Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza per l'isolamento delle popolazioni cellulari Scleractiniane

Summary

I coralli creano ecosistemi di biodiversità importanti sia per l'uomo che per gli organismi marini. Tuttavia, ancora non comprendiamo il pieno potenziale e la funzione di molte cellule coralline. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato per l'isolamento, l'etichettatura e la separazione delle popolazioni di cellule coralline rocciose.

Abstract

Le barriere coralline sono minacciate da fattori di stress antropogenici. La risposta biologica del corallo a questi fattori di stress può verificarsi a livello cellulare, ma i meccanismi non sono ben compresi. Per studiare la risposta dei coralli ai fattori di stress, abbiamo bisogno di strumenti per analizzare le risposte cellulari. In particolare, abbiamo bisogno di strumenti che facilitino l'applicazione di saggi funzionali per capire meglio come le popolazioni cellulari reagiscono allo stress. Nello studio attuale, utilizziamo lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) per isolare e separare diverse popolazioni di cellule nei coralli rocciosi. Questo protocollo comprende: (1) la separazione dei tessuti del corallo dallo scheletro, (2) la creazione di una sospensione a singola cella, (3) l'etichettatura delle cellule coralline utilizzando vari marcatori per la citometria di flusso e (4) strategie di gating e smistamento delle cellule. Questo metodo consentirà ai ricercatori di lavorare sui coralli a livello cellulare per analisi, analisi funzionali e studi sull'espressione genica di diverse popolazioni di cellule.

Introduction

Le barriere coralline sono uno degli ecosistemi più importanti della Terra. Facilitano la biodiversità fornendo habitat critici per pesci e invertebrati e sono fondamentali per sostenere le comunità antropogeniche fornendo cibo e sostentamento economico attraverso il turismo¹. In qualità di costruttore chiave di barriere coralline, l'animale corallo (Phylum: Cnidaria) aiuta anche le comunità costiere creando grandi quadri di carbonato di calcio che mitigano i danni delle onde e delle tempeste².

I coralli come adulti sono animali sessili che ospitano una vasta gamma di partner endosimbiotici, tra cui virus, archea, batteri, protisti, funghi, e, in particolare, i membri della famiglia dinoflagellate algalellate Symbiodiniaceae³. I cambiamenti nell'ambiente possono causare squilibri in questa comunità, spesso portando a focolai di malattia e sbiancamento dei coralli in cui le simbiotiche Symbiodiniaceae vengono espulse dalla colonia del corallo, eliminando così la principale fonte di nutrizione per il corallo. Entrambi questi scenari spesso causano la morte dell'ospite corallo^4,5,6. Gli effetti dei fattori di stress antropogenici, come il rapido cambiamento climatico, stanno accelerando gli eventi di morte dei coralli di massa, portando ad un declino globale delle barriere coralline^{7 .}

Recentemente, sono stati sviluppati molti metodi diversiper contribuire a mitigare la perdita della barriera corallina. Questi metodi includonollo posizionamento di coralli sulle barriere coralline esistenti, attraversamento genetico con genotipi termalmente tolleranti e manipolazione cellulare delle comunità microbiche e simbiotiche ospitate all'interno del corallo^8,9. Nonostante questi sforzi, molto rimane sconosciuto sulla diversità delle cellule coralline e la funzione cellulare^10,11,12,13. Una comprensione approfondita della diversità del tipo di cellule coralline e della funzione cellulare è necessaria per capire come l'organismo corallo si comporta in condizioni normative e stressanti. Gli sforzi per massimizzare l'efficienza del ripristino e della conservazione beneficeranno di una migliore comprensione del modo in cui la diversità cellulare e la funzione genica sono accoppiate.

