Method Article

Identificazione dei percorsi host mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando la tossicità del lievito e gli schermi soppressori

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I patogeni batterici secernono proteine nell'ospite che prendono di mira processi biologici cruciali. Identificare le vie host mirate alle proteine degli effetti batterici è fondamentale per affrontare la patogenesi molecolare. Qui, viene descritto un metodo che utilizza un soppressore di lievito modificato e uno schermo di tossicità per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli efettori batterici tossici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I batteri intracellulari secernono fattori di virulenza chiamati proteine eftraenti nel citosol ospite che agiscono per sovvertire le proteine ospiti e/o i loro percorsi biologici associati a beneficio del batterio. L'identificazione delle proteine degli effetti batterici putativi è diventata più gestibile grazie ai progressi nel sequenziamento del genoma batterico e all'avvento di algoritmi che consentono l'identificazione in silico dei geni che codificano i candidati alla secrezione e/o quelli eucarioti Domini. Tuttavia, l'identificazione di questi importanti fattori di virulenza è solo un primo passo. Naturalmente, l'obiettivo è quello di determinare la funzione molecolare delle proteine efmarcatori e chiarire come interagiscono con l'ospite. Negli ultimi anni, tecniche come lo schermo bi-ibrido del lievito e le immunoprecipitazioni su larga scala accoppiate con la spettrometria di massa hanno aiutato nell'identificazione delle interazioni proteina-proteina. Sebbene l'identificazione di un partner di legame ospite sia il primo passo fondamentale per chiarire la funzione molecolare di una proteina efmarcatore batterica, a volte la proteina ospite si trova ad avere molteplici funzioni biologiche (ad esempio, actina, clathrin, tubulina), o la proteina batterica non può legare fisicamente le proteine ospiti, privando il ricercatore di informazioni cruciali sulla precisa via ospite manipolata. È stato adattato uno screening di tossicità del lievito modificato abbinato a uno schermo soppressore per identificare le vie dell'ospite influenzate dalle proteine degli effetti batterici. Lo schermo di tossicità si basa su un effetto tossico nel lievito causato dalla proteina efcontadina che interferisce con i percorsi biologici ospiti, che spesso si manifesta come un difetto di crescita. L'espressione di una libreria genomica del lievito viene utilizzata per identificare i fattori ospiti che sopprimono la tossicità della proteina degli effetti batterici e quindi identificano le proteine nel percorso che la proteina esecutore prende di mira. Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate sia per le schermate di tossicità che per le schermate di soppressore. Queste tecniche possono essere eseguite in qualsiasi laboratorio in grado di clonazione molecolare e coltivazione di lievito ed Escherichia coli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il primo rapporto di procedure simili a quelle qui presentate ha caratterizzato l'effetto della legionella pneumophila di tipo IV SidD, una deAMPylase che modifica Rab11. Tecniche comparabili sono state utilizzate per la caratterizzazione di diversi effetti L. pneumophila 1,2,3. Il saggio è stato adattato per caratterizzare una proteina effettore Coxiella burnetii tipoIV 4, e recentemente l'utilità di questa tecnica è stata ampliata per la caratterizzazione delle proteine della membrana di inclusione della Chlamydia trachomatis 5 .

