Identificazione dei percorsi host mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando la tossicità del lievito e gli schermi soppressori

Summary

I patogeni batterici secernono proteine nell'ospite che prendono di mira processi biologici cruciali. Identificare le vie host mirate alle proteine degli effetti batterici è fondamentale per affrontare la patogenesi molecolare. Qui, viene descritto un metodo che utilizza un soppressore di lievito modificato e uno schermo di tossicità per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli efettori batterici tossici.

Abstract

I batteri intracellulari secernono fattori di virulenza chiamati proteine eftraenti nel citosol ospite che agiscono per sovvertire le proteine ospiti e/o i loro percorsi biologici associati a beneficio del batterio. L'identificazione delle proteine degli effetti batterici putativi è diventata più gestibile grazie ai progressi nel sequenziamento del genoma batterico e all'avvento di algoritmi che consentono l'identificazione in silico dei geni che codificano i candidati alla secrezione e/o quelli eucarioti Domini. Tuttavia, l'identificazione di questi importanti fattori di virulenza è solo un primo passo. Naturalmente, l'obiettivo è quello di determinare la funzione molecolare delle proteine efmarcatori e chiarire come interagiscono con l'ospite. Negli ultimi anni, tecniche come lo schermo bi-ibrido del lievito e le immunoprecipitazioni su larga scala accoppiate con la spettrometria di massa hanno aiutato nell'identificazione delle interazioni proteina-proteina. Sebbene l'identificazione di un partner di legame ospite sia il primo passo fondamentale per chiarire la funzione molecolare di una proteina efmarcatore batterica, a volte la proteina ospite si trova ad avere molteplici funzioni biologiche (ad esempio, actina, clathrin, tubulina), o la proteina batterica non può legare fisicamente le proteine ospiti, privando il ricercatore di informazioni cruciali sulla precisa via ospite manipolata. È stato adattato uno screening di tossicità del lievito modificato abbinato a uno schermo soppressore per identificare le vie dell'ospite influenzate dalle proteine degli effetti batterici. Lo schermo di tossicità si basa su un effetto tossico nel lievito causato dalla proteina efcontadina che interferisce con i percorsi biologici ospiti, che spesso si manifesta come un difetto di crescita. L'espressione di una libreria genomica del lievito viene utilizzata per identificare i fattori ospiti che sopprimono la tossicità della proteina degli effetti batterici e quindi identificano le proteine nel percorso che la proteina esecutore prende di mira. Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate sia per le schermate di tossicità che per le schermate di soppressore. Queste tecniche possono essere eseguite in qualsiasi laboratorio in grado di clonazione molecolare e coltivazione di lievito ed Escherichia coli.

Introduction

Il primo rapporto di procedure simili a quelle qui presentate ha caratterizzato l'effetto della legionella pneumophila di tipo IV SidD, una deAMPylase che modifica Rab1¹. Tecniche comparabili sono state utilizzate per la caratterizzazione di diversi effetti L. pneumophila ^1,2,3. Il saggio è stato adattato per caratterizzare una proteina effettore Coxiella burnetii tipo^{IV 4}, e recentemente l'utilità di questa tecnica è stata ampliata per la caratterizzazione delle proteine della membrana di inclusione <....

Protocol

1. Preparazione di supporti e reagenti

NOTA: Le piastre devono essere preparate prima del giorno del saggio e sono buone per 1 mese. I supporti e i reagenti possono essere realizzati in qualsiasi momento e sono buoni per 1 mese.

1. Preparare 1 L della soluzione per il glucosio (10% w/v) sciogliendo 100 g di glucosio D-() in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Regolare il volume a 1 L con acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m in una bottiglia sterile da 1 L.
2. Preparare 1 L della soluzione galactose (10% w/v) sciogliendo 100 g di D-(z)- galactose in 800 mL di acqua distillata in un b....

Results

Prima di poter eseguire lo schermo del soppressore effettivo del lievito, la proteina dell'effettore di interesse deve essere testata per la tossicità nel lievito. Ciò si ottiene esprimendo la proteina di interesse per il lievito sotto il controllo di un promotore inducibile di galactose. La crescita del glucosio (condizioni non induttive) dovrebbe prima essere confrontata per garantire che la tossicità sia specificamente dovuta all'espressione della proteina di interesse e non sia un difetto generale. Come mostrato nell.......

Discussion

Questo protocollo delinea le procedure passo-passo per identificare i percorsi biologici dell'ospite mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando una tossicità del lievito modificato e uno schermo soppressore. Il ceppo di lievito utilizzato, S. cerevisiae W303, è auxotrofico sia per uracil che per leucina. L'auxotrotrofia uracildela del ceppo viene utilizzata per selezionare il lievito che trasporta la proteina di interesse sul vettore pYesNTA-Kan, mentre l'auxotrotrotrotrofia leucita viene utilizza.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific BP2641500
Galattosio	MilliporeSigma	G0750-1KG
Kit di estrazione GeneJet Gel	ThermoFisher Scientific	K0691
Kit di purificazione PCR GeneJet	ThermoFisher Scientific	K0701
Kit di minipreparazione plasmidico GeneJet	Thermo	K0503
Glucosio	MilliporeSigma	G8270-1KG
Aringa Sperma DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Acetato di litio diidrato	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptone	Fisher Scientific
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	New England Biolabs	M0530
Poli(glicole etilenico) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA ligasi	New England Biolabs	M0202S
Triptofano	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Estratto di lievito	Fisher Scientific	BP1422-500
Kit miniprep per lievito	Zymo	D2001
Lievito base azotata senza aminoacidi	MilliporeSigma	Y0626-250G
Lievito sintetico drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1501-20G	senza uracile
Lievito Sintetico Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1771-20G	senza uracile, leucina, triptofano