Precedenti lavori sulla diversità e la funzione cellulare si sono concentrati principalmente sugli studi istologici e sul campionamento dell'RNA a tutto tessuto^14,15,16,17. Per ottenere maggiori dettagli sulla funzione specifica del tipo di cellula nei coralli, ci devono essere metodi per l'isolamento di specifiche popolazioni di cellule coralline vive. Questo è stato fatto con successo in organismi modello non classici per mezzo di fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) tecnologia di citometria di flusso¹⁸. FACS utilizza una combinazione di laser sintonizzati su lunghezze d'onda variabili per misurare diverse proprietà cellulari endogene a livello di singola cellula, come la dimensione relativa delle cellule, la granularità cellulare e l'autofluorescenza. Inoltre, le cellule possono essere contrassegnate da composti fluorescenti etichettati per misurare specifiche proprietà desiderate^18,19.

Finora, l'applicazione della citometria di flusso alle cellule coralline è stata principalmente per l'analisi di Symbiodiniaceae simbiotica e altre popolazioni batteriche utilizzando la loro forte, naturale autofluorescenza^20,21,22. FACS è stato utilizzato anche per stimare le dimensioni del genoma del corallo utilizzando il segnale marcatore del DNA fluorescente rispetto alle cellule dell'organismo modello di riferimento^23,24. L'applicazione efficiente del FACS fornisce tre strumenti distinti che sono utili per gli studi di biologia cellulare: 1) descrizione morfologica e funzionale delle singole cellule; 2) identificazione, separazione e isolamento di specifiche popolazioni di cellule per studi a valle; e 3) l'analisi dei saggi funzionali a livello di singola cellula.

Lo sviluppo e l'applicazione di vari marcatori fluorescenti esogeni per lo studio delle cellule coralline rimane quasi inesplorato. Tali marcatori possono includere proteine taggate, substrati marcati per enzimi o risposte fluorescenti ad altri composti. Questi marcatori possono essere utilizzati per identificare i tipi di cellule che hanno proprietà uniche, come l'evidenziazione di celle che producono quantità variabili di una specifica funzione di raggruppamento cellulare, come i lisosomi. Un ulteriore esempio è l'uso di perline etichettate fluorescentmente per identificare funzionalmente le cellule competenti per la fagocitosi, o l'inghiottimento di un agente patogeno mirato²⁵. Le popolazioni di cellule attive nelle risposte immunitarie possono essere facilmente identificate dalla FACS dopo l'inghiottimento di queste perline applicate esogenamente. Mentre i metodi istologici tradizionali richiedono tessuto conservato e molte ore per approssimare la percentuale di cellule positive per l'inghiottimento del tallone, un saggio funzionale basato su FACS per l'inghiottimento degli agenti patogeni può essere eseguito relativamente rapidamente su cellule vive isolate. Oltre a studiare le risposte specifiche delle cellule allo stress, questa tecnologia ha il potenziale per chiarire l'espressione gene-specifica e illuminare la storia evolutiva e evolutiva dei tipi di cellule interamente unica per i cnidariani, come i calicoblasti e i cnidociti.

Recentemente, abbiamo eseguito uno screening intensivo di oltre 30 marcatori cellulari che ha portato all'identificazione di 24 che sono in grado di etichettare le cellule coralline, 16 delle quali sono utili per distinguere le popolazioni uniche¹⁸, rendendole cluster di differenziazione (CD). Qui descriviamo il processo di isolamento delle cellule coralline in Pocillopora damicornis dalla rimozione delle cellule dallo scheletro di carbonato di calcio all'identificazione e isolamento di specifiche popolazioni di cellule con FACS (Figura 1).

Protocol

1. Dissociazione dei tessuti dallo scheletro del corallo tramite aerografo e compressore

NOTA: Eseguire passi sul ghiaccio e proteggere le mani con i guanti.