Questo protocollo può essere suddiviso in due parti principali: 1) lo schermo di tossicità del lievito, in cui la proteina dell'effettore batterico di interesse è espressa in lievito e i cloni vengono sottoposti a screening per un fenotipo tossico come evidenziato da un difetto di crescita, e 2) lo schermo soppressore del lievito , in cui il fenotipo tossico viene soppresso dall'espressione di una libreria genomica del lievito nel ceppo tossico. Pertanto, lo schermo di tossicità è uno schermo per i fenotipi tossici che si manifestano come difetti di crescita quando l'effetto batterico di interesse è sovraespresso. I cloni tossici, trasformati con successo ed esprimendo l'effettore batterico, vengono selezionati e salvati per la fase successiva. Il secondo passo importante consiste nell'esprimere sovraesprimenza di una libreria genomica di lievito parzialmente digerito nel clone del lievito tossico. I plasmidi che compongono la libreria genomica del lievito suggerita per l'uso in questo protocollo trasportano inserti da 5,20 kb, di solito corrispondenti a 3-13 telai di lettura aperti di lievito (ORF) di una dimensione media del gene di 1,5 kb su tutti i plasmidi, che rappresentano l'intero genoma del lievito coperto circa 10x. Questa parte del saggio è chiamata lo schermo del soppressore, in quanto l'obiettivo è sopprimere la tossicità della proteina dell'effettore batterico. I potenziali plasmidi soppressori sono isolati dal lievito, sequenziati e gli ORF soppressori identificati. La logica alla base dello schermo soppressore è che la proteina eflatrice si lega, interagisce e/o travolge i componenti del percorso host a cui si rivolge, e che fornire le proteine ospiti in eccesso può salvare l'effetto tossico sul percorso e quindi, il difetto di crescita. Pertanto, gli ORF identificati che sopprimono la tossicità spesso rappresentano più partecipanti di un percorso host. Vengono quindi eseguiti esperimenti ortogonali per verificare che l'effettuatore batterico interagisca effettivamente con il percorso implicato. Ciò è particolarmente necessario se è stato identificato un partner di legame come clathrin o actin, perché queste proteine sono coinvolte in una moltitudine di processi host. Ulteriori esperimenti possono quindi chiarire la funzione fisiologica della proteina dell'effettore durante l'infezione. Gli schermi di tossicità e soppressore sono anche potenti strumenti per decifrare la funzione fisiologica delle proteine degli effetti batterici che non legano fisicamente le proteine ospiti con affinità sufficienti da rilevare per immunoprecipitazioni o che interagiscono con il ospite in interazioni eseguito e con hit-and-run enzimatiche che potrebbero non essere rilevate da uno schermo ibrido yeast-two.

Anche se lo schermo soppressore può essere un metodo potente per rivelare potenziali interazioni fisiologiche tra le proteine degli effetti batterici e le vie dell'ospite, la proteina degli effetti batterici deve indurre un difetto di crescita nel lievito, altrimenti schermo soppressore sarà di scarsa utilità. Inoltre, il fenotipo tossico deve comportare una crescita di almeno 2-3 log10 o sarà difficile identificare i soppressori. Se un laboratorio è impostato per la coltura cellulare, lo screening delle proteine effettori per la tossicità in linee cellulari comuni come HeLa può spesso fornire informazioni sul fatto che valga la pena procedere con lo schermo di tossicità del lievito. L'espressione ectopica della proteina esecutore nelle cellule HeLa a volte si traduce in una tossicità che correla fortemente con la tossicità nel ceppo di lievito utilizzato per questi schermi4. I segni osservabili di stress nelle cellule HeLa includono la perdita di fibre di stress, il distacco cellulare dalla piastra e la condensa nucleare che indica l'apoptosi. Qualsiasi indicazione visiva dello stress nelle cellule HeLa rende la proteina di interesse un buon candidato per indurre un difetto di crescita nel lievito, che si replicano molto più rapidamente e sono quindi più sensibili alla perturbazione delle vie essenziali.

Va notato che lo schermo del soppressore non sempre identifica i partner di associazione dell'ospite come soppressori, ma può ancora implicare componenti critici del percorso o dei percorsi host presi di mira, producendo una visione olistica dei processi biologici dirottati dal proteina degli effetti batterici. In superficie, questo sembra controintuitivo, perché fornire il partner legante della proteina efsiatore in eccesso ci si aspetterebbe per salvare il difetto di crescita. Nel tentativo di identificare i percorsi presi di mira dalla proteina eflacuta c.ocoficida CT229 (CpoS), che si lega ad almeno 10 diversi Rab GTPases durante l'infezione5, nessuno dei partner di legame Rab ha soppresso la tossicità del CT229. Tuttavia, sono stati identificati numerosi soppressori coinvolti nel traffico di vescicle rivestite di clatrari (CCV), il che ha portato a ulteriori lavori di dimostrando che il CT229 sovverte specificamente il traffico di CCV dipendente da Rab. Allo stesso modo, quando si studia la proteina effettore C. burnetii Cbu0041 (CirA) sono stati identificati diversi Rho GTPases che hanno salvato il difetto di crescita del lievito, e in seguito si è scoperto che CirA funziona come una PROTEINa attivando GTPase (GAP) per RhoA4.

