Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Sommario

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Abstract

La maggior parte delle ricerche che impiegano liposomi come sistemi modello di membrana o portatori di somministrazione di farmaci si basa su tecniche di lettura alla rinfusa e quindi presuppone intrinsecamente che tutti i liposomi dell'ensemble siano identici. Tuttavia, nuove piattaforme sperimentali in grado di osservare i liposomi a livello di particelle singole hanno permesso di eseguire studi altamente sofisticati e quantitativi sulle interazioni proteina-membrana o sulle proprietà dei portatori di farmaci sui singoli liposomi, evitando così gli errori dalla media dell'insieme. Qui presentiamo un protocollo per la preparazione, il rilevamento e l'analisi di singoli liposomi usando un analisi di microscopia basata sulla fluorescenza, facilitando tali misurazioni di particelle singole. L'impostazione consente di imaging singoli liposomi in modo massiccio parallelo e viene impiegato per rivelare le dimensioni intra-campione e le inomogeneità compositive. Inoltre, il protocollo descrive i vantaggi dello studio dei liposomi a livello singolo di liposoma, i limiti del saggio e le caratteristiche importanti da considerare quando lo si modifica per studiare altre domande di ricerca.

Introduzione

I liposomi sono vescicole sferiche a base di fosforelipidi che sono fortemente utilizzati sia nella ricerca di base che in quella applicata. Funzionano come eccellenti sistemi di modelli di membrana, perché le loro proprietà fisiochimiche possono essere facilmente manipolate variando i componenti lipidici che compongono il liposoma^1,2. Inoltre, i liposomi costituiscono il sistema di nanocarrier per la consegna di farmaci più utilizzato, offrendo una migliore farmacocinetica e farmacodinamica, nonché un'elevata biocompatibilità³.

Per molti anni, i liposomi son....

Protocollo

1. Preparazione del liposoma

NOTA: In breve, la preparazione dei liposomi di solito comprende tre passaggi cruciali: 1) la preparazione di pellicole lipidiche secche della composizione lipidica desiderata; 2) reidratazione dei lipidi per la formazione di liposomi; e 3) controllando le dimensioni e la lamellarità della popolazione lipososo.

1. Pesare i lipidi e scioglierli in tert-butanol:acqua (9:1) in fiale di vetro.
   1. Sciogliere POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW da 760 g/mol) a 50 mM.
   2. Sciogliere il colesterolo (MW - 387 g/mol) a 25 mM.
   3. Sciogliere DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycer....

Risultati

Seguendo il protocollo descritto è possibile l'immagine di singoli liposomi in modo parallelo massiccio (Figura 1). Il successo dell'immobilizzazione superficiale dei liposomi dovrebbe essere immediatamente evidente dopo l'aggiunta della soluzione liposomica alla camera (passaggio 3.6 nel protocollo) come diffrazione punti di intensità limitata dovrebbero apparire nell'immagine (Figura 1B e F.......

Discussione

È importante notare che mentre descriviamo in dettaglio come il singolo assaggio di liposomi può essere utilizzato per studiare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi, la piattaforma è molto versatile. Come precedentemente mostrato e discusso nell'introduzione, il protocollo può essere facilmente adattato per studiare gli aspetti della fusione membrana-membrana, delle interazioni proteina-membrana o della caratterizzazione del vettore di farmaci liposomici. Per qualsiasi problema scientifico affrontato, il pot.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini per microscopia a 8 pozzetti (& microvetrini)	Ibidi	80827	Vetrini per microscopia con fondo in vetro
Kit di estrusione Avanti Mini Lipidi	Avanti Polar	610000	I materiali di consumo (filtri Whatman) possono essere acquistati da GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Colesterolo	Avanti Polar Lipidi	700000	Scambiato attraverso Sigma
Computer con FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin deve essere installato. Inoltre, sarà necessario un software di gestione dei dati (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad, Prism ecc.) in grado di caricare .txt file per tracciare i dati.
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Scambiato tramite Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Liofilizzatore			, ad esempio ScanVac Coolsafe di Labogene,
fiale di vetro	cromatografia marrone	150903	fiale di vetro in grado di resistere al congelamento rapido in azoto liquido. La versione da 8 mL delle fiale ha una dimensione che si adatta anche alle siringhe del kit di estrusione
HCl	Honeywell Fluka	258148
Bagno			In grado di riscaldare a un minimo di 65 ° C
Piastra riscaldante con agitazione			In grado di riscaldare a un minimo di 65 ° C
HEPES	Sigma	H3375
Azoto			Compreso il contenitore per la conservazione, ad es. Bagno di gomma
Barre di agitazione magnetiche	VWR	442-4520 (EU)
Provette per microcentrifuga 1,5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
			è stato utilizzato
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Scambiato attraverso Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
terz-butanolo (2-metil-2-propanolo)	Honeywell Riedel-de Haë n	24127
		ultrapura	, ad es. MilliQ