1. Assemblare il kit dell'aerografo collegando il compressore d'aria, il tubo flessibile e l'aerografo (Figura 2). Impostare l'indicatore di pressione tra 276-483 kPa.
   NOTA: Il compressore e il tubo dell'aria consigliati utilizzati per questo studio sono stati preimpostati a una pressione massima di 393 kPa. Uso al di fuori di questo 276-483 kPa gamma può provocare sia una rimozione cellulare inadeguata dallo scheletro o rottura delle membrane cellulari. Questa gamma può differire per ogni specie e può richiedere un test di fattibilità. Un test di fattibilità può essere eseguito con un sottoinsieme del liquame cellulare con un semplice emocitometro e un test di esclusione del colorante daPI (4,6-diamidino_2-phenylindole), visualizzato su un microscopio composto.
2. Preparare 100 mL di supporti di colorazione cellulare in un sterile contenitore di vetro aggiungendo 33 mL di 10x salina tamponata da fosfato (PBS; senza calcio e magnesio) ad una concentrazione finale di 3,3x, 2 mL di siero di vitello fetale (FCS; calore inattivato a 56 gradi centigradi per 30 minuti) al 2% del volume totale e 2 mL di 1 M HEtt a una concentrazione finale di 20 m. Poi si ricarica a 100 mL con acqua sterile.
   NOTA: La concentrazione di 3,3x PBS è stata scelta per imitare la salinità dell'acqua di mare, come dimostrato in Rosental et al.¹⁸. Questa concentrazione deve essere regolata per le specie che si trovano in altri ambienti per imitare la loro salinità.
3. Trasferire 10 mL di supporti di colorazione delle celle in una bottiglia di aerografo (etichettata "F" nella Figura 2) e collegare il coperchio dell'adattatore per il connettore dell'aerografo.
   NOTA: frammenti più grandi e specie con strati di tessuto più spessi possono richiedere più supporti per un'adeguata rimozione dei tessuti.
4. Per le specie coralline ramificate qui, utilizzare una fresa ossea per tagliare o tagliare un frammento di corallo di circa 3 5 cm di lunghezza o 4 cm² in area.
   NOTA: Il frammento deve essere chiaro dalle macroalga e da altri organismi multicellulari perché questi non possono essere rimossi dal campione a valle e contaminano il campione durante i processi di analisi e selezione FACS. Un frammento di 1 cm di P. damicornis dà circa 2x 10 x 10⁶ cellule dopo aver filtrato, colorato e lavato.
5. Posizionare il frammento di corallo all'interno di un sacchetto di plastica e utilizzare l'aerografo per spruzzare il supporto di colorazione della cella sul corallo (Figura 2). Continuare questo processo fino a quando la maggior parte dell'ossatura è esposta. Rimuovere lo scheletro rimanente dal sacchetto di raccolta.

2. Dissociazione delle cellule dal tessuto corallino

NOTA: Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio e proteggere le mani con i guanti.

1. Filtrare il liquame cellulare attraverso un colino a cellule di nylon da 40 m in un tubo centrifuga da 50 ml per ottenere una singola sospensione cellulare.
   NOTA: diverse dimensioni delle maglie del ceppo cellulare possono essere più appropriate per diverse specie. Tuttavia, dimensioni maggiori possono provocare una dissociazione dei tessuti inadeguata a causa del passaggio di detriti e grumi di cellule.
   1. Per gli esemplari con strati di muco più spessi, utilizzare lo stantuffo sterilizzato di una siringa di plastica da 1 mL e macinarla delicatamente contro il filtro per rompere i grumi e aiutare le cellule a passare attraverso il colino. Sciacquare il colino e lo stantuffo con i supporti di colorazione cellulare nel tubo di centrifuga.
2. Pellet le cellule per centrifugazione a 4 gradi centigradi a 450 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in 1 mL di supporto di colorazione cellulare.

3. Colorazione delle cellule

NOTA: Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio e proteggere le mani con i guanti. Le macchie presenti in questo protocollo sono a scopo di rappresentazione. Le macchie alternative richiederanno concentrazioni e tempi di incubazione diversi.

