Recapitulare la transizione Suckling-to-Weaning In Vitro utilizzando organoidi intestinali fetali

In molte specie di mammiferi, tra cui topi e uomini, l'intestino neonato ha diverse caratteristiche che si distinguono dall'epitelio intestinale completamente maturo. Queste caratteristiche facilitano gli enterociti neocicliali per digerire e assorbire il latte, che contiene grassi elevati e carboidrati bassi, con il lattosio come carboidrato principale. Il bordo del pennello delle cellule epiteliali intestinali neo-onacali esprime l'idrolasi lattalasi lattasino-phlorizin (Lct)¹ per digerire il lattosio disacardio del latte. Dopo il periodo di allattamento, gli enterociti si adattano al digerire il cibo solido che è ricco di carboidrati complessi e povero di grassi. Ciò si manifesta con un interruttore in pennello bordo disaccharidase espressione da laactase a sucrasio-isomalsi (Sis) e trehalase (Treh), che può digerire carboidrati più complessi presenti nel cibo solido². Un altro interruttore metabolico è legato alla bassa concentrazione di arginina nel latte. Per prevedere la necessità di arginina, enterociti neonatali esprimono il tasso di limitazione dell'enzima nella biosintesi dell'arginina, argininosuccinate synthase-1 (Ass1), per sintetizzare l'arginina³. Al contrario, enterociti adulti esprimono arginasi 2 (Arg2), un enzima in grado di catabolizzare l'arginina che è abbondante negli alimenti solidi. Inoltre, l'epitelio intestinale neoatale esprime il recettore Fc neo-nanato per le immunoglobuine (FcRn), che media l'assorbimento dell'IgG materno dal latte alla circolazione/flusso sanguigno⁴. L'espressione di FcRn diminuisce significativamente durante la transizione di rilassamento-svezzo⁵. Nei topi, la maturazione delle cellule di Paneth avviene postnatalmente, in modo coincidente con la formazione e la maturazione delle cripte, ed è caratterizzata dall'espressione di peptidi antimicrobici lisosoma (Lyz) e defensins⁶.

Tutti questi cambiamenti fanno parte della transizione da succhiare-svezzamento, un processo che si verifica gradualmente dopo la nascita a un mese di età nei topi, quando l'epitelio intestinale raggiunge il suo stato adulto maturo. La transizione Suckling-to-weaning è intrinsecamente regolata e impostata nello sviluppo nel tubo intestinale. Il fattore di trascrizione B della maturazione indotta da detesto proteina-1 (Blimp-1) svolge un ruolo chiave in questo processo di maturazione intrinseca⁷. Blimp-1 è altamente espresso nell'epitelio neonaale, mentre la sua espressione diminuisce e si perde durante la transizione suckling-to-weaning e quindi può servire come un marcatore affidabile di epitelio intestinale neonatale. Nonostante sia un processo intrinseco, la transizione da succhiare allo svasamento può essere modulata da fattori esterni. Ad esempio, l'analogo sintetico del cortisolo, dexamethasone, è noto per accelerare la maturazione intestinale in vivo^8,9.

Gli attuali modelli in vitro utilizzati per studiare la maturazione epiteliale intestinale, compresa la transizione da allattamento allo svezzamento, utilizzano linee cellulari epiteliali adulte e/o organoidi adulti che portano caratteristiche dell'epitelio intestinale adulto. Recentemente abbiamo dimostrato che le cellule epiteliali intestinali primarie isolate dall'intestino tardo fetale maturano e ricapitolano la transizione da allattamento allo svezzamento quando crescono in vitro come organoidi¹⁰. Abbiamo inoltre dimostrato che questo processo di maturazione intestinale in vitro si verifica allo stesso ritmo di in vivo. Infine, abbiamo usato dexamethasone per accelerare il processo di maturazione nello stesso modo descritto per gli studi in vivo.

Qui, illustreremo un protocollo preciso per l'isolamento e la coltura degli organoidi intestinali fetali tardivi del topo. Descriviamo il modo preferito di raccogliere campioni per una coltura organoide prolungata e metodi per monitorare la transizione da latte a svezzo in vitro. Questo protocollo può essere utilizzato per studi in vitro di maturazione epiteliale intestinale e modulatori di questo processo e si traduce in una maggiore produttività, una maggiore qualità e valore traslazionale dei dati e una riduzione dell'uso animale.

Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio stabiliti dal Comitato Etico per la sperimentazione animale dell'Università di Amsterdam nel pieno rispetto della legislazione nazionale sulla ricerca animale a seguito della direttiva europea 2010/63/EU per l'uso degli animali per scopi scientifici (ALC312).