L'utilità dello schermo del soppressore del lievito per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli effetti batterici non può essere sopravvalutata, e altri ricercatori che tentano di caratterizzare le proteine degli effetti batterici intracellulari possono trarne grande beneficio queste tecniche. Questi saggi hanno un valore se le immunoprecipitazioni e/o gli schermi ibridi di lievito-due non sono riusciti a trovare un partner vincolante e possono chiarire quali vie sono prese di mira dalla proteina degli effetti batterici. Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la tossicità e gli schermi soppressori per identificare i percorsi biologici dell'ospite presi di mira dalle proteine degli effetti batterici intracellulari, nonché alcuni degli ostacoli comuni incontrati quando si utilizzano questi saggi e i loro soluzioni corrispondenti.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione di supporti e reagenti

NOTA: Le piastre devono essere preparate prima del giorno del saggio e sono buone per 1 mese. I supporti e i reagenti possono essere realizzati in qualsiasi momento e sono buoni per 1 mese.

  1. Preparare 1 L della soluzione per il glucosio (10% w/v) sciogliendo 100 g di glucosio D-() in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Regolare il volume a 1 L con acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m in una bottiglia sterile da 1 L.
  2. Preparare 1 L della soluzione galactose (10% w/v) sciogliendo 100 g di D-(z)- galactose in 800 mL di acqua distillata in un becher 1 L. Regolare il volume a 1 mL utilizzando acqua distillata e filtrare attraverso un filtro sterile di 0,2 m in una bottiglia sterile da 1.000 mL.
  3. Preparare 1 L di estratto di lievito peptone dextrose (YPD) agar sciogliendo 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di glucosio, e 20 g di agar in 1.000 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare a 56 gradi centigradi fino a raffreddare. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
  4. Preparare 1 L di brodo YPD sciogliendo 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone e 20 g di glucosio in 1.000 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min.
  5. Preparare l'uracile di abbandono sintetico (Ura- ). Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di lievito senza aminoacidi, 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil e 15 g di agar in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione di glucosio preparata al punto 1.1. Mescolare bene vorticoso o mettere su piastra di mescolare. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
  6. Preparare l'uracil di dropout sintetico (Ura-) agar galactose. Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di lievito senza aminoacidi, 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil e 15 g di agar in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione galactose preparata al passaggio 1.2. Mescolare bene vorticoso o mettere sul piatto di mescolare. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
  7. Preparare l'uracile di abbandono sintetico (SD) (Ura-) brodo di glucosio. Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di lievito senza aminoacidi e 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 ml o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 ml della soluzione di glucosio preparata al punto 1.1.
  8. Preparare l'uracile di abbandono sintetico (SD) (Ura-) leucina (Leu-) agar di glucosio. Per 1 L, sciogliere 6,7 g della base di azoto di lievito senza aminoacidi; 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil, leucina e eurptofano; 15 g di agar; e 0,076 g di metatofano in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione di glucosio preparata al punto 1.1. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
  9. Preparare l'uracil di dropout sintetico (Ura-) leucina (Leu-) agar galactose. Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi; 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil, leucina e eurptofano; 15 g di agar; e 0,076 g di metatofano in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50-60 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione galactose preparata al passaggio 1.2. Mescolare bene vorticoso o mettendosu una piastra di mescolare. Versare in piastre da 100 mm utilizzando 20 mL di supporti per piastra.
  10. Preparare l'uracil di dropout sintetico (Ura-) brodo di glucosio (Leu-). Per 1 L, sciogliere 6,7 g di base di azoto di lievito senza aminoacidi; 1,9 g di supplemento di dropout senza uracil, leucina, eurfano; e 0,076 g di metatofano in 800 mL di acqua distillata. Autoclave per 20 min e raffreddare in un bagno d'acqua a 56-60 gradi centigradi fino a quando la temperatura è di 50 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL o un cilindro sterile graduato, aggiungere 200 mL della soluzione di glucosio preparata al punto 1.1.
  11. Preparare la soluzione PEG (Polyetilene glicole). Aggiungere il 50% w/v di glicole di polietilene 3350 in acqua distillata. Sterilizzare autoclaving.
  12. Preparare 1 M di acetato di litio (LiAc) sciogliendo 10,2 g di disidratazione di acetato di litio in 200 mL di acqua distillata. Sterilizzare autoclaving.
  13. Preparare il DNA dello sperma di aringhe. Diluire 10 mg/mL di DNA di sperma di aringhe a 2 mg/mL utilizzando acqua distillata. Riscaldare a 100 gradi centigradi per 5 minuti e mettere immediatamente sul ghiaccio per 5 minuti.

