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Articolo metodologico

Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi

12K visualizzazioni

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DOI:

10.3791/60543

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6 febbraio 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Biocontrol, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen (Zhongshan) University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo tre metodi per valutare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili sia in vivo che in vitro. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire promettenti terapie mirate alla migrazione dei neutrofili.

Abstract

I neutrofili sono un membro importante del sistema immunitario innato e svolgono ruoli fondamentali nella difesa dell'ospite contro agenti patogeni e reazioni infiammatorie patologiche. Neutrophils possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine. L'infiltrazione schiacciante dei neutrofili può portare a danni indiscriminati ai tessuti, come l'artrite reumatoide (RA). Neutrophils isolato dall'estuoper peritoneale rispondono a un chemioattraente definito, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro nei saggi della camera Transwell o zigzag. L'esperimento della sacca d'aria può essere utilizzato per valutare la chemiotassi dei neutrofili verso il lipopolissaccharide (LPS) in vivo. Il modello murino dell'artrite adiuvante (AA) è spesso usato nella ricerca RA, e la colorazione immunostochimica di sezioni congiunte con anticorpi anti-mieloperossia (MMP) o elagasi anti-neutrofili (NE) è un metodo ben consolidato per misurare infiltrazione neutrofila. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire terapie promettenti che prendono di mira la migrazione dei neutrofili.

Introduzione

I neutrofili sono i globuli bianchi più abbondanti e rappresentano il 50-70% dell'intera popolazione di globuli bianchi negli esseri umani1. I neutrofili sono uno dei principali soccorritori durante l'infiammazione acuta. I neutrofili possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine rilasciate dalle cellule residenti nei tessuti2,3,4, che è mediata dalle interazioni tra molecole di adesione cellulare sulla superficie di neutrofili e cellule endotelio vascolare 5. I neutrofili sono fondamentali per la difesa dell'ospite e svolgono un ruolo nelle reazioni infiammatorie patologiche a causa della loro potente capacità di danneggiare i tessuti attraverso il rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e altre molecole dannose per i tessuti3,6.

Studi precedenti hanno descritto diversi protocolli di isolamento dei neutrofili da topi o esseri umani. Oh e t. ha dimostrato un metodo di separazione del gradiente di densità per isolare i neutrofili umani dal sangue umano intero7. Tuttavia, l'isolamento di neutrofili sufficienti dal sangue di topo è difficile a causa del piccolo volume di sangue. In alternativa, un gran numero di neutrofili di topo puro e vitale può essere suscitato dal liquido peritoneale del topo, e questi neutrofili purificati possono essere utilizzati ex vivo per esaminare diversi aspetti delle funzioni cellulari ex vivo, tra cui l'infiltrazione dei neutrofili, la migrazione, il chemiotaxi, l'esplosione ossidativa, la citochina e la produzione di trapextra extrafilaretiche neutrofila (NET)8. Transwell saggi9 o saggi della camera di zigmond10,11 possono essere utilizzati per valutare la migrazione dei neutrofili in vitro. Il modello della sacca d'aria viene utilizzato per valutare la migrazione e l'infiltrazione di neutrofili in vivo. Il modello sottocutaneo della sacca d'aria è un comodo modello animale in vivo per studiare la migrazione delle cellule infiammatorie.

Tradizionalmente, i neutrofili erano considerati eliminatori patogeni nelle fasi acute dell'infiammazione. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che i neutrofili sono cellule complicate che svolgono una notevole varietà di funzioni specializzate. I neutrofili possono regolare molti processi come lesioni e riparazioni acute, tumorigenesi, risposta autoimmune e infiammazione cronica12,13. Neutrophils anche modulare le risposte immunitarie adattative e può regolare le cellule B e le cellule T14,15. La sostanziale carenza di neutrofili porta alla mortalità o alla grave immunodeficienza nell'uomo e l'esaurimento dei neutrofili nei topi porta alla fatalità, mentre l'attivazione o il reclutamento eccessivo di neutrofili negli organi causa diverse malattie immunitarie, come l'artrite reumatoide (RA) e lupus erythematosus (SLE)6. I neutrofili sono le cellule più abbondanti nel fluido sinoviale dei pazienti affetti da RA. Neutrophils producono quantità eccessive di mieloperossia (MPO) e elastasi neutrofili (NE) attraverso la degradazione, che esacerba l'erosione della cartilagine. MPO è un enzima perossidasi espresso principalmente nei granuli dei neutrofili16. NE è associato alla distruzione della cartilagine articolare17. MPO e NE potrebbero essere utilizzati per valutare lo stato della migrazione dei neutrofili e dell'infiltrazione nel tessuto dei pazienti affetti da RA.