1. Isolamento di piccoli organoidi intestinali fetali

1. Sacrificare i feti E18-E20 decapitando con forbici chirurgiche, secondo le normative etiche approvate.
2. Subito dopo l'eutanasia, tagliare con cura aprire l'addome inferiore del feto con le forbici intestinali e rimuovere l'intero intestino.
   NOTA: L'isolamento deve essere eseguito con intestino tra E18 e E20 di gestazione al fine di ottenere la corretta transizione da suallatura-svezzamento e maturazione in vitro.
3. Con due piccole pinze, allungare l'intestino. Usando lo stomaco e l'appendice come guide, tagliare la parte prossimale e dissinfale dell'intestino tenue.
   NOTA: Se la dissezione viene eseguita con attenzione, è possibile isolare anche i due punti. Tagliarlo a parte usando l'appendice come guida (Figura 1).
4. Fai aprire l'intestino longitudinalmente: fissa l'intestino usando una lama di rasoio posizionata longitudinalmente e tira l'intestino facendo pinze scorrevoli (un braccio delle pinze su ogni lato della lama del rasoio) lungo la lama del rasoio. Successivamente, tagliare l'intestino aperto in pezzi di 1 cm.
5. Preparare due tubi da 50 mL con 10 mL di ghiaccio freddo fosfato-buffered salina (PBS). Trasferire la parte prossimale e dissinale dell'intestino tenue (e il colon, se applicabile) separatamente ai tubi. Mantenere i tubi sul ghiaccio mentre si disseta l'intestino di topi aggiuntivi. Raccogliere tutte le parti intestinali di una lettiera insieme nello stesso tubo.
   NOTA: Una cucciolata ha di solito 6-10 feti. L'intestino di tutti i feti deve essere combinato. Questa quantità dovrebbe essere sufficiente a produrre 4-8 pozzi con organoidi, in una piastra di 48 pozzetti, per parte intestinale.
6. Procedere con l'isolamento organoide come descritto in precedenza¹¹. In breve, lavare i pezzi intestinali con PBS ghiacciato, incubare con 2 mM di acido etilenediaminetraceacetica (EDTA) per 30 minuti a 4 gradi centigradi, dissociare le cripte dal tessuto lavando duramente i pezzi con PBS freddo di ghiaccio - 10% siero di vitello fetale (FCS), filtrare utilizzando un colino di cellule 70 m e centrifugare per raccogliere la criptato le criptaie a 150 x g per 5 min a 4 min.
7. Piastra da 4 a 8 pozzi con cripte in gel matrice extracellulare, a seconda delle dimensioni del pellet, in una piastra calda di 48 pozzetti. Utilizzare 20 - L di cripte sospese in gel matrice extracellulare per pozzo. Lasciate che il gel a matrice extracellulare si solidificoli in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 10 min.
   NOTA: Considerando che solo il 40% al 50% delle cripte isolate forma organoidi, mirare ad una densità di 250 a 300 organoidi per pozzo. In primo luogo aggiungere meno gel matrice extracellulare del necessario. Guarda al microscopio dopo aver placcato il primo pozzo per analizzare se la densità delle cripte isolate è l'ideale. Se necessario, aggiungere altri gel a matrice extracellulare.
8. Nel frattempo preparare il medio ENR: 14 mL di F-12 (HEPES) 1:1)-1ML dell'aquila modificata di Advanced Dulbecco (HEPES) 1x, 14 mL dell'acido aquila modificato di Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham(1:1) L-glutamine 0,01 M e 0,2U/mL Penicillin/Streptomycin), 4 mL di supporti condizionati da Noggin, 2 mL di supporti condizionati da Rspondin, 400 L di supplemento B27 1x, 200 l di Supplemento N2 1x, 50 L di 1,25 mM n-Acetylcysteine, 20 l di 0,05 g/mL Fattore di Crescita Epidermica (EGF).
   NOTA: Durante la coltura organoidi colonidi, integrare con 50% Wnt supporti condizionati.
9. Aggiungete 250 l di media ENR per pozzo.