2. Clonazione del gene di interesse nel plasmide di tossicità del lievito pYesNTA-Kan

NOTA: Attualmente, ci sono una varietà di vettori di tossicità del lievito disponibili sia commercialmente che accademicamente. Lo schermo del soppressore del lievito può essere utilizzato in combinazione con molti di questi vettori a condizione che il plasmide che esprimo la proteina effettrice di interesse utilizzi una selezione di dropout diversa dall'uracile e da un marcatore antibiotico diverso da BlaR. Questo lavoro ha utilizzato un vettore pYesNTA modificato4,5 che include una cassetta di resistenza alla kanamicina per uno screening più semplice per potenziali soppressori. Lo schema di clonazione deve consentire che la proteina efsiatrice sia in-frame con il promotore Gal e His-Tag. La proteina membrana di inclusione Chlamydia CT229 è stata utilizzata come prova di principio per questi saggi.

  1. Utilizzare la PCR per amplificare il CTR229 dal DNA genomico di C. trachomatis seguendo le istruzioni del produttore utilizzando i primi di TE229 Kpn F (CCGGTACCAATGAGAGTTCTAGTTAATTAGTGTGT) e CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTTCTCTCTCGGGGGGCC). Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: (1) 98 gradi centigradi per 30 s; (2) 98 gradi centigradi per 10 s, 55 gradi centigradi per 30 s, 72 gradi centigradi per 2 min; (3) ripetere il passaggio 2 per un totale di 25x; (4) 72 gradi centigradi per 10 min; e (5) attesa di 4 gradi centigradi.
  2. Analizzare 5 -L del prodotto PCR su un 1% gel di agarose (Figura 1).
  3. Purificare i restanti 45 gradi di DNA utilizzando un kit di purificazione PCR seguendo le istruzioni del produttore.
  4. Digerire il 50 -L di inserto PCR purificato e pYesNTA-Kan (Figura 2) per 1 h a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua utilizzando KpnI-HF e XhoI-HF.
    NOTA: Per pYesNTA-Kan, digerire 5 g di plasmide utilizzando 5 L di KpnI-HF, 5 l di XhoI-HF e 6 l di buffer in un volume totale di 60 l. Per l'inserto, digerire l'intero 50 o L di prodotto PCR purificato utilizzando 2 L di KpnI-HF, 2 L di XhoI-HF e 6 L di buffer.
  5. Eseguire l'intero digest del plasmide su un gel di agarose dell'1%. Eseguire la purificazione del plasmide digerito utilizzando un kit di estrazione gel seguendo le istruzioni del produttore.
  6. Purificare l'inserto PCR digerito utilizzando un kit di purificazione PCR seguendo le istruzioni del produttore.
  7. Clonare l'inserto in pYesNTA-Kan utilizzando 2 l di pYesNTA-Kan (passaggio 2,5), 2 -L di buffer di ligase di DNA, 1 L di T4 ligase e 15 L di inserto (passaggio 2.6). Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
  8. Aggiungere l'intera reazione di clonazione a 50 -L di cellule competenti di E. coli ed eseguire la reazione di trasformazione.
  9. Piastrare l'intera reazione di trasformazione su una piastra LB contenente 100 g/mL di carbenicillina.
  10. Inoculare 10 mL del LB contenente 100 g/mL di carbenicillina con tre colonie individuali. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/min.
  11. Isolare il plasmide utilizzando un kit miniprep plasmio seguendo le istruzioni del produttore.
  12. Sequenziare i plasmidi isolati usando primer specifici del gene (passaggio 2.1).

