Microarray di bioparticelle per l'analisi chemiotattica e molecolare dello sciame neutrofilo umano in vitro

Sommario

Questo protocollo genera microarray di bioparticelle che forniscono brulio di neutrofoni controllati spazialmente. Fornisce un facile accesso ai mediatori che i neutrofili rilasciano durante la migrazione e consente l'analisi quantitativa dell'imaging.

Abstract

Lo sciame neutrofilo è un processo cooperativo attraverso il quale i neutrofili sigillano un sito di infezione e promuovono la riorganizzazione dei tessuti. Lo sciame è stato studiato in modo classico in vivo in modelli animali che mostrano modelli caratteristici della migrazione cellulare. Tuttavia, i modelli in vivo hanno diverse limitazioni, tra cui mediatori intercellulari che sono difficili da accedere e analizzare, così come l'incapacità di analizzare direttamente i neutrofili umani. A causa di queste limitazioni, c'è bisogno di una piattaforma in vitro che studia brulicante di neutrofili umani e fornisce un facile accesso ai segnali molecolari generati durante lo sciame. Qui, un processo di microstampa multifase viene utilizzato per generare un microarray di bioparticelle che stimola lo sciame imitando un'infezione in vivo. Il microarray di bioparticelle induce i neutrofili a sciamare in modo controllato e stabile. Sul microarray, i neutrofili aumentano di velocità e formano sciami stabili intorno ai cluster di bioparticelle. Inoltre, è stato analizzato il supernatante generato dai neutrofili e si è scoperto che 16 proteine sono state espresse in modo differenziale nel corso dello sciame. Questa piattaforma di brulichi in vitro facilita l'analisi diretta della migrazione dei neutrofili e del rilascio di proteine in modo riproducibile e controllato dallo spazio.

Introduzione

Neutrofili, il più abbondante globulo bianco nel flusso sanguigno¹, stanno guadagnando l'attenzione come potenziali bersagli diagnostici e terapeutici^2,3 perché possono essere coinvolti in una varietà di condizioni mediche tra cui gotta⁴, sepsi³, trauma^5,6, cancro^1,7,8, e varie malattie autoimmuni^5,9. Lo sciame neutrofilo è un processo multifase, strettamente regolato con una complessità che lo rende un focus particolarmente interessante di studio^5,10,11. Durante lo sciame, i neutrofili isolano un sito di infiammazione dal tessuto sano circostante^5,10,11. Una corretta regolazione del brulicante di neutrofoni è essenziale per promuovere la guarigione delle ferite e, in ultima analisi, la risoluzione dell'infiammazione^5,12. Lo sciame neutrofilo è stato studiato principalmente in vivo nel roditore^12,13,14,15 e pesce zebra^10,11,12,15 modelli. Tuttavia, la natura di questi modelli animali in vivo dà luogo a limitazioni⁵. Ad esempio, i mediatori rilasciati dai neutrofili durante lo sciame non sono facilmente accessibili per l'analisi⁵. Inoltre, ci sono molte fonti potenziali per un determinato mediatore in vivo, quindi un esperimento in vivo deve introdurre una carenza genetica per inibire la produzione cellulare e/o l'interazione al fine di studiare il ruolo di quel mediatore in un dato processo¹³. Un esperimento in vitro aggira questa complicazione consentendo l'osservazione dei neutrofili senza il contesto di cellule aggiuntive. Inoltre, la ricerca che descrive la migrazione coordinata dei neutrofili umani è limitata^{di 16}. Su una piattaforma di bruliè in vitro, i neutrofili umani possono essere analizzati direttamente. Una piattaforma di brulicante in vitro potrebbe ampliare le conoscenze acquisite dagli studi in vivo fornendo opportunità per colmare le lacune lasciate dai limiti degli studi in vivo.