1. Trasferire 500 l di celle risospese su un tubo rotondo-inferiore da 5 mL e mettere da parte come campione di controllo. Non aggiungere macchie a questo aliquota.
2. Per la sospensione cellulare rimanente, aggiungere 0,42 luna di 12 mM colorante vitale (Tabella dei materiali), 1 -L di 5 m di specie reattive dell'ossigeno (ROS) ( Tabella deimateriali) e 0,1 luna di 0,2 m colorazione lisosoma ( Tabelladei materiali). Pipette bene per mescolare e incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio per evitare il fotosbiancamento.
   NOTA: DAPI viene utilizzato in questo esempio per funzionare come colorante di DNA e vitalità per l'gating differenziale delle cellule morte sulla macchina FACS. Questo presuppone che DAPI penetri cellule morenti a causa dell'integrità della membrana. La macchia ROS emette luce nell'intervallo di 520 nm (verde), mentre il marcatore lisosomiale emette luce a circa 668 nm (rosso).
3. Pellet 500 L delle cellule macchiate per centrifugazione a 4 gradi centigradi a 450 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e risospendere nuovamente il pellet in 500 gradi l di supporti di colorazione cellulare. Trasferire in un nuovo tubo rotondo-bottom da 5 mL e conservarlo sul ghiaccio.

4. Avvio FACS

NOTA: I passaggi possono variare a seconda della marca e del modello del citometro a causa delle differenze nei laser e nei canali. Per questo protocollo, è stato utilizzato un citometro con laser a lunghezza d'onda 405, 488, 535 e 640 nm. I filtri presenti in questo protocollo sono a scopo di rappresentazione. Le macchie cellulari alternative possono richiedere un diverso set di filtri e laser.

1. Iniziare a creare un nuovo modello di progetto sul software di selezione e scegliere il pannello laser. Per la combinazione rappresentata di macchie e fluorescenza naturale, selezionare tutti e quattro i laser (405, 488, 535 e 640 nm).
2. Selezionare i filtri appropriati per ogni colore previsto rappresentato nell'esperimento.
   1. Per rilevare l'emissione di DAPI e aiutare nella separazione delle cellule vive e morte, utilizzare un filtro con un passabanda (BP) di 450/50 (425-475 nm) come un filtro DAPI, Hoeschst o Pacific Blue.
   2. Per il rilevamento della luce emessa dal segnale ROS verde, utilizzare un filtro con un BP di 530/30 (intervallo di lunghezza d'onda di 515-545 nm) come un filtro di isotoniamina fluorescente (FITC) o proteina fluorescente verde (GFP). Questo filtro misurerà la concentrazione di ROS in ogni cellula.
   3. Aggiungere un filtro aggiuntivo con un BP di 670/30 (655-685 nm range) come un filtro allphycocyanin (APC) per il rilevamento dell'emissione di macchie lisosomiche.
      NOTA: Il canale APC consentirà la misurazione dell'attività fagocitica. Questo canale rileverà anche l'autofluorescenza generata dalle alghe simbiotiche coralline della famiglia Symbiodiniaceae. Questo segnale può essere separato utilizzando un canale aggiuntivo che ha una lunghezza d'onda più lunga rispetto al filtro APC, tuttavia.
   4. Includere un filtro con un BP di 780/60 (750-810 nm range), ad esempio la ficoerythrina più comunemente utilizzata, il filtro cianina (APC-Cy7), che rileva l'emissione di autofluorescenza troppo rossa da Symbiodiniaceae e ausili nell'isolamento delle cellule aposimbiosi.

5. Impostazione del gating FACS

NOTA: I passi possono variare a seconda della marca e del modello del citometro e del programma di acquisizione accoppiato con il cilindro.

1. Nella schermata sperimentale del progetto del software di citometria, creare un grafico a dispersione e selezionare la dispersione in avanti (FCS) come metrica per l'asse X e la dispersione laterale (SSC) per l'asse Y.
   NOTA: FCS è correlato alle dimensioni della cella e SSC è correlato alla granularità. Ciò consentirà la rimozione della maggior parte dei detriti, in quanto la maggior parte sarà di dimensioni inferiori rispetto alle cellule intatte.
2. Impostare gli assi su scale logaritmiche o biesponenziali, poiché le dimensioni e la granularità delle celle possono variare in base a diversi ordini di grandezza (Figura 3A), in particolare nei coralli.

6. Analisi FACS e isolamento cellulare

NOTA: I passi possono variare a seconda della marca e del modello del citometro e del programma di acquisizione accoppiato.

