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Articolo metodologico

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

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DOI:

10.3791/60498

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28 maggio 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Department of Cardiology of the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Wuxi Lung Transplant Center, Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentato qui è un protocollo per l'analisi dell'ibridazione dell'RNA in situ intera nel test di zebra fish e tube formation nelle cellule endoteliali derivate dalle cellule staminali derivate dal paziente per studiare il ruolo dell'endoglin nella formazione vascolare.

Abstract

Lo sviluppo vascolare è determinato dall'espressione sequenziale di geni specifici, che possono essere studiati eseguendo analisi di ibridazione in situ nel pesce zebra durante diverse fasi dello sviluppo. Per studiare il ruolo dell'endoglin(eng) nella formazione dei vasi durante lo sviluppo della telangiectasia ereditaria emorragica (HHT), il knockdown mirato mediato dal morfolino di eng nel pesce zebra viene utilizzato per studiarne l'espressione temporale e le funzioni associate. Qui, l'ibridazione dell'RNA in situ (WISH) viene impiegata per l'analisi di eng e dei suoi geni a valle negli embrioni di pesce zebra. Inoltre, i test di formazione dei tubi vengono eseguiti nelle cellule endoteliali differenziate dalle cellule staminali plurimi derivate dal paziente HHT (iPSC-ECs; con mutazioni di eng). Un sistema di amplificazione del segnale specifico che utilizza l'intera quantità In Situ Hybridization – WISH fornisce una risoluzione più alta e risultati di fondo inferiori rispetto ai metodi tradizionali. Per ottenere un segnale migliore, il tempo di post-fissazione viene regolato a 30 min dopo l'ibridazione della sonda. Poiché la colorazione a fluorescenza non è sensibile negli embrioni di pesce zebra, viene sostituita con colorazione diaminobezidina (DAB). In questo protocollo, le linee iPSC derivate dal paziente HHT contenenti una mutazione eng sono differenziate in cellule endoteliali. Dopo aver rivestito una piastra con matrice di membrana seminterrato per 30 min a 37 gradi centigradi, gli iPSC-EC vengono seminati come motrici in pozzi e tenuti a 37 gradi centigradi per 3 h. Quindi, la lunghezza del tubo e il numero di rami vengono calcolati utilizzando immagini microscopiche. Pertanto, con questo protocollo WISH migliorato, è dimostrato che l'espressione eng ridotta influisce sulla formazione di progenitore endoteliale negli embrioni di pesce zebra. Ciò è ulteriormente confermato dai saggi di formazione dei tubi utilizzando iPSC-ECs derivati da un paziente con HHT. Questi saggi confermano il ruolo per l'eng nei primi sviluppi vascolari.

Introduzione

Una singola mutazione su eng (CD105) è stata segnalata in pazienti con HHT. La mutazione porta ad un aumento della proliferazione CE e alla riduzione dell'allungamento CE mediato dal flusso1,2. È stato anche riferito in precedenza che la carenza di ENG riduce l'espressione dei marcatori endoteliali (cioè kdrl, cdh5, hey2) nel pesce zebra3. L'endoglin, espresso principalmente nelle cellule endoteliali, è una glicoproteina transmembrana e funziona come co-recettore per trasformare i membri della famiglia del fattore di crescita . Dirige il legame BMP9 sulla superficie cellulare per regolare il gene a valle, compresa l'espressione Id1, per indurre la differenziazione delle cellule staminali verso EC4. Così, il gene eng svolge ruoli importanti nella vasculogenesi e nella malattia vascolare umana5,6. In precedenza abbiamo esaminato gli effetti del knockdown endoglin sulla formazione dei vasi negli embrioni di pesce zebra, seguito dall'analisi delle EC derivate da iPSC acquisite da un paziente HHT con una mutazione di eng 7. Questo protocollo dimostra gli effetti della carenza di ENG sull'espressione del marcatore del progenitore endoteliale e sulla formazione di tubi, che è un metodo quantificabile per misurare l'angiogenesi in vitro.

