), 11,5% siero fetale bovino inattivato termicamente, 1,2% L-glutammina e 2,2% D-glucosio.
FiascheGreiner#60-69016025cm^2, Coltura tissutale trattata
Fluoro-deossi-uridinaSigma#F0503
Vetrini coprioggettiMenzel-Glaser#BNCB00120RA1
H2O2Romical#007130-72-19Miscela di
nutrienti F-12 di prosciuttoSigma#N4888
Soluzione di HANK'sSigma#H6648
Acido chinurenicoSigma#K3375
L - glutamminaSigma#G7513
Filtro manuale (40µ m)VWR#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)Sigma#M2279
Mortaio e pestelloDe-Groot4-P090
NaClO (ipoclorito di sodio)Sigma#425044Pericoloso
NaOHSigma#S8045
Pericoloso mezzodi crescita neuronale45% MEM, 40% terreno dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM), 10% miscela di nutrienti F-12 Ham, 0,25% (p/v) albumina sierica bovina (BSA), 0,75% D-glucosio, 0,25% L-glutammina, 0,5% integratore di B-27, 0,1% acido chinurenico, 0,01% di 70% di uridina e 30% di fluoro-deossi-uridina.
Piastra PetriGreiner#60-628160, #60-62716060mm, 35mm, rispettivamente.
Poly D – LysineSigma#P7280
Smart Dentin GrinderKometaBio#GR101
TrypsinGibco#15-090-046
UridinaSigma#U3750
pericoloso

Riferimenti

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