Per rispondere alla necessità di una piattaforma in vitro che imita il brulicare di neutroni in vivo, abbiamo sviluppato una piattaforma di microstamping che ci permette di patternare microarray di bioparticelle che stimolano il brulicare di neutroni in modo controllato spazialmente. Noi generiamo microarray di bioparticelle su vetrini di vetro in un processo in due fasi. In primo luogo, utilizziamo il microstamping per generare un microarray di macchie di polielettrolita cationico (CP). In secondo luogo, aggiungiamo una soluzione di bioparticelle che aderiscono alle macchie CP tramite interazione elettrostatica. Modellando prima lo strato CP, possiamo modellizzare selettivamente bioparticelle caricate negativamente per generare il modello di brulicante di neutrofili desiderato. Lo strato caricato positivamente contiene le bioparticelle caricate negativamente attraverso la fase di lavaggio vigoroso che rimuove le bioparticelle dalle aree sul vetrino che non hanno il CP. Inoltre, il CP utilizzato qui, un copolimero di acrilammide e monomero cationico quaternizzato, è biocompatibile, quindi non induce una risposta dai neutrofili. Ha una carica superficiale molto alta che immobilizza le bioparticelle di dimensioni micron al vetrino di vetro, impedendo così ai neutrofili di rimuovere le particelle dalla posizione modellata sul vetrino di vetro. Ciò si traduce in cluster di bioparticelle disposti in un microarray. Quando abbiamo aggiunto i neutrofili al microarray, formavano sciami stabili intorno agli ammassi di bioparticelle. Attraverso il monitoraggio della migrazione dei neutrofili, abbiamo scoperto che i neutrofili brulicanti migrano attivamente verso i cluster di bioparticelle. Inoltre, abbiamo usato questa piattaforma per analizzare alcuni mediatori che i neutrofili rilasciano durante lo sciame. Abbiamo trovato 16 mediatori che sono espressi in modo differenziale durante lo sciame. Le loro concentrazioni seguono tre tendenze generali nel tempo: aumento, diminuzione o picco. La nostra piattaforma di brulichi neutrofili in vitro facilita l'analisi del brulicare di neutrofi umani controllato spazialmente, così come la raccolta e l'analisi di mediatori rilasciati da brulicanti di neutrofoni. In una pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato che i pazienti con determinate condizioni mediche (trauma, malattia autoimmune e sepsi), avevano neutrofili che funzionavano in modo diverso rispetto a quelli provenienti da donatori sani⁵. In studi di ricerca futuri, la nostra piattaforma potrebbe essere utilizzata per analizzare la funzione neutrofila tra una varietà di popolazioni di pazienti. Questa piattaforma può analizzare quantitativamente la complessa coordinazione coinvolta nello sciame neutrofico. Ulteriori studi possono essere fatti per fornire informazioni sulla funzione neutrofila di una specifica popolazione di pazienti o la risposta dei neutrofili a un agente patogeno di interesse.

Protocollo

Gli autori riconoscono i volontari sani che hanno gentilmente donato il loro sangue. Gli esemplari di sangue sono stati ottenuti dopo il consenso volontario informato secondo il protocollo dell'IRB (Institutional Review Board) #2018H0268 esaminato dal Comitato di Scienze Biomediche della Ohio State University.

