Presente qui è un protocollo dettagliato per l'uso di embrioni di pesce zebra Tg(vtg1: mCherry) per il rilevamento di effetti estrogenici. Il protocollo riguarda la propagazione del pesce e il trattamento degli embrioni e sottolinea il rilevamento, la documentazione e la valutazione dei segnali fluorescenti indotti da composti interferenti endocrini (EDC).
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Articolo metodologico
Utilizzo degli embrioni di pesce zebra Tg(Vtg1:mcherry) per testare gli effetti estrogenici dei composti interferenti endocrini
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ci sono molti composti interferenti endocrini (EDC) nell'ambiente, soprattutto sostanze estrogeniche. L'individuazione di queste sostanze è difficile a causa della loro diversità chimica; pertanto, vengono utilizzati metodi sempre più di rilevamento degli effetti, come gli organismi biomonitor/bioindicatori sensibili all'effetto estrogenico. Questi organismi di biomonitoraggio includono diversi modelli di pesce. Questo protocollo riguarda l'uso del pesce zebra Tg(vtg1: mCherry) linea transgenica come organismo di biomonitoraggio, compresa la propagazione dei pesci e il trattamento degli embrioni, con particolare attenzione al rilevamento, alla documentazione e alla valutazione dei segnali fluorescenti indotti dall'EDC. L'obiettivo del lavoro è la dimostrazione dell'uso degli embrioni di linea transgenica Tg(vtg1: mCherry) per rilevare gli effetti estrogenici. Questo lavoro documenta l'uso di embrioni transgenici di pesce zebra Tg(vtg1: mCherry) per il rilevamento di effetti estrogenici testando due sostanze estrogeniche, . Il protocollo descritto è solo una base per la progettazione di saggi; il metodo di test può essere variato in base agli endpoint di test e ai campioni. Inoltre, può essere combinato con altri metodi di analisi, facilitando così l'uso futuro della linea transgenica.
Introduzione
C'è un numero significativo di composti interferenti endocrini (EDC) che sono tra le sostanze più pericolose nel nostro ambiente. Questi sono principalmente composti estrogenici che contaminano l'acqua dalle risorse naturali. La diversità chimica delle sostanze appartenenti al gruppo rende difficile la verifica della loro presenza, in quanto sono necessari diversi metodi analitici per la loro rilevazione. Sulla base della loro struttura chimica è molto difficile determinare se una sostanza è effettivamente in grado di agire come un estrogeno. Inoltre, queste sostanze non sono mai presenti in forma pura nell'ambiente, quindi i loro effetti possono essere influenzati da....
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Protocollo
Il Protocollo sugli animali è stato approvato ai sensi della legge ungherese sul benessere degli animali e tutti gli studi sono stati completati prima che gli individui trattati avrebbero raggiunto la fase di alimentazione libera.
1. Raccolta e trattamento dell'embrione
- Mantenere il tg(vtg1:mCherry) il pesce zebra a 25,5 x 0,5 gradi centigradi, pH 7 x 0,2, la conduttività tra 525 x 50 s/m, il livello di ossigeno 80% di saturazione e 14 h di luce e 10 h ciclo scuro.
- Riempire i serbatoi di accoppiamento con acqua di sistema e impostare il pesce per l'accoppiamento del pomeriggio prima della raccolta delle uova.
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Risultati
Nell'esperimento presentato in questo manoscritto, gli effetti di due sostanze estrogeniche sono stati testati a cinque concentrazioni a partire dalla fecondazione per 5 giorni sugli embrioni di pesce zebra Tg(vtg1:mCherry). Abbiamo studiato se i segnali fluorescenti apparissero nel fegato dei pesci alla fine del tempo di esposizione a causa delle sostanze e se ci fossero differenze nell'estrogenicità delle due sostanze. I risultati sono stati valutati sulla base delle immagini fluorescenti e dei valori di densi.......
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Discussione
L'uso di biomonitor/bioindicatori per effetti estrogenici si è diffuso in studi tossicologici. I modelli in vivo svolgono un ruolo eccezionale, perché a differenza dei test in vitro, non solo forniscono informazioni sulla risposta di una cellula o di un recettore, ma consentono anche lo studio di processi complessi nell'organismo. Diverse linee transgeniche per lo studio degli effetti estrogenici sono state prodotte da pesci zebra, uno dei quali Tg(vtg1:mCherry) è stato utilizzato per questi studi. Il metodo qui.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Ufficio nazionale per la ricerca, lo sviluppo e l'innovazione (NKFIH) del Fondo nazionale per la ricerca, lo sviluppo e l'innovazione (NKFIA); Accordo di sovvenzione: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 co-finanziato dall'Unione Europea, e il programma di eccellenza tematica NKFIH-831-10/2019 dell'Università Szent Istvàn, assegnato dal Ministero per l'Innovazione e la Tecnologia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Cloruro di calcio (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| Software ImageJ | Institutes of Health, USA | Software ad accesso pubblico, scaricabile da: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X software calibrato | Leica Microsystems GmbH. | Abbiamo utilizzato il softver descritto negli esperimenti, ma qualsiasi software fotografico è conforme ai test | |
| Leica M205 FA stereomicroscopio, Leica DFC 7000T fotocamera | Leica Microsystems GmbH. | Abbiamo utilizzato le apparecchiature descritte negli esperimenti, ma qualsiasi stereomicroscopio fluorescente è adatto per i test | |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mFiltro ciliegia | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulosa | Sigma Aldrich Ltd. | ||
| Puntale per pipette Microloader | Eppendorf GmbH. | ||
| pipetta Pasteur | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| cloruro di potassio (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-metanosulfonato (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
Riferimenti
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity o....
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Ristampe e permessi