2. Coltura di organoidi fetali

1. Cambiare il mezzo delle culture 3 volte a settimana. La maturazione degli organoidi si ottiene dopo 1 mese di cultura.
2. Al giorno 3 dopo ogni passaggio, contare il numero di sferoidi e organoidi utilizzando un microscopio ottico. Quantificare almeno 3 pozzi per condizione e tutti gli organoidi presenti in ogni pozzo.
   NOTA: il numero di sferoidi si riduce con il tempo, mentre il numero di organoidi aumenta (Figura 2).
3. Passare gli organoidi una volta alla settimana con dissociazione meccanica come descritto di seguito.
   1. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di raffreddore Advanced DMEM/F12 1:1 . Raccogliere tutti i gel a matrice extracellulare con organoidi in un tubo da 15 mL. Utilizzare una punta di 200 l sulla cima di una punta di filtro da 1000 l e pipetta su e giù di 20 volte per interrompere gli organoidi.
   2. Centrifuga a 150 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 20 - L di gel a matrice extracellulare per pozzo. Di solito, gli organoidi fetali possono essere espansi in un rapporto 1:2.
   3. Lasciate che il gel a matrice extracellulare si solidifidi per 5-10 min.

3. Analisi della maturazione a livello di RNA e proteina

1. Analizzare la coltura ogni 3 giorni dopo ogni passaggio, per un periodo di 1 mese (cioè, il tempo in cui viene raggiunta la maturazione completa) (Figura 3).
   NOTA: La coltura organoide fetale è dinamica (Film 1) ed evitare variazioni dalla normale rigenerazione degli organoidi dopo un'interruzione meccanica, è necessario raccogliere sempre campioni nello stesso giorno dopo il passaggio.
2. Isolamento dell'RNA
   1. Raccogliere 3 pozze di organoidi utilizzando un buffer di lisi di RNA pari a 200 gradi per ogni pozzo integrato con 2 luna di mercaptoetanolo. Dopo l'aggiunta del buffer di lisi di RNA al pozzo, assicurarsi che tutti i gel a matrice extracellulare con organoidi vengano trasferiti in un tubo da 1,5 mL privo di RNase.
   2. Vortice vigorosamente e tenere a -80 gradi centigradi per non più di 1 mese. Isolare l'RNA utilizzando kit di colonna di spin in silice disponibili in commercio.
   3. Per aumentare la qualità dell'RNA, dopo le fasi di lavaggio aggiungere 500 -L di 80% EtOH e mescolare delicatamente invertendo la colonna. Centrifuga per 2 min a 11.000 x g per asciugare completamente la colonna.
      NOTA: Assicurarsi di lavare l'interno del coperchio del tubo con l'80% EtOH facendo scorrere il tubo a testa in giù tre o cinque volte per sbarazzarsi di tutte le tracce di tiocyanate di guanidina.
   4. Per aumentare la resa dell'RNA, attendere 1-2 min dopo aver applicato l'acqua senza RNase prima della centrifuga. Ri-elute RNA applicando il primo eluato flow-through alla colonna una seconda volta.
      NOTA: La qualità dell'RNA isolato è sufficiente per l'uso nell'analisi dell'espressione a livello di genoma. Controllare se il numero di integrità dell'RNA è superiore a 8.
3. Isolamento delle proteine
   1. Raccogliere 5 pozze di organoidi utilizzando 250 l di soluzione di recupero delle celle ghiacciate in un tubo da 15 mL. Incubare per almeno 30 min sul ghiaccio per sciogliere il gel matrice extracellulare (questo ridurrà il contributo proteico dal gel matrice extracellulare).
   2. Lavare con PBS ghiacciato. Aggiungete 250 l di tampone di lisi cellulare e conservate a -80 gradi centigradi.
      NOTA: Dopo la sonicazione, i campioni possono essere utilizzati per rilevare l'attività degli enzimi o per i blots occidentali.
4. Immunostaining
   1. Raccogliere 2 pozze di organoidi utilizzando 250 l di soluzione di recupero delle celle ghiacciate in un tubo da 15 mL. Incubare per almeno 30 min sul ghiaccio per sciogliere il gel matrice extracellulare (questo ridurrà lo sfondo di colorazione). Lavare con PBS ghiacciato.
   2. Fissare gli organoidi utilizzando 500 - L di 4% paraformaldegyde (PFA) per 1 h a 4 gradi centigradi. Lavare con PBS ghiacciato. Procedere all'immunofluorescenza completamente-organoide o all'incorporamento della paraffina, secondo i protocolli pubblicati¹².
      NOTA: Utilizzare una pipetta Pasteur plastica per gestire gli organoidi. In questo modo si eviterà di perturbare la sua struttura.