1. Microfabbricazione di microarray di microparticelle di bioparticelle

1. Utilizzando procedure di fotolitografia standard, generare il wafer di silicio master.
   1. Generare una prova del disegno desiderato utilizzando un software CAD (Computer-Aided Design), quindi inviare a un produttore di fotomaschera per produrre una maschera fotografica cromata. Il design qui utilizzato è composto da 4 mm x 4 mm di array rettangolari di 30 m di diametro riempiti in cerchi con una spaziatura centrale-centrale di 150 m. Questo design può essere modificato come desiderato per diverse applicazioni.
   2. Spincoat uno strato di 40 m di spessore di un fotoresist negativo su un wafer di silicio. Cuocere il wafer a 65 gradi centigradi per 5 min e 95 gradi centigradi per 10 min.
   3. Esporre il wafer alla luce UV attraverso una fotomaschera cromata con 150-160 mJ/cm² (Figura 1A).
   4. Cuocere il wafer a 65 gradi centigradi per 5 min e 95 gradi centigradi per 10 min. In questa fase, il modello dovrebbe essere visibile sul wafer (Figura 1B).
2. Mescolare accuratamente un rapporto 10:1 di prepomero polidimetiloxanano e il suo agente di polimerazione (cioè 20 g di prepolimero e 2 g di agente di polimeraggio) e versare la miscela polidimetilsiloxane (PDMS) non curata sul wafer principale in una parabola petri(Figura 1C).
3. Il vuoto tratta la miscela PDMS non curata fino a quando non sono presenti bolle d'aria sul wafer principale. Curare a 65 gradi centigradi durante la notte.
4. Utilizzare un bisturi per tagliare intorno all'esterno della sezione modellata del wafer e rimuovere lentamente la lastra PDMS curata. Posizionare la lastra PDMS su un tagliere pulito con il lato modellato rivolto verso l'alto (Figura 1D).
5. Estrarre singoli francobolli dalla lastra PDMS con un punzone biopsia di 8 mm(Figura 1E). Per uno scivolo di vetro, saranno necessari otto francobolli.
6. Posizionare ogni timbro a faccia in giù sul nastro adesivo per rimuovere eventuali detriti.
7. In anticipo, preparare una soluzione da 1,6 mg/mL di CP in acqua.
   1. Aggiungere la quantità corretta della polvere CP all'acqua (ad esempio, da 0,8 g a 500 mL).
   2. Mescolare su una piastra di mescolare a temperatura ambiente durante la notte, o fino a quando tutto il solido è sciolto in acqua. La soluzione CP può essere conservata a temperatura ambiente per 6 mesi.
   3. Se lo si desidera, rendere fluorescente la soluzione CP aggiungendo poli-L-lisina etichettata con fluoresceinisiocianato (PLL-FITC).
      1. Aliquota circa 10 mL della soluzione CP. Aggiungere una piccola quantità di PLL-FITC (0,05 mg) al volume di aliquota. La quantità può essere modificata per regolare la luminosità della fluorescenza come desiderato.
      2. Vortex la soluzione CP etichettata con FITC per 20 s, o fino a quando la soluzione è un uniforme, colore giallo pallido. Proteggere dalla luce e conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
8. Con i francobolli a faccia in su, prime ogni timbro con 100 sL di 1,6 mg/mL soluzione di CP, assicurando non si formano bolle d'aria tra la soluzione CP e il timbro (Figura 1F).
9. Invertire i timbri su uno strato di soluzione CP (Figura 1G).
10. Rimuovere i francobolli dalla soluzione CP dopo 1 h.
11. Dab ogni timbro bagnato a faccia in giù su uno scivolo di vetro pulito 6–8x per rimuovere il liquido in eccesso.
12. Vuoto trattare i francobolli per 1-2 min.
13. Aderire un distanziale di imaging di 8 pozzi, 9 mm di diametro sulla parte superiore di un vetrino pulito come guida per il posizionamento del francobollo. Con questo distanziale, ogni vetrino può avere otto microarray.
14. Posizionare un timbro a faccia in giù sulla diapositiva di vetro al centro di ogni pozzetto del distanziale di imaging (ad esempio, utilizzare otto francobolli in totale).
15. Posizionare un peso bilanciato di 5,6 x 0,1 g sopra ogni timbro e attendere 10 min per la stampa (Figura 1H). È necessario un peso equilibrato per garantire che il francobollo venga premuto uniformemente sul vetrino di vetro e promuovere anche il trasferimento del CP al vetrino di vetro.
16. Rimuovere i pesi e i francobolli dalla vetrina di vetro (Figura 1I). Lasciare asciugare lo strato CP a temperatura ambiente per 24 h prima di aggiungere le bioparticelle, come descritto al punto 1.17. Se il CP è contrassegnato con FITC, l'efficacia della stampaggio può essere verificata a questo punto con un microscopio fluorescente a 488 nm prima di procedere al passaggio 1.17 (Figura 1M).
17. Tagliare una lastra PDMS vuota alle dimensioni del distanziale di imaging e utilizzare il punzone biopsia da 8 mm per creare pozzi nel PDMS che si allineano con i pozzetti di un distanziale di imaging. Aderire la lastra PDMS alla diapositiva di vetro con il distanziale di imaging (Figura 1J).
18. Scongelare una soluzione di bioparticelle (ad es. coli o zymosan) e diluire a 500 g/mL in acqua per l'iniezione (WFI).
    NOTA: Le bioparticelle non hanno bisogno di essere opsonizzate. I recettori della superficie neutrofilo riconoscono direttamente le molecole su queste bioparticelle^19,20,21.
19. Aggiungete 100 l di bioparticelle a ogni PDMS bene sul vetrino di vetro (Figura 1K).
20. Far rock lo scivolo di vetro per 30 min.
21. Sciacquare accuratamente i pozzi con acqua. Il microarray di bioparticelle può essere conservato in un ambiente privo di polvere a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi. A questo punto, il modello deve essere controllato con un microscopio fluorescente a 594 nm prima di procedere al passaggio 2.1 (Figura 1N).