1. Posizionare il controllo (cioè il sottoinsieme di celle non colorate) nella camera campione del citometro e avviare il processo di lettura. Quando il computer inizia a ricevere dati da ogni cella o evento, i punti inizieranno a comparire nel grafico a dispersione. Per eliminare eventuali detriti lasciati nelle camere del citometro da esperimenti precedenti, lasciare passare circa 30 s prima di iniziare l'analisi.
2. Nel grafico a dispersione, regolare la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) per centrare i punti.
   NOTA: La tensione PMT viene utilizzata per amplificare la potenza del segnale dei fotoni misurati; se la tensione PMT è troppo debole, verranno lette meno celle e se la tensione PMT è troppo forte, le celle saranno misurate vicino al valore massimo e diversi tipi di cellule saranno indistinguibili l'una dall'altra. Una tensione PMT adeguata garantisce che gli eventi distinguibili in modo indipendente popoleranno il grafico a dispersione. La separazione degli eventi è più facile da visualizzare proiettando scale logaritmiche o biesponenziali su grafici a dispersione FSC e SSC.
3. Avviare la registrazione degli eventi. Per risparmiare l'esempio, sospendere l'acquisizione dei dati dopo la lettura di circa 15.000 eventi. Nella maggior parte dei casi, questo sarà adeguato per visualizzare i modelli di popolazione cellulare complessiva. Registra più eventi se analizzi piccole popolazioni di cellule specializzate.
4. Nel primo grafico di FSC e SSC, creare una selezione, o cancello, delle celle intorno al marchio 10² e superiore sull'asse X FSC. Qualsiasi cosa al di sotto di questa soglia è probabilmente detriti cellulari. Disegnare cancelli rettangolari, che è un'opzione regolare sui programmi software di citometria di flusso e buono per chiare, popolazioni di cellule distinte. Per le popolazioni di cellule che assumono una forma più irregolare sui grafici a dispersione, utilizzare un'opzione di gating poligonale.
   NOTA: Un taglio minimo di 10² sulla dispersione in avanti dovrebbe selezionare per le più piccole cellule coralline, ma può consentire la contaminazione dei detriti. Per modificare questo, aumentare il limite inferiore del gating per essere più conservatore.
5. Creare un nuovo grafico a dispersione che esprima il filtro DAPI sull'asse X e il filtro APC-Cy7 sull'asse Y. A tale scopo, selezionare il cancello per le celle intatte create nel passaggio 6.4, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare l'opzione per creare un nuovo grafico a dispersione. Regolare gli assi su scale logaritmiche o biesponenziali.
   NOTA: i passaggi necessari per creare un nuovo grafico possono variare con diversi programmi software.
6. Ora rimuovere il campione di controllo dalla camera del citometro e sostituirlo con le cellule colorate. Lasciare passare 30 s prima di avviare l'analisi e registrare i dati. Registrare circa 15.000 celle prima di mettere in pausa.
   NOTA: Le popolazioni distinte all'estremità superiore della scala APC-Cy7 sono quelle con elevata autofluorescenza rossa da Symbiodiniaceae. Non è necessaria alcuna macchia per visualizzare queste interruzioni della popolazione e possono essere visualizzate anche nella registrazione dei campioni di controllo (Figura 3C). Selezionare per le popolazioni solo corallo, quelli più bassi sull'asse Y, per un'ulteriore differenziazione.
7. Creare un nuovo grafico a dispersione delle celle aposymbiotiche per visualizzare le concentrazioni ROS (filtro FITC) e le cellule positive ai lisosomi (filtro APC), utilizzando nuovamente scale logaritmiche o biesbifiche.
   NOTA: Se sono presenti più popolazioni di cellule distinte che sono aposimbiotiche, ognuna di esse può essere ulteriormente distinta nel proprio grafico a dispersione (Figura 3C,D).
8. Confrontare il gruppo di campioni colorato con il controllo, il sottoinsieme non colorato utilizzando la prima registrazione dell'esempio di controllo o reinserendo e riutilizzando il gruppo di controlli. Gate gli eventi che sono unici per il gruppo di campioni colorato.