3. Testare la proteina di interesse per la tossicità nel lievito

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 su YPD agar (passaggio 1.3) per ottenere colonie isolate. Incubare a 30 gradi centigradi per 24 ore.
  2. Inoculare 10 mL di brodo YPD (passaggio 1.4) con una singola colonia dalla piastra di agar (passaggio 3.1). Incubare a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/mdurante.
  3. Aggiungere 0,5 mL della coltura notturna a 10 mL di brodo YPD (passaggio 1.4) e incubare a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/mper per 4 h.
    1. Pellet i 10 mL di coltura a 3.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
    2. Risospendere il pellet in 1 mL di acqua sterile, trasferire al tubo di microcentrifuga e pellet a 3.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
    3. Risospendere il pellet in 1 mL di acetato di litio da 1 mM (LiAc) e pellet a 3.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
    4. Ripetere il lavaggio LiAc 2x.
    5. Rimuovere il lavaggio. Risospendere il pellet in 2,4 mL del 50% PEG 3350. Aggiungete 360 luna di 1M LiAc, 500 l l di 2 mg/mL di DNA di sperma di aringhe e 400 l di acqua sterile.
      NOTA: questo è sufficiente per 20 trasformazioni.
    6. Aggiungete 180 l della miscela di trasformazione dal passo 3.3.5 a un tubo di microcentrifuga contenente 5 L di pYesNTA-Kan CT229 dna plasmid (100-500 ng) dal passo 2.12.
    7. Incubare in un bagno d'acqua a 30 gradi centigradi per 30 min.
    8. Incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 30 min.
    9. Pellet a 3.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
    10. Rimuovere il mix di trasformazione con la pipetta. Risospendere il pellet in 100 litri di acqua sterile. Piastra la trasformazione su SD Ura- agar con glucosio (passaggio 1.5).
    11. Incubare piastre a 30 gradi centigradi per 48 ore.
  4. Inoculare 5 mL di SD Ura- brodo contenente glucosio (passaggio 1.7) con una singola colonia dalla piastra. Incubare pernottamento a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/min. Includere il lievito trasformato con il solo vettore come controllo negativo.
    1. Aggiungete 180 l di acqua sterile a 5 pozze di una piastra di 96 pozze (A2-A6).
    2. Vorticare la cultura durante la notte per mescolare.
    3. Aggiungere 180 l di lievito al primo pozzo (A1). Diluire in serie 1:10 (sei campioni in totale, incluso non diluito).
    4. Utilizzando una pipetta multicanale, individuate 5 lun di ogni diluizione su SD Ura- glucosio (passaggio 1.5) e Ura- galactose (passaggio 1.6) piastre di agar. Incubare a 30 gradi centigradi per 48 ore.
  5. Valutare la tossicità confrontando la crescita del lievito esprimendo la proteina eftraitrice di interesse coltivata sui supporti contenenti galactosi con la crescita del lievito che esprime il solo vettore.
  6. Confermare l'espressione della proteina di fusione His-tag mediante gonfiore occidentale.