2. Preparazione del campione

1. Raccogliere almeno 2 mL di sangue fresco nei tubi K2-EDTA dal donatore desiderato. La resa prevista dei neutrofili è 1–2 x 10⁶ cellule/1 mL di sangue intero. Il saggio di imaging richiede circa 1,5 x 10⁵ neutrofili, e l'analisi del supernatante richiede 1 x 10⁶ neutrofili. Utilizzare il sangue entro 4 h.
2. Separare i globuli rossi (RBC) aggiungendo un agente di aggregazione eritrociti in un rapporto 1:5 all'intero sangue. Attendere 45 min per uno strato traslucido (cappotto di bufala) per separare dallo strato di RBC.
3. Rimuovere il buffy coat e lavare con fosfato tamponato salina (PBS) utilizzando 1 mL di bufala: 9 mL PBS.
4. Centrifuga per 5 min a 190 x g e 20 gradi centigradi.
5. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet a 5 x 10⁷ celle / mL.
6. Utilizzare un kit di selezione immunomagnetica negativa per isolare i neutrofili.
   1. Aggiungere 50 - L di anticorpo cocktail/1 mL di sospensione cellulare. Attendere 10 min.
   2. Aggiungete 100 l di perline magnetiche/1 mL di sospensione cellulare. Attendere 10 min.
   3. Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo rotondo e posizionare in un magnete cilindrico. Attendere 10 min.
7. Versare il supernatante in un tubo di centrifuga. Aggiungere fino a 10 mL di PBS. Centrifuga per 5 min a 190 x g e 20 gradi centigradi.
8. Aspiratore supernatante. Risospendi il pellet bianco in IMDM con 0.4% albumin sieri umano.
9. Nuclei macchiati con 20 sg/mL Hoechst 33342 per 10 min a 37 gradi centigradi.
10. Aggiungi 5 mL di IMDM con 0.4% albumin siero umano per risciacquare. Centrifuga per 5 min a 190 x g e 20 gradi centigradi.
11. Risospendere le cellule a 7,5 x 10⁵ celle/mL in IMDM con 0,4% di albumin del siero umano.
12. Aggiungere 100 l della sospensione cellulare a un pozzo PDMS contenente un microarray di microparticelle di bioparticelle. Assicurarsi che la sospensione cellulare sia convessa sopra la parte superiore del PDMS e non contenga bolle.
13. Sigillare con una coverslip di 12 mm di diametro. Coprire l'apertura del pozzo PDMS con una coverslip di 12 mm di diametro. Premere delicatamente verso il basso sul coperchio con una pinzetta in modo che le sospensioni delle cellule in eccesso fuoriescano al bordo del pozzo. Utilizzare un tessuto per rimuovere la sospensione cellulare in eccesso.