4. Effetto del fattore estrinseco (dexamethasone come esempio) sul processo di maturazione organoide

1. Il primo giorno di cultura, aggiungere 0,01M dexamethasone agli organoidi. Incubare gli organoidi con dexamethasone durante tutto il mese della cultura aggiungendo nuovo dexamethasone ogni volta che il mezzo viene cambiato.
2. Analisi dell'espressione genica
   1. Isolare l'RNA come descritto sopra. Sintetizzare, allo stesso tempo, cDNA di tutti i campioni da confrontare (trattati e non trattati). Procedere con il metodo qRTPCR preferito.
   2. Utilizzare GeNorm per identificare i due geni di riferimento più stabili ogni volta che viene utilizzato un nuovo trattamento sugli organoidi fetali. Utilizzare la media geometrica dei due geni di riferimento scelti per i calcoli di espressione relativa.
      NOTA: Suggerimenti di geni di riferimento per testare gli organoidi fetali dei topi: Cyclophilin, Gapdh, zactin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib e Tbp.
   3. Per studiare in che modo un certo fattore estrinseco influisce sulla maturazione fetale postnatale del topo, devono essere valutati tutti i seguenti geni.
      1. Controllare se i marcatori fetali lattasi (Lct), la synthasi argininosuccinata 1 (Ass1), la proteina di maturazione indotta da linfociti B 1 (Blimp-1) e il recettore fc neonatale (FcN) diminuiscono di espressione durante le prime due settimane di coltura e sono assenti per il tempo dicoltura rimanente( Figura 4C ). Analizzare se questo modello viene modificato.
      2. Controllare se i marcatori adulti sucrasi-isomaltasi (Sis), arginase 2 (Arg2), trehalase (Treh) e lysozyme (Lyz) aumentano nell'espressione dopo due settimane di coltura (Figura 4D). Analizzare se questo modello viene modificato in base al fattore esterno.
         NOTA: Il Dexamethasone è un fattore esterno che può accelerare la maturazione degli organoidi fetali e può essere utilizzato come controllo positivo in tutti gli esperimenti volti a testare altri fattori estrinseci.
3. Analisi dell'attività enzimatica
   1. Isolare le proteine come descritto in precedenza. Rilevare l'attività di disaccharidases intestinale secondo i protocolli pubblicati da Dahlqvist e Messer^13,14.
   2. Preparare 0,625 M di pH 6,0 (tenere per 3 mesi a 4 gradi centigradi). Utilizzando questo buffer, preparare 0,05 M di lattosio (aggiungere il sodio p-hydroxybenzbenzoate come stabilizzatore per inibire l'attività lisomica p-galactosidase); 0,05 M malto; 0,05 M di saccarosio e 0,05 M di tresasio.
      NOTA: Tutte queste soluzioni possono essere conservate per 5 giorni a 4 gradi centigradi. Tenere il ghiaccio durante la preparazione di ansaggio.
   3. Preparare gli standard di analisi diluendo la soluzione di glucosio 5,56 M con acqua ultrapura per ottenere soluzioni con le seguenti concentrazioni: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 M e 0,025 M.
      NOTA: soluzione stabile per almeno 3 mesi a 4 gradi centigradi.
   4. Incubare in una piastra da 96 pozze per 60 min a 37 gradi:
      - 30 l di lisato organoide con 30 O L di lattosio
      - 30 l di lisato organoide con 30 O L di saccarosio
      - 30 lunisi di dieci volte diluito con 30 luna di maltosio
      - 30 lunisci di 5 volte diluito lismi lismi con 30 luna di treslasi
      - 30 luna di lisa organoide non diluita con 30 lun di acido maleico, come sfondo campione
      - 30 l di ogni standard di glucosio
      - 30 litri di acqua ultrapura, come bianco
      - 30 l di controllo positivo (ottimizzare la diluizione; tessuto intestinale fetale lismalizzato può essere utilizzato come controllo per l'attività lattasi, mentre il tessuto intestinale adulto liscito può essere utilizzato come controllo per sucrasi, maltase e trehalasi)
      NOTA: La diluizione dei campioni deve essere effettuata con buffer di lisisi cellulare. Conservare i campioni e la piastra sul ghiaccio durante la preparazione del saggio.
   5. Per determinare la quantità di glucosio prodotta dagli enzimi presenti nel lismiato organoide dopo l'incubazione con i rispettivi substrati, aggiungere rapidamente 200 L di soluzione PGO-colore e misurare l'assorbimento a 450 nm ogni 5 min per 30 min a 37 .
      NOTA: rendere fresca la soluzione PGO-color. Utilizzare 10 U/mL glucose-oxidase, 2 U/mL peroxidase e 7,88 mmol/L o-dianisidine in buffer 0.5mol/L Tris-HCl al pH 7.0. La soluzione deve essere a temperatura ambiente quando viene aggiunta alla piastra.
   6. Calcolare l'attività in base allo standard di glucosio e correggere la quantità totale di proteine (determinata dal saggio di acido bicinchoninico (BCA)). L'attività dell'enzima deve essere espressa come glucosio di Tipo.min^-1 (Figura 5B).
      NOTA: Misurare l'attività dell'arginasi utilizzando un kit di attività arginasi disponibile in commercio.