4. Trasformare il lievito tossico con la libreria genomica del lievito

  1. Inoculare 100 mL di SD Ura- brodo di glucosio (passaggio 1.7) utilizzando 1 mL del brodo dal passo 3.4. Incubare per 16-24 h a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri al rinfuso. Mettere 900 mL di SD Ura- brodo di glucosio a 30 gradi durante la notte per preriscaldare i media.
  2. Aggiungere l'intero 100 mL della coltura notturna al pallone preriscaldato da 1 L L. Incubare per 4/5 h a 30 s con agitazione a 150 giri/min.
    1. Pellet la coltura a 6.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
    2. Scartare il super-attardato. Risospendere il pellet in 250 mL di acqua sterile. Pellet la coltura a 6.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
    3. Scartare il super-attardato. Risospendere il pellet in 250 mL di 1 mM LiAc. Pellet la coltura a 6.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
    4. Rimuovere LiAc e risospendere il pellet in 9,6 mL del 50% PEG 3350. Aggiungere 1,44 mL di 1M LiAc, 2 mL di 2 mg/mL di DNA di spermatozoi da 2 mg/mL, 50 g della libreria genomica del pYep13 (ATCC 37323). Regolare il volume a 15 mL con acqua sterile. Mescolare delicatamente per inversione.
    5. Incubare in un bagno d'acqua a 30 gradi centigradi per 30 min.
    6. Aggiungere 750 l di zolfo dimetile (DMSO) per migliorare l'efficienza di trasformazione. Incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 30 min. Mescolare per inversione delicata ogni 10 min.
    7. Pellet il lievito a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    8. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di acqua sterile. Pellet a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    9. Risospendere il pellet in 8 mL di acqua sterile.
    10. Per determinare l'efficienza di trasformazione, diluire 1:10 e piastra 100 l di ogni diluizione su SD Ura- Leu- agar di glucosio (passaggio 1.8).
    11. Piastra 200 - L del campione su piastre SD Ura- Leu- galactose agar (passaggio 1.9). Utilizzare 50 piastre in totale.
    12. Incuba a 30 gradi centigradi per 48-96 h o fino a quando non appaiono colonie.
      NOTA: Le colonie appaiono generalmente sulle piastre di agar del glucosio a 48,72 h e sulle piastre di galactosi a 72-96 h.
  3. Colonie di patch (potenziali salvataggi) su SD Ura- Leu- galactose agar (passaggio 1.9) per espandere e fare magazzino. Incubare a 30 gradi centigradi per 24-48h.
  4. Inoculare 5 mL di SD Ura- Leu- brodo di glucosio (passaggio 1.10) utilizzando la parte del cerotto. Incubare pernottamento a 26 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/min.
    1. Aggiungete 180 l di acqua sterile a 5 pozze di una piastra di 96 pozze (A2-A6).
    2. Vorticare la cultura durante la notte per mescolare.
    3. Aggiungere 180 l di lievito al primo pozzo (A1). Diluire in serie 1:10 (sei campioni in totale, incluso non diluito).
    4. Utilizzando una pipetta multicanale, individua5 l'una di ogni diluizione su SD Ura- glucosio e SD Ura- piastre di agar galactose. Includere effettore tossico da solo come controllo.
    5. Incubare a 30 gradi centigradi per 48 ore.
  5. Confrontare la crescita del lievito esprimendo l'effettore tossico da solo al lievito contenente i potenziali soppressori. Procedere solo con potenziali soppressori che hanno diminuito la tossicità rispetto al lievito che esprime l'effettore da solo.