3. Esecuzione dell'analisi e dell'analisi delle immagini

1. Caricare l'array di microparticelle con le cellule sulla stazione di imaging a cellule vive con un microscopio dotato di un'incubatrice a gabbia impostata a 37 , 5% CO₂e 90% di umidità relativa.
2. Usa la microscopia fluorescente e luminosa time-lapse per registrare immagini con ingrandimento 10x ogni 10 s a 405 nm, 594 nm e brightfield. In un esperimento tipico, le immagini vengono raccolte fino a 2 h.
3. Utilizzare un software di tracciamento cellulare automatizzato per tenere traccia della migrazione di singoli neutrofili verso il cluster di bioparticelle.
   1. Utilizzare la modalità di regressione automatica di un software di rilevamento delle celle di rilevamento spot. Impostare il raggio spot su 5 m (la dimensione approssimativa di un nucleo di neutrofili). Impostate la lunghezza minima della traccia su 120 s e una dimensione massima dello spazio di un fotogramma.
   2. Dai dati generati dal software di tracciamento delle celle, estrai i file che contengono la posizione e la velocità dei neutrofili. Questi file possono essere utilizzati con un software grafico per generare tracce di migrazione neutrofili (Figura 2C) e una mappa termica di velocità rispetto al tempo (Figura 2D), rispettivamente.
4. Utilizza le immagini fluorescenti da 405 nm per monitorare le dimensioni dello sciame nel tempo su un software di analisi delle immagini di tua scelta.
   1. Definire le regioni di interesse (ROI) intorno a ogni cluster di bioparticelle in cui i neutrofili sciameranno. Mantenere lo stesso ROI di dimensioni per analizzare ogni cluster di bioparticelle.
   2. Analizzare l'intensità media fluorescente delle immagini di 405 nm all'interno di ogni ROI nel tempo.
   3. Generare una curva di calibrazione di intensità media fluorescente alle dimensioni dello sciame prendendo misure manuali a varie dimensioni dello sciame da 0 m² alla dimensione massima dello sciame. Utilizzare questa calibrazione per calcolare la dimensione dello sciame nel tempo.