Per studiare l'espressione spaziale e temporale, WISH viene impiegato per rilevare l'espressione genica in vivo8. L'ibridazione in situ (ISH) è un metodo di utilizzo di sonde etichettate con sequenze complementari di acidi nucleici bersaglio (DNA o mRNA) per rilevare e visualizzare ibridi di acido nucleico bersaglio in un esemplare fisso. Il processo amplifica i segnali di espressione genica in vivo e viene utilizzato per rilevare l'espressione dei geni mediante microscopia. WISH è stato ampiamente utilizzato in vari animali modello, soprattutto nel pesce zebra9. È anche usato per acquisire i seguenti dati: 1) modelli di espressione campionaria/temporale, che forniscono informazioni sulla funzione genica e sulla classificazione; e 2) marcatori genici specificamente espressi che vengono utilizzati in farmaci ad alto consumo o screeningmutante 10.

Le sonde cromogeniche sono facilmente degradate con l'ibridazione tradizionale in situ (CISH) cromosomica in situ, che si traduce in un rumore di fondo elevato e segnali non specifici11,12. Il metodo WISH utilizza due sonde doppie indipendenti, che sono progettate per ibridarsi per indirizzare le sequenze di RNA. Ogni sonda contiene una sequenza di 18-25 complementare all'RNA bersaglio e una sequenza di coda di base di 14 (concettualizzata come z). Le sonde di destinazione vengono utilizzate in una coppia (doppio) . Le due sequenze di coda formano insieme un sito di ibridazione di base 28 per il preamplificatore, che contiene 20 siti di binding per l'amplificatore. L'amplificatore, a sua volta, contiene 20 siti di legame per la sonda di etichette e può teoricamente produrre fino a 8.000 etichette per ogni sequenza di RNA bersaglio.

Questa tecnologia avanzata facilita l'amplificazione simultanea del segnale e la soppressione dello sfondo per ottenere la visualizzazione a singola molecola, preservando la morfologia dei tessuti13. Ulteriore modifica dei metodi WISH si basa su precedenti ricerche14, tra cui fissazione supplementare e colorazione DAB. A condizione qui è un protocollo WISH migliorato che può funzionare anche se l'RNA bersaglio è parzialmente diminuito o degradato. I vantaggi includono che può essere completato in 24 h senza condizioni RNase-free. I segnali possono anche essere rilevati simultaneamente attraverso più canali da più destinazioni e i risultati sono coerenti e compatibili con i risultati di diverse piattaforme di automazione ad alta velocità effettiva.

I risultati dei modelli animali non riflettono il fenomeno che si verifica nell'uomo. ENG contiene due coppie di cistein conservi, C30-C207 e C53-C182, che formano ponti disulfide nelle regioni orfane. Per studiare ulteriormente il ruolo di eng nei pazienti affetti da HHT, i saggi di formazione dei tubi con iPSC derivati da pazienti HHT sono stati effettuati in cellule senza/con mutazioni di eng (Cys30Arg, C30R)15. Dopo Che Kubota et al. ha riportato per la prima volta l'esperimento di formazione dei tubi16, il saggio è stato sviluppato in diversi modi. È stato utilizzato per identificare fattori angiogenici o antiangiogenici, definire le vie di segnalazione nell'angiogenesi e identificare i geni che regolano l'angiogenesi17.

Prima della disponibilità di iPSC-EC derivati dai pazienti, i ricercatori hanno utilizzato principalmente le EC coltivate per studiare l'angiogenesi16. Tuttavia, per le cellule endoteliali, è una sfida tecnica trasdurre geni esogeni con un virus, a causa del numero di passaggio limitato che le EC possono subire. Questo perché non c'è quasi abbastanza materiale cellulare da raccogliere da vasi umani sia da un intervento chirurgico o da donatori approvati corrispondenti. Con l'invenzione della tecnica di generazione iPSC da shinya Yamanaka, gli EC umani derivati dagli iPSC possono essere utilizzati in modo affidabile in esperimenti in vitro, come riportato in precedenza18.