Questo articolo fornisce tre metodi convenzionali per valutare la migrazione di neutrofili normali indotti sia in vivo che in vitro, così come l'infiltrazione di neutrofili patologici in un modello di infiammazione specifico dell'articolazione del topo.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state riviste e approvate dall'Università di Pechino di Medicina Cinese Animal Care and Use Committee.

NOTA: sono stati utilizzati topi C57BL/6 (7-8 settimane).

1. Isolamento neutrofilo

  1. Acquisizione di cellule essudati peritoneali
    1. Preparare fresco 10% soluzione peptone proteose in ddH2O. Calcolare il volume necessario in base al numero di topi.
      NOTA: Impostare il numero di mouse come N, (2N- 1) mL di soluzione deve essere dissolto e filtrato in anticipo.
    2. Spruzzare lo spazio di lavoro con 70% di etanolo. Utilizzare un iniettore di insulina per disegnare 1 mL di soluzione peptone e scaricare bolle.
    3. Condurre la prima iniezione intraperitoneale di 1 mL di soluzione peptone per mouse.
      1. Afferra il mouse in una posizione head-down con una mano. Disinfettare il punto di iniezione con batuffoli di cotone imbevuti di alcool.
        NOTA: La posizione di iniezione preferita si trova nell'aspetto laterale del quadrante inferiore sinistro o destro dell'addome.
      2. Infondere rapidamente i reagenti. Iniettare 1 mL nella cavità peritoneale di ogni topo con l'iniettore di insulina.
        NOTA: L'angolo tra l'ago e la pelle dovrebbe essere di circa 15-30 gradi per evitare di ferire l'intestino o altri organi.
    4. Consentire alla risposta infiammatoria di svilupparsi durante la notte. Dopo 12 h, condurre la seconda iniezione nello stesso modo della prima iniezione.
    5. Tre ore dopo la seconda iniezione, i topi completamente anestesi con 5% di isoflurane per 5 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min. Rimuovere i topi anestesi dalla camera e sacrificarli con la lussazione cervicale.
      NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate.
      NOTA: Tutti i seguenti passaggi devono essere elaborati in una cappa di coltura tissutale.
    6. Spruzzare il mouse con 70% di etanolo. Posare il mouse su un tampone di plastica sterile e fissare gli arti con gli aghi.
    7. Utilizzare una serie sterile di strumenti chirurgici per fare un'incisione orizzontale (1 cm) al centro dell'addome inferiore. Sollevare la pelle dell'addome superiore con pinze e tagliare lungo la linea mediana dell'addome ed esporre la parete peritoneale intatta.
    8. Iniettare 5 mL di RPMI-1640 sterile mezzo completo nella cavità addominale con un ago 30 G x 1/2.Injectato Inserire l'ago attraverso la parete peritoneale con il bordo smussato dell'ago rivolto verso l'alto e iniettare l'intero volume.
    9. Agitare il pad orizzontalmente per 5 min. Massaggiare delicatamente l'addome più volte.
    10. Iniettare un ago da 23 G x 1 1/4" nello spazio laterale dell'addome. Estrarre il liquido addominale (5 mL) e raccoglierlo in un tubo di centrifuga di 50 mL.
      NOTA: Posizionare i tubi sul ghiaccio il prima possibile in caso di attivazione di neutrofili.
    11. Iniettare altri 5 mL di mezzo completo e ripetere la procedura per rimuovere le cellule rimanenti dal peritoneo. Mettere in comune il liquido peritoneale nel tubo di centrifugazione da 50 mL.
    12. Centrifugare il fluido peritoneale in pool a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT).
    13. Scartare il super-attardato. Risospendere le celle in 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo.
      NOTA: Non vortice per evitare l'attivazione dei neutrofili.
  2. Isolamento dei neutrofili
    1. Aggiungere 4 mL di mezzo sfumato di 70,2% di densità appena preparato (ad esempio, Percoll) in un tubo di centrifuga da 15 mL.
    2. Sovrappone con attenzione 4 mL di mezzo sfumato appena preparato al 54,8% di densità sul mezzo di pendenza densità 70,2% lentamente lungo il bordo del tubo con punte di pipetta affilate nel tubo di centrifuga di 15 mL.
      NOTA: Prestare attenzione per evitare di disturbare l'interfaccia tra il mezzo gradiente di densità del 54,8% e il mezzo di sfumatura di densità 70,2%.
    3. Sovrapponete con cura la sospensione cellulare peritoneale da 1 mL sopra lo strato medio di pendenza a densità 54,8% lentamente con punte pipette affilate (Figura 1A).
      NOTA: Prestare attenzione per evitare di disturbare l'interfaccia tra la sospensione cellulare e il mezzo di gradiente di densità del 54,8%.
    4. Centrifuga a 1.500 x g per 30 min a 22 gradi centigradi senza frenata.
    5. Raccogliere i neutrofili nell'interfaccia del mezzo gradiente di densità del 54,8% e dei livelli medi del gradiente di densità del 70,2% (Figura 1B) in un nuovo tubo.
    6. Aggiungere 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo alle cellule raccolte e riutilizzare con attenzione le cellule pipettando delicatamente più volte. Centrifuga a 100 x g per 10 min a RT e rimuovere con attenzione il supernatante.
    7. Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggio 1.2.6) una volta.
    8. Aggiungere 0,5 mL di mezzo di coltura al pellet e rimettere in sospensione le cellule pipettando delicatamente più volte. Prendere un'aliquota 50 -L per contare le cellule utilizzando un analizzatore automatico di ematologia.