7. Ordinamento e raccolta FACS

NOTA: I passi possono variare a seconda della marca e del modello del citometro e del programma di acquisizione accoppiato con il cilindro.

1. Con una selezione di cellule scelte per la raccolta, posizionare i tubi di microcentrismo (contenenti 250-500 l di coltura cellulare o buffer di lisi in base al numero di cellule raccolte e al metodo di stoccaggio) nella camera di raccolta del citometro.
   NOTA: Il citometro di flusso rappresentato è in grado di smistare quattro diverse popolazioni alla volta, e la macchina può essere configurata per contenere una varietà di dispositivi di raccolta, tra cui vari tubi di centrifuga e 96 piastre di pozzo.
2. Una volta che il citometro inizia a leggere il campione ed è passata una quantità appropriata di tempo per eliminare i detriti, iniziare a smistare le popolazioni desiderate e raccogliere ovunque da 20.000 cellule a diversi milioni.
   1. Per più di 500.000 celle, regolare il volume dei supporti di coltura cellulare o buffer di lisi e il volume del dispositivo di raccolta.
   2. Per gli studi in vitro, conservare le cellule sul ghiaccio fino a quando non vengono poste in un ambiente sterilizzato o in un incubatore.
   3. Per gli studi molecolari, avviare immediatamente il processo di isolamento DNA/RNA/proteina o congelare il flash e conservarlo a -80 gradi centigradi fino all'estrazione.
3. Ogni volta che viene utilizzata una nuova macchia, specie o selezionatrice, eseguire un controllo di purezza sulla popolazione di interesse smistando almeno 20.000 celle di interesse in 500 : L di supporti di colorazione, quindi ri-analizzando le celle ordinate e confermando che le cellule vengono lette all'interno del cancello utilizzato per ordinare inizialmente (Figura 4).

Results

Nel complesso, questo protocollo è utile perché facilita l'identificazione e la raccolta delle popolazioni di cellule coralline vive che possono essere utilizzate per analisi funzionali. Il flusso di lavoro è iniziato con la separazione meccanica dei tessuti corallini dallo scheletro di carbonato di calcio sottostante (Figura 1). Questo è uno dei passi iniziali più importanti perché tecnica impropria si traduce in alta mortalità cellulare e può creare grandi ...

Discussion

Questo protocollo è stato adattato da Rosental et al.¹⁸ e sviluppato per l'identificazione e l'isolamento delle cellule di P. damicornis. La metodologia si concentra sul processo di filtraggio dei campioni per rimuovere detriti, cellule non vitali e cellule ospitate da Symbiodiniaceae attraverso l'esame di fattori intrinseci cellulari, tra cui la dimensione delle cellule relative, la granularità relativa delle cellule, l'autofluorescenza cellulare e la presenza di membrane cellulari intat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit aerografo & Compressore	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Kit aerografo di alimentazione a sifone ad azione singola serie Paasche H con compressore Master TC-20 e Tubo dell'aria
BD FACSAria II	BD	644832
Tagliaossa	Bulk Reef Supply	205357	Oceans Wonders Coral Stoney Bone
Cutter Cell Strainer	Corning	352340	40 um; BD Falco; confezionato singolarmente; sterile; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2,5 mM in DMSO; Eccitazione/Emissione: 485/520 nm
Sacca di raccolta	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6"L x 4"W Sacca in polietilene richiudibile standard con chiusura a zip, trasparente; 2 mil Spessore
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg in H2O; Eccitazione/Emissione: 358/461 nm
Siero fetale di vitello	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Inattivato a calore a 57 gradi; C per 30 minuti
Ematocitometro	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Ematocitometro
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM in DMSO; Assorbimento/Emissione: 647/668 nm
Provette per microcentrifuga	VWR	87003-294	1,7 mL
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7,4; 10X
Provette a fondo tondo	VWR	352063	5 mL
Siringa	BD	309628	1 mL Siringa BD Luer-Lok sterile, policarbonato monouso