Utilizzando EC viralmente trasdotti con un numero limitato di e passaggi può essere sufficiente per gli studi di segnalazione, ma per gli studi funzionali, è meglio generare linee di cellule staminali pluripotenti mutanti (o iPSC o HESC mirati a CRISPER/Cas9), quindi differenziarli in EC per gli studi di angiogenesi che utilizzano saggi di formazione dei tubi19. La formazione del tubo può essere utilizzata per valutare la funzione delle cellule endoteliali con mutazioni. Questo protocollo descrive anche la formazione di tubi su una piastra di angiogenesi, che è un metodo facile, conveniente e riproducibile.

Il protocollo seguente fornisce un metodo affidabile e sistemico per studiare il ruolo di geni specifici nella formazione vascolare, insieme a dettagli per il modello di espressione in vivo e la quantificazione funzionale in vitro per la modellazione della malattia umana.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato Etico di Ricerca della scuola di medicina dell'Università di zhejiang.

1. Ibridazione in situ

  1. Allevamento e riproduzione della linea di pesci zebra
    1. Nutrire e allevare tutti i pesci zebra adulti a 26-28 gradi centigradi in un sistema di acquacoltura ricircolante con un ciclo scuro di 14 h/10 h per ogni giorno. Utilizzare le linee di pesce zebra AB (wild-type) per le seguenti procedure.
    2. Mettere uno strato di ciottoli sul fondo della scatola di allevamento come riparo per le uova. Gruppo pesce parentale nel rapporto di 2:1 (cioè, due femmine e un maschio) in ogni scatola. Lasciate che il pesce femmina depone le uova per 1 giorno. Alla fine della deposizione delle uova, rimuovere immediatamente il pesce genitore per impedire loro di mangiare le uova.
    3. Iniettare i 2 ng di morfolinee e 500 pg di mRNA in embrioni di iniezione monocellulare utilizzando il sistema di iniezione Femto Jet al microscopio (sequenza endoglin-MOs: 5'-GATGAACTCAACACTCGTCTCTCTCTCTCTCTCT-3'; sequenza di controllo 5 mispair control MOs: 5'-AAACAGACCACCTCTCATCTC-3').
    4. Incubare gli zigoti in acqua di mare acida a 27 gradi centigradi per circa 48 h.
  2. Raccolta e fissazione di embrioni di pesce zebra
    1. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per raccogliere 20-40 embrioni di pesce zebra dall'acqua del sistema circolante (pH - 5,0) in un tubo da 1,5 mL quando vengono dechorionati e raggiungere un periodo specifico di sviluppo. Aggiungere 1 mL di soluzione PFA 4% appena preparata a temperatura ambiente (RT).
      NOT: Il periodo in cui l'embrione scelto si basa sullo scopo dell'esperimento. La tabella 1 mostra il tempo di fissazione richiesto per diversi periodi embrionali.
    2. Rimuovere la soluzione di fissazione, lavare gli embrioni con soluzione di fosfato-buffer con Tween-20 (PBST, diluire 1 mL di Tween in 1000 mL di soluzione PBS) 3x per 5 min ciascuno a RT.
    3. Disidratare gli embrioni attraverso l'incubazione in una serie del 25%, 50% e 75% di metanolo (diluito in PBST) per 5 min ciascuno. Trasferire gli embrioni al 100% di metanolo per 5 min e sostituirlo con metanolo fresco. Conservare gli embrioni a -20 gradi centigradi per una notte o per un periodo di tempo.
  3. Idratazione e digestione
    1. Idratare gli embrioni che sono stati conservati nel 100% di metanolo utilizzando un setaccio con rete di nylon sul fondo per lavare in sequenza gli embrioni nei pozzi di 12 pozzetti con una serie di 75%, 50% e 25% metanolo (diluito in PBST) per 5 min ciascuno. Lavare gli embrioni con PBST 3x per 5 min ciascuno a RT.
    2. Aggiungere 50 l di proteine assi K (10 mg/mL) nel tubo con gli embrioni e seguire il tempo di digestione nella tabella 2 a RT.
    3. Rimuovere la proteinasi K e lavare gli embrioni con PBST 3x per 5 min ciascuno a RT.
  4. Ibridazione della sonda e post-fissazione