2. Analisi della migrazione neutrofilo

  1. Misurare la migrazione dei neutrofili da parte dell'analisi di Transwell9 o dell'analisi della camera di zigzogo come descritto in precedenza10,11.

3. Asdetto della sacca dell'aria

  1. Prima iniezione d'aria
    1. Il giorno 0, i topi completamente anantroposi con il 5% di isoflurane per 3 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min, e mantengono l'anestesia di ogni topo in una singola unità respiratoria con 2% isoflurane ad una velocità di 0,5 L/min.
      NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate.
    2. Per ottenere un volume di aria sterilizzata, utilizzare un filtro da 0,22 m collegato a una siringa da 5 mL.
    3. Sollevare la pelle posteriore del topo anetizzato con una pinzetta e iniettare sottocutaneamente 3 mL di aria sterilizzata utilizzando un ago da 26 G x 3/8.Lift the back skin of the anthetitized mouse with traweezers and subcutaneously inject 3 mL of sterilized air using a 26 G x 3/8" needle.
    4. Dopo il trattamento, rimuovere i topi dall'unità di respirazione. Monitorare i topi per assicurarsi che siano in vita fino a quando iniziano a muoversi.
  2. Seconda iniezione d'aria
    1. Il giorno 3, iniettare altri 3 mL di aria sterilizzata nella tasca dell'aria precedentemente stabilita per sostenere la sacca d'aria come descritto nella sezione 3.1.
  3. Trattamento
    1. Il giorno 6, 6 h prima del sacrificio, iniettare diversi trattamenti nella sacca dell'aria. Iniettare 1 mL di salina con buffer fosfato (PBS) come controllo negativo. Iniettare 1 mL di 1 G/mL LPS come controllo positivo per indurre l'infiammazione locale.
    2. Topi completamente anestesizzare con 5% isoflurane per 3 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min, e mantenere l'anestesia di ogni topo in una singola unità respiratoria con 2% di isoflurane ad una velocità di 0,5 L/min. Preparare il buffer di lavaggio secondo il tavolo dei materiali.
      NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate.
    3. Per ogni sacca d'aria, lavare la sacca dell'aria con 1 mL di tampone di lavaggio e raccogliere l'essenza infiammatoria in un tubo di centrifuga di 15 mL. Lavare la sacca dell'aria con 2 mL di lavaggio tampone 2x e raccogliere l'estuoso infiammatorio nello stesso tubo di centrifuga.
    4. Centrifuga a 100 x g per 10 min a RT. Scartare il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lavaggio. Contare le cellule per quantificare il rapporto neutrofilo utilizzando l'analizzatore automatico di ematologia.
      NOTA: Vedere risultati rappresentativi nella figura 2.

