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Articolo metodologico

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

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DOI:

10.3791/60509

15 aprile 2020

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Abstract

La microscopia intravitale (IVM) è ampiamente utilizzata per monitorare i processi fisiologici e patofisiologici all'interno della cascata di reclutamento di leucociti in vivo. Il protocollo attuale rappresenta un metodo pratico e riproducibile per visualizzare l'interazione con l'endotelio leucocito che porta al reclutamento di leucociti nel tessuto derivato dal muscolo scheletrico all'interno dell'organismo intatto del topo. Il modello è applicabile a tutti i campi di ricerca che si concentrano sull'attivazione dei noulociti e sul loro ruolo nella malattia.

Forniamo un protocollo passo dopo passo per guidare attraverso il metodo e per evidenziare potenziali insidie e difficoltà tecniche. Il protocollo copre i seguenti aspetti: impostazioni sperimentali e materiale richiesto, anestesia del topo, dissezione del muscolo cremaster così come cannulation tracheale e carotide, registrazioni IVM e analisi offline. Formati di dati come leucociti aderenti, flusso di rotolamento (RF) e frazione del flusso di rotolamento (RFF) sono spiegati in dettaglio e vengono discusse le applicazioni appropriate. Risultati rappresentativi da topi mdx carenti distrofina sono forniti nella sezione risultati.

IVM è un potente strumento per valutare il reclutamento di leucociti in un ambiente in vivo; tuttavia, delineare ad esempio la funzione endoteliale e leucocito può richiedere una combinazione con configurazioni ex vivo come esperimenti di camera di flusso. Inoltre, il background genetico degli animali di interesse può influenzare notevolmente il reclutamento di base, richiedendo la messa a punto individuale del protocollo previsto. Nonostante i suoi limiti, IVM può servire come piattaforma per tradurre prontamente i risultati in vitro in un organismo vertebrato vivente.

Introduzione

La microscopia intravitale (IVM) è uno strumento comunemente applicato nel campo della biologia del leucocito. Il reclutamento di leukociti segue una cascata di eventi ben definiti iniziati dalla cattura del leucocito, dal rotolamento e dall'adesione al muro endoteliale, e infine dalla trasmigrazione e dall'estramigrazione dei leucociti nel sito effettivo di infiammazione1. Ogni passo è mediato e controllato da varie chemiochine (ad esempio, IL-8/CXCL8), recettori (ad esempio, LFA-1, Mac-1) e molecole di adesione delle cellule endoteliali corrispondenti (ad esempio, ICAM-1, VCAM-1 ed E-Selectin)2,

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Protocollo

Gli animali erano ospitati in condizioni controllate e specifiche prive di agenti patogeni presso l'IBF (Interfakult're Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall'IRB locale e dal Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Germania.

1. Amministrazione dell'anestesia

  1. Anestesizzare il topo mediante iniezione di bolus intraperitoneale (i.p.) di 125 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilosina.
  2. Posizionare e fissare il mouse in una posizione recumbent dorsale su un pad di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea del mouse (36,5-38 gradi cen....

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Risultati

IVM in base al protocollo fornito fornirà informazioni uniche sulla cascata di reclutamento di leucociti nel muscolo scheletrico. La sezione dei risultati si concentrerà sui risultati tipici ottenuti da IVM ed evidenzierà i potenziali problemi che possono verificarsi.

La configurazione sperimentale per la microscopia intravitale è descritta nella Figura 1. La preparazione del muscolo cremaster e la rimozione del tessuto connettivo è fondamentale per ottenere immag.......

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Discussione

IVM come metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare diversi tipi di cellule in diversi organi ed è stato ampiamente descritto e discusso19. L'obiettivo principale di questo studio è quello di fornire un approccio efficiente per impostare ed eseguire IVM nel muscolo cremaster. Praticare il metodo produrrà risultati affidabili e riproducibili. Pertanto, la pianificazione e la standardizzazione sono fattori chiave per padroneggiare la tecnica. Soprattutto, la tecnica dipende molto dai parametr.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF) 01GL1746E nell'ambito del Consorzio PRIMAL. Gli autori riconoscono Britta Heckmann e Silvia Pezer per un'abile assistenza tecnica.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale
Ketanest SPfizer Pharma GmbHPZN: 08509909anestesia. Generico / IUPAC Nome: ketamina
xilazinaCP-Pharma GmbHCodice articolo: 1205 anestesia. Nome generico / IUPAC: xilazina (come idrocloruro)
Soluzione salinaB. Braun Melsungen PZN 02737756preparazione chirurgica. Generico / IUPAC Nome: cloruro di sodio
Ago per siringa Omnican FB. Braun Melsungen REF 9161502preparazione chirurgica 
Sutura 6/0 USPResorbaREF 4217preparazione chirurgica 
Tubo in polietilene #10 BD GmbHN. fornitore 427401preparazione chirurgica 
Tubo in polietilene #90 BD GmbHN. fornitore 427421preparazione chirurgica 
Rhodamine 6GSigma-Aldrich Chemie GmbHNumero CAS 989-38-8 colorazione leucocitaria. Generico / Nome IUPAC: etile 2-[3-(etilammino)-6-etilimmino-2,7-dimetilxantene-9-il]benzoato
Attrezzatura per l'installazione
Microscopio verticale Olimpo BX51W1microscopia
obiettivo 40 volte ZeissAchroplan 40 × /0.80 Wmicroscopia
ImSpector softwareLavision Biotec GmbHver. 4.0.469software
ImageJNational Institute of Health, USAver. 1.51j8software

Riferimenti

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  2. Zanardo, R. C. O., et al.

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Ristampe e permessi

Tag

Reclutamento dei leucocitiModello murinoInterazione endotelialeFlusso di rollingLeucociti aderentiCannulazione carotideaCannulazione tracheale