    1. Mettere le sonde progettate in base alle sequenze di mRNA di ogni gene in un sistema ibrido a 40 gradi centigradi fino a quando il precipitato non viene sciolto, che dovrebbe prendere 10 min. Mescolare le sonde bersaglio di ad esempio (XM_007116,7) e altri due geni importanti coinvolgono nella formazione del progenitore endotenario del mesodermi precoce (qui, aplnr [NM_001075105.1] e nrp1a [NM_001040326.1]) in un tubo da 1,5 mL con un rapporto di 50:1:1.
    2. Aggiungere 50-100 l ofsazioni a bersaglio misto in ogni tubo con embrioni, quindi incubare durante la notte a 40 gradi centigradi.
      NOT: Le sonde pre-miscelate devono essere preriscaldate fino a 40 gradi centigradi e raffreddate in RT prima dell'uso.
    3. Preparare una soluzione di citrato di sodio salina 0.2x con Tween-20 (SSCT): sciogliere 175,3 g di NaCl e 88 g di citrato di sodio in 1 L di dH2O per ottenere una soluzione SSC 20x. Quindi, diluire la soluzione 1:100 in dH2O per ottenere una soluzione SSCT 0.2 x. Dilute Tween-20 1:1000 nella soluzione SSCT 0.2x.
    4. Trasferire le sonde riciclate in un nuovo tubo. Lavare gli embrioni in una soluzione SSCT da 0,2 x 3x per 15 min ciascuno a RT. Le sonde riciclate possono essere riutilizzate 5x-10x.
    5. Utilizzare il 4% di paraformaldeide (PFA) per fissare gli embrioni per 30 min a RT. Lavare gli embrioni nella soluzione 0.2x SSCT 3x per 15 min ciascuno a RT.
      NOT: Il lavoro di Gross-Thebing et al. suggerisce un periodo post-fissazione di 10 min14, ma l'importo effettivo deve essere rettificato di conseguenza. Qui, abbiamo testato 10 min post-fissazione 3x, e la sensibilità della morte DAB è significativamente influenzata. Dopo aver esaminato, assicurarsi che 0,5-1,0 h di fissazione sia la condizione ottimale (un periodo di fissazione più breve non può produrre un segnale chiaro dall'RNA bersaglio e l'estensione appropriata del tempo di fissazione aiuta a rafforzare il segnale e fornire meno rumore di fondo).
  5. Amplificazione sequenziale e ibridazione della sonda per etichette
    1. Rimuovere la soluzione SSCT e sostituirla con 50 gradi l di Amp 1. Lasciare che gli embrioni si stabiliscano nell'Amp 1 a 40 gradi centigradi per 30 min. Quindi, lavare gli embrioni nella soluzione SSCT 0,2x 3x per 15 min ciascuno a RT.
    2. Rimuovere la soluzione SSCT e aggiungere 50 -L di Amp 2. Lasciare che gli embrioni si stabilizzino a 40 gradi centigradi per 15 min. Quindi, lavare gli embrioni nella soluzione SSCT 0,2x 3x per 15 min ciascuno a RT.
    3. Rimuovere la soluzione SSCT, aggiungere 50 gradi l di Amp 3 e toccare leggermente il tubo. Quindi, incubare gli embrioni a 40 gradi centigradi per 30 min. Lavare gli embrioni in 0,2x soluzione SSCT 3x per 15 min ciascuno a RT.
    4. Rimuovere la soluzione SSCT, aggiungere 50 -L di Amp 4 dropwise, e toccare con attenzione il tubo. Quindi, incubare gli embrioni a 40 gradi centigradi per 15 min. Lavare gli embrioni in 0,2x SSCT 3x per 15 min ciascuno a RT.
  6. Contrastare e microscopia
    1. Rimuovere la soluzione SSCT e aggiungere 50 - L di DAPI ad ogni tubo. Incubare gli embrioni all'altro a 4 gradi centigradi.
    2. Lavare gli embrioni con PBST e prepararli per l'imaging utilizzando una soluzione LMP (Low Melt point agarose) dell'1% (1 g di LMP disciolta in 100 mL di dH2O) in un piatto Petri pieno di PBST.
    3. Utilizzare un kit di substrato DAB perossidasi per macchiare il campione. Aggiungete i reagenti di colore A, B e C (50 l) a 1 mL di acqua distillata e mescolate bene per ottenere un fluido di lavoro DAB completo. Aggiungere il liquido al campione e coprire per 10 min.
    4. Lavare accuratamente il campione con PBST dopo la colorazione.
    5. Utilizzare un microscopio ottico con una funzione fotografica per l'imaging dei campioni.
      NOT: Se si scattano immagini più tardi, i tubi devono essere avvolti in un foglio di alluminio e conservati a 4 gradi centigradi.