4. Induzione del modello murino di artrite adiuvante (AA)

  1. Sospendere l'adiuvante di Freund (CFA) completa vorticendo almeno 5 s, quindi disegnare 100 - L di sospensione in un iniettore di insulina.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare un CFA completamente nuovo negli esperimenti per garantire la sterilità.
  2. Anestesizzare i topi come descritto nel passaggio 3.1.1.
  3. Contrassegnare la zampa prescelta e iniettare 20 L di CFA nello spazio dell'articolazione della caviglia. Iniettare 20 - L di sospensione in quattro punti periarticolari sulla zampa prescelta (80 - L in totale).
  4. Rimuovere i topi dall'unità di respirazione e mettere i topi trasformati in una nuova camera. Monitorare i topi per assicurarsi che stiano respirando fino a quando non riacquistano la capacità di muoversi.
  5. Ogni 3 giorni, valutare il diametro articolare misurando il diametro dell'articolazione della caviglia utilizzando un indicatore di spessore della tasca (Figura 3A).
  6. Ogni 3 giorni, valutare la gravità dell'artrite in base al criterio di punteggio dell'artrite (Figura 3C): 0, normale, nessuna prova di erestesia e gonfiore; 1, l'artrite mipiù, l'eritema e il lieve gonfiore confinati al tarsals o all'articolazione della caviglia; 2, artrite moderata, eritthema e gonfiore lieve che si estende dalla caviglia ai tarsali; 3, grave artrite, eritema e gonfiore moderato che si estende dalla caviglia alle articolazioni metatarsche; 4, l'artrite più grave, l'eritema e il grave gonfiore comprendono la caviglia, il piede e le cifre, o l'ankylosi dell'arto.

5. Colorazione immunostochimica delle sezioni articolari

  1. Isolamento congiunto
    1. Sacrificare il topo nella sezione 4 utilizzando la lussazione cervicale dopo l'anestesia con isoflurane. Spruzzare il mouse con 70% di etanolo.
    2. Rimuovere la pelle e parte del muscolo dalla gamba posteriore con pinzette e forbici. Spruzzare l'articolazione con il 70% di etanolo e rimuovere il resto dei muscoli utilizzando un tovagliolo di carta.
    3. Fissare l'articolazione della caviglia in 4% paraformaldeide per 2 giorni a RT. Decalcify l'articolazione in 10% EDTA per 1 mese a RT e cambiare il medio settimanale.
    4. Incorporare il tessuto in paraffina e preparare sezioni di tessuto spesso 4 m.
      1. Mettere il tessuto in uno stampo marcato con un certo volume di paraffina liquida. Raffreddare brevemente.
      2. Impostare lo spessore a 4 m e tagliare le fette su un microtoma. Galleggiare le sezioni in un bagno d'acqua a 43 gradi centigradi.
      3. Montare le sezioni sugli scivoli e mettere i vetrini in forno a 70 gradi per 2 ore. Per un uso futuro, conservare i vetrini a -20 gradi centigradi.
  2. Safranin O e colorazione verde veloce delle sezioni articolari
    NOTA: le seguenti fasi di colorazione vengono eseguite in RT.
    1. Posizionare i vetrini dal passo 5.1.4.3 in un rack ed eseguire i seguenti lavaggi per reidratare a RT: xilene per 5 min (3x), 100% etanolo per 2 min (2x), 95% etanolo per 2 min (2x), 70% etanolo per 2 min, e 50% etanolo per 15 min.
    2. Macchie in soluzione verde veloce 0.1% per 5 min.
    3. Macchie nello 0,1% safranin O soluzione di colorazione per 20 min. Immergere i vetrini nei seguenti lavamenti: 95% etanolo per 2 min (2x), 100% etanolo per 2 min (2x) e xilene per 2 min (2x).