5. Identificare e confermare i soppressori

  1. Inoculare 5 mL di SD Ura- Leu- brodo di glucosio (passaggio 1.10) con 100 l di lievito dal passo 4.4 e incubare durante la notte a 30 s con agitazione a 150 giri/m.
    1. Pellet il lievito a 3.000 x g per 2 min a temperatura ambiente. Scartare delicatamente il supernatante usando una pipetta.
    2. Isolare il plasmide con un kit miniprep plisma plisma di lievito seguendo le istruzioni del produttore.
  2. Trasformate il plasmide isolato nelle cellule competenti di E. coli e placcate l'intera trasformazione sull'agar LB con 100 g/mL di carbenicillina. Incubare a 37 gradi centigradi per 24 ore.
  3. Inoculare 10 mL di brodo LB contenente 100 g/mL di carbenicillina, con tre colonie dalla piastra e incubare a 37 gradi durante la notte con agitazione a 150 giri/m.
    1. Colture pellet a 3.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Isolare il plasmide utilizzando un kit miniprep seguendo le istruzioni del produttore.
  4. Ritrasformare il lievito tossico con i plasmidi isolati dal passo 5.3.1 seguendo i passaggi nella parte 3 del protocollo.
    1. Inoculato 5 mL di SD Ura- Leu- brodo di glucosio con una colonia dalla piastra di trasformazione. Incubare pernottamento a 30 gradi centigradi con agitazione a 150 giri/min.
    2. Spot su Ura- Leu- agar di glucosio e galactose per confermare la soppressione della tossicità.
  5. Sequenza utilizzando pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) e pYep13 R (TGATGCCGGCCACGAT) primer per identificare le ORF di lievito.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prima di poter eseguire lo schermo del soppressore effettivo del lievito, la proteina dell'effettore di interesse deve essere testata per la tossicità nel lievito. Ciò si ottiene esprimendo la proteina di interesse per il lievito sotto il controllo di un promotore inducibile di galactose. La crescita del glucosio (condizioni non induttive) dovrebbe prima essere confrontata per garantire che la tossicità sia specificamente dovuta all'espressione della proteina di interesse e non sia un difetto generale. Come mostrato nell...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo delinea le procedure passo-passo per identificare i percorsi biologici dell'ospite mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando una tossicità del lievito modificato e uno schermo soppressore. Il ceppo di lievito utilizzato, S. cerevisiae W303, è auxotrofico sia per uracil che per leucina. L'auxotrotrofia uracildela del ceppo viene utilizzata per selezionare il lievito che trasporta la proteina di interesse sul vettore pYesNTA-Kan, mentre l'auxotrotrotrotrofia leucita viene utilizza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Shelby Andersen, Abby McCullough e Laurel Woods per la loro assistenza con queste tecniche. Questo studio è stato finanziato dai fondi delle startup del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università dell'Iowa a Mary M. Weber.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFisher Scientific BP2641500
GalattosioMilliporeSigmaG0750-1KG
Kit di estrazione GeneJet GelThermoFisher ScientificK0691
Kit di purificazione PCR GeneJetThermoFisher ScientificK0701
Kit di minipreparazione plasmidico GeneJetThermoK0503
GlucosioMilliporeSigmaG8270-1KG
Aringa Sperma DNAPromegaD1811
KpnI-HFNew England BiolabsR3142S
Acetato di litio diidratoMilliporeSigmaL6883-250G
PeptoneFisher Scientific
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltàNew England BiolabsM0530
Poli(glicole etilenico) 3350MilliporeSigma1546547-1G
pYep13ATCC37323
T4 DNA ligasiNew England BiolabsM0202S
TriptofanoMilliporeSigma470031-1G
XhoI-HFNew England BiolabsR0146S
Estratto di lievitoFisher ScientificBP1422-500
Kit miniprep per lievitoZymoD2001
Lievito base azotata senza aminoacidiMilliporeSigmaY0626-250G
Lievito sintetico drop-out Medium SupplementsMilliporeSigmaY1501-20Gsenza uracile
Lievito Sintetico Drop-out Medium SupplementsMilliporeSigmaY1771-20Gsenza uracile, leucina, triptofano

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119(1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070(1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21(2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989(2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Toxicity ScreenSuppressor ScreenBacterial Effector ProteinsHost Pathway IdentificationChlamydia trachomatisYeast Genomic LibraryPlasmid TransformationGrowth Defect AssaySerial DilutionDouble Drop out Agar

Related Articles