Coltura prolungata di cellule epiteliali intestinali fetali
Il protocollo per imitare la transizione da allattamento allo svezzamento in vitro dipende dalla corretta gestione degli organoidi fetali durante la coltura prolungata. L'intestino prossimale e quello distale isolato dai feti di topo E18-E20 sono separati come presentato nellaFigura 1). Dopo l'isolamento, le cellule epiteliali vengono semiate in cupole di gel a matrice extracellulare (Figura 2). In genere ci vogliono quattro passaggi e circa 28-30 giorni di cultura per gli organoidi fetali a maturare allo stato adulto. Durante questo periodo, le cellule in varie fasi della maturazione possono essere raccolte (Figura 3).

Rappresentante analisi a valle della transizione da succhiare a svelare in vitro
Per confermare che gli organoidi fetali isolati sono nettamente procrossici o distali, confrontare il livello di espressione dei marcatori prossimali Un taglio del gruppo membro della famiglia 2 (Onecut2) e della proteina legante GATA 4 (Gata4) e dei marcatori distale Proteina legante acidi grassi 6 (Fabp6) e Guanylate Cyclase Activator 2A (Guca2a) tra le colture organoide proximale e disloche (Figura 4A,B). La transizione suckling-to-weaning in vitro può essere monitorata da due serie di geni: fetale (Figura 4C) e marcatori adulti (Figura 4D). I marcatori fetali dovrebbero diminuire gradualmente nel corso della coltura, mentre l'espressione dei marcatori per adulti dovrebbe aumentare gradualmente (Figura 4C,D).

Utilizzo del fattore estrinseco come modificatore della transizione di svezzamento in vitro succhiare-a-
In questo protocollo dexamethasone un glucocorticoide sintetico, è stato utilizzato come un esempio di fattore estrinseco in grado di modificare la transizione suckling-to-weaning in vitro. I dati rappresentativi nella Figura 5 suggeriscono che gli effetti di fattori estrinseci sono meglio essere determinati da molteplici saggi, in quanto non necessariamente dovrebbero essere genomici. Ad esempio, nel caso della sucrasi-isocasia, sia l'espressione dell'RNA che della proteina sono indotte con dexamethasone (Figura 5A), mentre l'espressione del treslasi viene modificata solo a livello proteico. (Figura 5B).

Figura 1: Isolamento dell'intestino tenue del feto del topo. (A) Fotografia dell'intestino fetale sezionato e allungato, tra cui stomaco, intestino tenue e distale, appendice e colon. Linea nera indica dove l'intestino deve essere tagliato per dividere il procsimale e l'intestino tenue dislocante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini microscopiche rappresentative della coltura organoide fetale prossimale e distale al terzo giorno, giorno 17 e giorno 28 della cultura. Tutte le immagini sono state ottenute il giorno 3 dopo il passaggio e mostrano la diminuzione del numero di sferoidi straordinari. Barra della scala: 500 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Film 1: Video rappresentativo che mostra le dinamiche della cultura organoide fetale, dal quarto al sesto giorno della cultura. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Figura 3: Rappresentazione schematica della raccolta organoide per l'analisi della maturazione intestinale nel tempo. Le colture organoidica fetale prossimale e distale dovrebbero essere coltivate per un mese e passare ogni settimana. I campioni per l'analisi della maturazione devono essere raccolti 3 giorni dopo l'isolamento e ogni 3 giorni dopo ogni passaggio. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: QRTRTR rappresentativi dei marcatori di maturazione intestinale in organoidi fetali prossimali e distali. (A) I marcatori prossimali Onecut2 e Gata4 sono espressi principalmente nella coltura degli organoidi prossimali, mentre i marcatori distale(B), Fabp6 e Guca2a sono per lo più espressi nella coltura organoide distale. (C) Marcatori fetali Lct, Ass1, Blimp-1 e FcRn diminuiscono e (D)marcatori adulti Sis, Arg2, Treh e Lyz aumentano nel tempo in entrambe le colture organoidi proximali e distale. Le barre di errore rappresentano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Fattore esterno dexamethasone può modulare la maturazione degli organoidi fetali. (A) L'espressione genica del marcatore fetale Blimp-1 è diminuita al giorno 12 della coltura negli organoidi trattati nel dexamethasone rispetto ai organoidi di controllo, mentre sia l'espressione genica (B) che l'attività enzimatica (C) del marcatore adulto sucrasi-isomaltasi (Sis) sono aumentate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano nulla da divulgare.