2. Saggio di formazione del tubo

NOT: I EC mutanti e wildtype (controllo) sono stati differenziati dagli iPSC derivati da un paziente HHT (qui, una paziente di 62 anni con epistasis ricorrente da 22 anni, sanguinamento gastrointestinale, malformazioni arteriovenose polmonari, portando una mutazione missense eng in posizione c.88T>C di eson 2) e un donatore sano (senza mutazione eng), che sono stati forniti da Peking Union Medical College Hospital con l'approvazione da parte del comitato di etica della ricerca universitaria.

  1. Controllo e colture cellulari HHT iPSC
    1. Aggiungere un certo volume di matrice della membrana del seminterrato (ad esempio, Matrigel) a una piastra di coltura a 6 pozze primatisco per coprire il fondo del pozzo e incubare le piastre per 1 h a 37 gradi centigradi.
      NOT: Quando si utilizza per la prima volta la matrice della membrana del seminterrato immagazzinata a -20 gradi centigradi, incubare sul ghiaccio o in un frigorifero privo di gelo a 4 gradi fino al disgelo. Quindi diluire a 1:100 in DMEM/F12, quindi distribuire il diluente in 200 tubi l.l contenenti 100 . Conservare i tubi a -20 gradi centigradi ed evitare ripetuti congelamento e scongelamento. Quando si aggiunge la matrice di membrana seminterrato diluito, non creare bolle. Dopo aver aggiunto la matrice di membrana seminterrato diluito, scuotere la piastra 6 pozzo delicatamente a mano in modo che copra uniformemente il fondo.
    2. Dopo aver rivestito la piastra, rimuovere la soluzione di matrice della membrana seminterrato utilizzata dai pozzi. Quindi, aggiungere 2 mL di mTeSR1 medio in ogni pozzo, e piastra le iPSCs raccolte dall'ultimo passaggio a circa 1 x 106 per pozzo.
  2. Generazione ed espansione di EC da iPSC
    1. Dopo circa 4 giorni di cultura iPSC, scambiare il mezzo di coltura con BEL medium integrato con activin A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/mL), VEGF165 (50 ng/mL) e CHIR99021 (1,5 m). Far crescere le cellule per 3 giorni per generare cellule di mesodermia.
    2. Sostituire il mezzo descritto nel passaggio 2.2.1 con il mezzo BEL integrato con VEGF (50 ng/mL) e SB431542 (10 M) per 4 giorni per espandere gli EC vascolari. Trattare le cellule con lo stesso mezzo e la stessa coltura per altri 3-4 giorni.
    3. Utilizzare CD31-dynabeads per purificare gli EC vascolari maturi: fare riferimento alle istruzioni nel kit CD31-dynabeads, che collega l'anticorpo umano CD31 con perline magnetiche per combinare le molecole CD31 espresse su EC, quindi raccogliere le cellule positive CD31 tramite buffer di eluizione. Mantenere ed espandere gli EC purificati nel mezzo EC-SFM contenente VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL) e FBS (1%).
  3. Cellule endoteliali placcatura su piastre e microscopia rivestite di matrigel
    1. Aggiungete 10 l di matrice di membrana sotterranea per bene per rivestire le piastre di angiogenesi (vedi Tabella dei Materiali)e incubate a 30 min a 37 gradi centigradi.
    2. Raccogliere le cellule endoteliali dopo aver controllato i marcatori endoteliali CD31 e VE-cadherin con colorazione immunofluorescenza e rattivarle in media di crescita endoteliale 2 pipettando ripetutamente. Aggiungere 50 l di sospensione cellulare (2 x 105 cellule/mL) per bene sulla matrice solidificata e incubare le cellule per 3-5 h a 37 .
      NOT: Prima dell'esperimento di formazione del tubo, i marcatori endoteliali devono essere controllati per assicurarsi che il fenotipo corretto delle cellule endoteliali funzionali. 1 x 104 cellule per pozzo è un numero ideale per la formazione di tubi. Troppe o troppo poche cellule non sono favorevoli alla formazione di tubi. Aggiungere cellule dal lato del piatto e non toccare la matrice della membrana seminterrato. Utilizzare il microscopio luminoso in campo di ingrandimento elevato per controllare le cellule e scattare foto.
  4. Risultati quantitativi della formazione di tubi
    1. Osservare i risultati con un microscopio ad alta risoluzione e scattare foto di almeno 10 aree per ogni gruppo per ottenere statistiche affidabili sui dati.
    2. Esaminare la formazione di tubi endoteliali: stimare l'estensione della formazione del tubo controllando la lunghezza complessiva del tubo, il numero del tubo e i punti di ramo. Valutare e contare il numero e la lunghezza dei rami utilizzando il software ImageJ.