    4. Montare le sezioni di tessuto e osservare i tessuti al microscopio.
      NOTA: Vedere immagini rappresentative nella Figura 4A.
  3. Colorazione immunoistochimica per visualizzare i neutrofili
    1. Cuocere le sezioni di paraffina per 2 h a 78 gradi centigradi. Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti lavamenti per reidratarsi a RT: xilene per 15 min (2x), 100% etanolo per 5 min (2x), 95% etanolo per 5 min, 80% etanolo per 5 min, H2O per 3 min e PBS per 3 min.
      NOTA: Non lasciare asciugare i vetrini in qualsiasi momento durante questo passaggio.
    2. Aggiungere una goccia di buffer di permeabilizzazione per coprire il tessuto. Incubare le sezioni in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi centigradi.
    3. Risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x). Evitare di sciacquare il tessuto direttamente.
    4. Eseguire il recupero dell'epitopo dell'antigene indotto dal calore utilizzando una caldaia a pressione.
      1. Disporre i vetrini in un rack. Immergere i vetrini nella caldaia a pressione riempita con buffer di recupero.
      2. Mettere la caldaia a pressione su un forno a microonde. Impostare il forno a microonde a 600 W e riscaldare i vetrini per 10 min.
      3. Dopo l'ebollizione, tenere gli spogli nella caldaia a raffreddare a 90 gradi centigradi. Estrarre i vetrini e sciacquarli in PBS per 3 min (3x).
    5. Quench endogena attività perossidasi in appena preparato 3% H2O2 a 15 min. Sciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).
    6. Delineare un grande cerchio intorno al campione con una penna idrofobica, evitare di toccare il campione. Blocco con 3% di albumina di siero bovino (BSA) in una camera controllata dall'umidità a 37 gradi centigradi per 60 min.
    7. Rimuovere la soluzione di blocco. Aggiungete rapidamente 50 -L di anticorpo primario diluito pbS ad ogni sezione. Quindi, incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 4 gradi durante la notte.
      NOTA: per diversi anticorpi vengono utilizzati rapporti di diluizione diversi (1:25 per MPO e 1:20 per NE).
    8. Il secondo giorno, estrarre il vassoio e lasciarlo riposare a RT per 30 min. Quindi, risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).
    9. Aggiungere al tessuto 50 - L di anticorpi secondari diluiti PBS.
      NOTA: Sono stati applicati diversi rapporti di diluizione: 1:1,000 per MPO e 1:1.500 per NE.
    10. Incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi centigradi per 30 min. Quindi, risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).
    11. Sviluppare in diluito 3,3'-diaminobenzidina (DAB) soluzione per 5 min. Tieni d'occhio la reazione in caso di sviluppo di un colore scuro. Sciacquare gli scivoli in acqua distillata.
    12. Controsta gli scivoli in ematossino per 10 s. Sinsegli s in acqua del rubinetto per 5 min.
    13. Risciacquare in alcool acido soluzione di differenziazione superveloce alcool per 3 s. Quindi risciacquare nell'acqua del rubinetto per 10 min.
    14. Immergere i vetrini nei seguenti lavamenti a RT: 80% etanolo per 5 min, 95% etanolo per 5 min, 100% etanolo per 5 min e xilene per 15 min (2x). Fissare il coperchio con la soluzione di montaggio. Osservare il tessuto al microscopio.
      NOTA: Vedere immagini rappresentative nella figura 4B.

