Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia intravitale (IVM) è ampiamente utilizzata per monitorare i processi fisiologici e patofisiologici all'interno della cascata di reclutamento di leucociti in vivo. Il protocollo attuale rappresenta un metodo pratico e riproducibile per visualizzare l'interazione con l'endotelio leucocito che porta al reclutamento di leucociti nel tessuto derivato dal muscolo scheletrico all'interno dell'organismo intatto del topo. Il modello è applicabile a tutti i campi di ricerca che si concentrano sull'attivazione dei noulociti e sul loro ruolo nella malattia.
Forniamo un protocollo passo dopo passo per guidare attraverso il metodo e per evidenziare potenziali insidie e difficoltà tecniche. Il protocollo copre i seguenti aspetti: impostazioni sperimentali e materiale richiesto, anestesia del topo, dissezione del muscolo cremaster così come cannulation tracheale e carotide, registrazioni IVM e analisi offline. Formati di dati come leucociti aderenti, flusso di rotolamento (RF) e frazione del flusso di rotolamento (RFF) sono spiegati in dettaglio e vengono discusse le applicazioni appropriate. Risultati rappresentativi da topi mdx carenti distrofina sono forniti nella sezione risultati.
IVM è un potente strumento per valutare il reclutamento di leucociti in un ambiente in vivo; tuttavia, delineare ad esempio la funzione endoteliale e leucocito può richiedere una combinazione con configurazioni ex vivo come esperimenti di camera di flusso. Inoltre, il background genetico degli animali di interesse può influenzare notevolmente il reclutamento di base, richiedendo la messa a punto individuale del protocollo previsto. Nonostante i suoi limiti, IVM può servire come piattaforma per tradurre prontamente i risultati in vitro in un organismo vertebrato vivente.
Introduzione
La microscopia intravitale (IVM) è uno strumento comunemente applicato nel campo della biologia del leucocito. Il reclutamento di leukociti segue una cascata di eventi ben definiti iniziati dalla cattura del leucocito, dal rotolamento e dall'adesione al muro endoteliale, e infine dalla trasmigrazione e dall'estramigrazione dei leucociti nel sito effettivo di infiammazione1. Ogni passo è mediato e controllato da varie chemiochine (ad esempio, IL-8/CXCL8), recettori (ad esempio, LFA-1, Mac-1) e molecole di adesione delle cellule endoteliali corrispondenti (ad esempio, ICAM-1, VCAM-1 ed E-Selectin)2,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Gli animali erano ospitati in condizioni controllate e specifiche prive di agenti patogeni presso l'IBF (Interfakult're Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall'IRB locale e dal Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Germania.
1. Amministrazione dell'anestesia
- Anestesizzare il topo mediante iniezione di bolus intraperitoneale (i.p.) di 125 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilosina.
- Posizionare e fissare il mouse in una posizione recumbent dorsale su un pad di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea del mouse (36,5-38 gradi cen....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
IVM in base al protocollo fornito fornirà informazioni uniche sulla cascata di reclutamento di leucociti nel muscolo scheletrico. La sezione dei risultati si concentrerà sui risultati tipici ottenuti da IVM ed evidenzierà i potenziali problemi che possono verificarsi.
La configurazione sperimentale per la microscopia intravitale è descritta nella Figura 1. La preparazione del muscolo cremaster e la rimozione del tessuto connettivo è fondamentale per ottenere immag.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
IVM come metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare diversi tipi di cellule in diversi organi ed è stato ampiamente descritto e discusso19. L'obiettivo principale di questo studio è quello di fornire un approccio efficiente per impostare ed eseguire IVM nel muscolo cremaster. Praticare il metodo produrrà risultati affidabili e riproducibili. Pertanto, la pianificazione e la standardizzazione sono fattori chiave per padroneggiare la tecnica. Soprattutto, la tecnica dipende molto dai parametr.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF) 01GL1746E nell'ambito del Consorzio PRIMAL. Gli autori riconoscono Britta Heckmann e Silvia Pezer per un'abile assistenza tecnica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anestesia. Generico / IUPAC Nome: ketamina |
| xilazina | CP-Pharma GmbH | Codice articolo: 1205 | anestesia. Nome generico / IUPAC: xilazina (come idrocloruro) |
| Soluzione salina | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | preparazione chirurgica. Generico / IUPAC Nome: cloruro di sodio |
| Ago per siringa Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | preparazione chirurgica |
| Sutura 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | preparazione chirurgica |
| Tubo in polietilene #10 | BD GmbH | N. fornitore 427401 | preparazione chirurgica |
| Tubo in polietilene #90 | BD GmbH | N. fornitore 427421 | preparazione chirurgica |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Numero CAS 989-38-8 | colorazione leucocitaria. Generico / Nome IUPAC: etile 2-[3-(etilammino)-6-etilimmino-2,7-dimetilxantene-9-il]benzoato |
| Attrezzatura per l'installazione | |||
| Microscopio verticale | Olimpo | BX51W1 | microscopia |
| obiettivo 40 volte | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopia |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
Riferimenti
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
