Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii

Melina B. Cian; Nicole P. Giordano; Joshua A. Mettlach; Keaton  E. Minor; Zachary D. Dalebroux

doi:10.3791/60517

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Articolo metodologico

Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii

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DOI:

10.3791/60517

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10 aprile 2020

Melina B. Cian^*¹ , Nicole P. Giordano^*¹ , Joshua A. Mettlach^*¹ , Keaton E. Minor^*¹ , Zachary D. Dalebroux¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I batteri Gram-negativi producono due membrane selvadenti spazialmente. La membrana esterna è partizionata dalla membrana interna da un periplasma e da uno strato peptidoglycan. La capacità di isolare i doppi bistrati di questi microbi è stata fondamentale per comprendere la loro fisiologia e patogenesi.

Abstract

Questo metodo funziona partizionando l'involucro di batteri Gram-negativi in frazioni di membrana totale, interna ed esterna (OM) e si conclude con saggi per valutare la purezza dei bistrati. L'OM ha una densità complessiva aumentata rispetto alla membrana interna, in gran parte a causa della presenza di lipooligosaccori (LOS) e lipopolysaccharides (LPS) all'interno del volantino esterno. Le molecole LOS e LPS sono glicolipidi anfipatici che hanno una struttura simile, che consiste in un lipidico-Asaccharolipid e nucleo-oligosaccharide substituente. Tuttavia, solo le molecole LPS sono decorate con una terza sottounità nota come O-polysaccharide, o O-antigen. Il tipo e la quantità di glicolididi presenti influiranno sulla densità OM di un organismo. Pertanto, abbiamo testato se le membrane di batteri con contenuto glicolico vario potrebbero essere isolate in modo simile utilizzando la nostra tecnica. Per gli organismi che producono LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium e Escherichia coli, le membrane erano facilmente isolate e la moiety LPS O-antigene non ha influenzato il partizionamento del bistrato. Acinetobacter baumannii produce molecole LOS, che hanno una massa simile alle molecole LPS carenti di O-antigen; tuttavia, le membrane di questi microbi non potevano inizialmente essere separate. Abbiamo ragionato sul fatto che l'OM di A. baumannii era meno denso di quello di Enterobacteriaceae, quindi il gradiente di saccarosio è stato regolato e le membrane sono state isolate. La tecnica può quindi essere adattata e modificata per l'uso con altri organismi.

Introduzione

I batteri Gram-negativi producono due membrane separate da uno spazio periplasmico e da una parete cellulare peptidoglycan¹. La membrana interna (IM) racchiude il citosol ed è un bistrato simmetrico di fosfolipidi. Peptidoglycan protegge dalla pressione del turgor e fornisce al batterio una forma cellulare, ed è attaccato alla membrana esterna (OM) da lipoproteine²^,³. L'OM circonda il periplasma ed è prevalentemente asimmetrico. Il volantino interno è costituito da fosfolipidi e il volantino esterno è costituito da glicolipidi noti come lipooligosaccori (LOS) o lipopoliosaccori (LPS)