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Risultati

Le cellule di essutazione peritoneale sono state raccolte dal liquido di lavaggio dei topi. Le celle sono state risospese in 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo, sovrapposte a due fasi (54,8%/70,2%) sfumatura di densità discontinua (Figura 1A) e centrifugate a 1.500 x g per 30 min. Neutrophils (-95%, 1 x 107 neutrofili/topo) sono state recuperate dall'interfaccia inferiore (Figura 1B

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Discussione

Protocolli dettagliati di neutrofili altamente purificati dal sangue periferico7, midollo osseo e tessuti18 sono stati disponibili per lungo tempo. Qui adottiamo un metodo per isolare i neutrofili dal liquido peritoneale19 in cui i neutrofili maturi rimangono inattivati per ulteriori studi anti-infiammatori e antiossidanti.

Abbiamo usato l'esperimento della sacca d'aria per esplorare l'infiltrazione indotta da LPS dei neut...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 81430099 e 31500704), cooperazione internazionale e progetti di scambio (numero di sovvenzione 2014DFA32950), e il programma di ricerca dell'Università di Pechino di medicina cinese ( sovvenzione BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).

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Materiali

2
Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione Fast Green allo 0,1%Solarbio8348bTrasferire 20 mg di grane veloce FCF in un flaconcino in un altro becher da 100 mL. Aggiungere 20 mL di H2O nel becher e sciogliere la macchia mescolando per ottenere una soluzione verde rapida allo 0,1% e filtrarla con un filtro Nalgene PES 75mm
0,1% Safranin O Soluzione coloranteSolarbio8348aTrasferire 20 mg di colorante di safranina O in una fiala in un becher da 100 ml. Aggiungere 20 mL di H2O nel becher e sciogliere la macchia mescolando per ottenere una soluzione colorante di safranina O allo 0,1% e filtrarla con un filtro Nalgene PES da 75 mm
Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) da 0,5 M, pH 8,0Sigma324506sterile
100% etanoloBeijing Chemical Works
100% metanoloChemical Works
Provetta da centrifuga in polipropilene conico da 15 mLFalcon14-959-53A
23 G x 1 1/4" AgoBD305120
26 G x 3/8" AgoBD305110
3% albumina sierica bovina (BSA)Sciogliere 0,3 g di BSA in 10 mL di PBS
3% H2O2Miscelare 1 mL 30% H2O2 con metanolo con 9 mL di metanolo
3,3'-diaminobenzidina (DAB)kit ZSGB-BIOZLI-9018
30 G x 1/2" AgoBD305106
30% H2O2Beijing Chemical Works
Siringa da 5 mLBDZ683574
Provetta da centrifuga conica in polipropilene da 50 mLFalcon14-432-22
etanolo al 50% 500 mL di etanoloal 100% con 500 mL di dH2O
54,8% di PercollMix 2,74 mL SIP con 2,26 mL 1&volte; PBS, da fermo
70% Miscela di etanolo700 mL 100% etanolo con 300 mL dH2O
70,2% PercollMix 3,51 mL SIP con 1,49 mL 1&volte; PBS, da fermo
Miscela di etanolo all'80%800 mL di etanolo al 100% con 200 mL di dH2O
ab208670
Anticorpo anti-neutrofili elastasiAbcamab21595
Analizzatore ematologico automaticoSysmexXS-800i
Albumina sierica bovina (BSA)VWR0332-100G
Adiuvante completo di Freund, 10 mg/mlsigma1002036152
Vetrino coprioggettoCITOGLAS10212432C
Misuratore di spessore a quadranteMitutoyo7301
Eppendorf Microtubes, 1,5 mLSigmaZ606340
Siero bovino fetale (FBS) PremiumPANP30-1302
Sistema di anestesia gassosaZS DichuangZS-MV-IV
IgG anti-coniglio di capra H& L (HRP)PPLYGENC1309Questo è l'anticorpo secondario utilizzato nella colorazione immunoistochimica.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Biological Industries, Beth HaEmek, Israele02-016-1ASoluzione sterile
per colorazione con ematossilinaZSGB-BIOZLI-9609
Lipopolisaccaride (LPS)SigmaL3012
MEDIA E INTEGRATORI
Safranin modificata O-fast Green FCF Cartilage Stain KitSolarbioG1371
N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP)Sigma47729
Penicillina Streptomicina soluzione, 100&volte;Invitrogen1514022
PercollGE Healthcare10245207Gradiente di densità medio
Miscela tampone100 μ L Triton X-100 con 1 L dH2O per ottenere lo 0,01% di
soluzione salina tampone fosfato Triton X-100 (PBS), 1&volte;Miscelare 90% ddH2O con 10% (v/v) 10&volte; PBS,
salina tampone fosfato autoclavato (PBS), 10&volte;Sciogliere 16 g di NaCl, 0,4 g di KCl, 2,88 g di Na2HPO4· 2H2O, 0,48 g KH2PO4 (anidro) in 200 mL ddH2O, regolare pH 7,4, autoclavato
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteoso PeptoneOxoid1865317
Bufferdi recuperoMiscelare 18 mL di tampone di recupero A con 82 mL di tampone di recupero B, aggiungere dH2O a 1000 mL, regolare il pH a 6,0
Tampone di recupero A Stock per IHCSciogliere 4,2 g di acido citrico (C6H5O7· H2O) in 200 mL dH2O
Tampone di recupero B Stock per IHCSciogliere 5,88 g di citrato trisodico diidrato (C6H5Na3O7· 2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumSigmaR8758
RPMI-1640 Complete MediumRPMI-1640 medium è integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina.
Shu Rui U40 Ago per iniezione di insulina sterile monouso 1 mLBD328421
SlideCITOGLAS10127105P-G
SOLUZIONE
Acido acido corto (SIP)Mescolare il 90% (v/v) di percoll con il 10% (v/v) 10× PBS, rimanere fermi per 20 minuti
Tampone di lavaggio nel saggioDiluire da 0,5 M EDTA a 10 mM con HBSS
XileneBeijing Chemical Works
Beijing Miscela diMiscela di etanolo al 95% 950 mL di etanolo al 100% con 50 mL di dHO Soluzione di differenziazione superveloce dell'alcol Beyotime C0165S ANTICORPI Anti-mieloperossidasi Anticorpo Abcam di permeabilizzazione soluzione della sacca d'aria

Riferimenti

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