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Risultati

L'ibridazione dell'intero montaggio in situ si basa su un principio simile al trasferimento di energia da risonanza a fluorescenza. È stato progettato per migliorare sia la sensibilità che la specificità nel pesce zebra ISH, nonché per amplificare i segnali specifici del bersaglio senza alterare il segnale di fondo.

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Discussione

Questo protocollo ha applicato una piattaforma di analisi dell'RNA in situ a montaggio completo per i saggi di formazione di pesci zebra e di formazione di tubi su iPSC-EC derivati da un paziente HHT. Il metodo ISH tradizionale richiede un ciclo sperimentale più lungo con fasi sperimentali aggiuntive. Il protocollo presenta alcuni importanti miglioramenti, l'uso di doppie sonde indipendenti e iPSC derivate da un paziente con HHT che sono state applicate rispettivamente nei saggi WISH e nella formazione di tubi. Questi pe...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [numero di sovvenzione 2016YFA0102300 (a Jun Yang)];la Nature Science Foundation of China [numero di sovvenzione 81870051, 81670054 (a Jun Yang)]; il CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [numero di sovvenzione 2016-I2M-4-003 (a Jun Yang)]; il PUMC Youth Found e i Fondi fondamentali di ricerca per le Università Centrali [numero di sovvenzione 2017310013 (a Fang shou)].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
µ-Slide Angiogenesisibidi81506Amplificatore per colture cellulari
1-FLACDSDSAmplificatore di segnale
2-FLACDSDSAmplificatore di segnale
3-FLACDSDSAmplificatore
4 Alt B-FLACDSDSAmplificazione
Corning Matrigel MatrixCorning354234Fattore di crescita ridotto Matrigel
DEPCSigmaD5758Acqua priva di RNAasi
Endotelico-SFMumano Thermofisher11111044Coltura cellulare
ParaformaldeideSigma30525-89-4Embrioni fissi
ParaformaldeideSigma30525-89-4Cellule fisse
Proteasi KACDSDSDigerire il tessuto
Citrato di sodioSigma6132-04-3Soluzione SSCT: Wash Buffer
VEGF-165STEMCELL Technologies78073Fattore di crescita
320852 320853 320854 di segnale 320856 del segnale 322337

Riferimenti

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