4. Raccolta supernatante e rilevamento di proteine

1. Incubare i neutrofili nei pozzi contenenti il microarray di bioparticelle a 37 e 5% di CO₂ per 3 h. Prelevare i campioni nei punti temporali desiderati. In genere, i campioni verranno prelevati a 0, 0,5, 1 e 3 h. Per superare il limite di rilevazione del saggio dell'array proteico, per ogni punto di tempo è stato utilizzato l'intero volume di un pozzo sovranabile (200 l). Ogni momento è stato analizzato in triplice copia.
2. Utilizzando un microscopio a campo luminoso, verificare che gli sciami si formino sul microarray.
3. Aspirare il supernatante con una pipetta da 200 l e caricare in un tubo di filtro centrifuga 0,45 m.
4. Centrifugare il supernatante a 190 x g e 20 gradi centigradi per 5 min e raccogliere il volume filtrato.
5. Conservare i campioni a -80 gradi fino al tempo di elaborazione.
6. Utilizzare un kit di microarray che rileva una gamma di proteine umane per elaborare i campioni.
   1. Aggiungere 200 l di ciascun campione in un tubo di dialisi separato fornito con il kit.
   2. Collocare i tubi di dialisi in un becher contenente almeno 500 mL di PBS (pH - 8,0). Mescolare delicatamente su un piatto di mescolare per almeno 3 h a 4 gradi centigradi. Modificare il PBS nel becher e ripetere questo passaggio.
   3. Trasferire ogni campione in un tubo di centrifuga pulito e centrifugare a 9.000 x g per 5 min per rimuovere eventuali precipitati. Trasferire ogni supernatante in un tubo pulito.
   4. Biotinylate ogni campione aggiungendo 36 lofonizzanti di 1x dal kit per 1 mg di proteine totali nel campione dializzato a 180 . Incubare a 20 gradi centigradi per 30 min. Mescolare delicatamente ogni 5 min.
   5. Aggiungere 3 - L di soluzione di arresto fornita con il kit in ogni tubo campione. Trasferire ogni campione in un nuovo tubo di dialisi e ripetere i passaggi da 4.6.2–4.6.3. In questa fase, il campione può essere conservato a -20 o -80 gradi centigradi fino a quando non si è pronti a procedere.
   6. Lo scivolo di vetro fornito con il kit è conservato a -20 gradi centigradi. Lasciare arrivare a temperatura ambiente. Posizionare lo scivolo di vetro assemblato in un cappuccio a flusso laminare per 1-2 h a temperatura ambiente.
   7. Aggiungere 400 l del buffer di bloccante fornito con il kit in ogni pozzetto dello scivolo di vetro assemblato. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
   8. Centrifugare i campioni preparati per 5 min a 9.000 x g per rimuovere precipitati o particolato. Diluire 5x con buffer di blocco.
   9. Rimuovere il buffer di blocco da ogni pozzo. Aggiungere 400 l dei campioni diluiti nei pozzi appropriati. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente mentre dondolo.
   10. Decantare i campioni da ogni pozzo. Lavare 3x con 800 l.l of the 1x lavare tampone ho fornito con il kit a temperatura ambiente per 5 min ciascuno mentre dondola.
   11. In un contenitore pulito, immergere lo scivolo di vetro assemblato in 1x tampone di lavaggio I. Lavare 2x a temperatura ambiente per 5 min ciascuno mentre dondola.
   12. Aggiungere 400 lofan di 1x streptavidina coniugata di 1x Cy3 ad ogni sotto-array. Coprire con strisce adesive in plastica. Proteggere dalla luce per il resto del protocollo.
   13. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente mentre dondolo.
   14. Decant la soluzione e smontare il vetrino dalle camere campione.
   15. Nel tubo di centrifuga di 30 mL fornito con il kit, aggiungere con attenzione lo scivolo di vetro e abbastanza 1x lavare tampone I per coprire lo scivolo di vetro. Lavare 3 volte per 10 min ciascuno a temperatura ambiente mentre dondolo.
   16. Nel tubo di centrifuga di 30 mL, lavare 2x con tampone di lavaggio 1x II per 5 min ciascuno a temperatura ambiente mentre dondola.
   17. Lavare lo scivolo di vetro con 30 mL di ddH₂O per 5 min. Rimuovere il vetrino di vetro dal tubo centrifuga e lasciare asciugare per 20 min in un cappuccio a flusso laminare. Lo scivolo di vetro preparato può essere conservato a -20 gradi centigradi fino a quando non è pronto per la scansione.
   18. Scansiona lo scivolo di vetro con uno scanner microarray a un'emissione di fluorescenza di 555 nm.

Risultati

Quando i neutrofili vengono aggiunti al microarray di microparticelle di bioparticelle, i neutrofili che contattano i cluster di bioparticelle si attivano e avviano la risposta sciami. Il microarray di bioparticelle è stato convalidato utilizzando la microscopia fluorescente time-lapse per monitorare la migrazione dei neutrofi verso i cluster di bioparticelle (Video S1). La migrazione dei singoli nuclei di neutrofili viene monitorata mentre migrano verso il cluster di bioparticelle. Quando i neutrofili r...

Discussione

Abbiamo sviluppato una piattaforma di microstampa per generare array uniformi di bioparticelle per stimolare il brulicare di neutrofoni in vitro. La natura in vitro della nostra piattaforma ci permette di aggirare le complicazioni che sorgono con esperimenti di sciame in vivo, vale a dire la scarsa capacità di analizzare i mediatori rilasciati dai neutrofili brulicanti⁵. Inoltre, i modelli in vivo vengono in genere eseguiti in roditori^11,12

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
"The Big Easy" EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18001	Magnete da utilizzare con il kit di isolamento dei neutrofili
Incubatore cellulare	Okolab	777057437 / 77057343	Incubatore a gabbia Okolab per il controllo della temperatura e della CO2
Kit di isolamento dei neutrofili umani EasySep	STEMCELL Technologies	17957	Kit per la selezione immunomagnetica
Eclipse Ti2	Nikon Instruments	MEA54010 / MEF55037	Microscopio da ricerca invertito
Escherichia coli (ceppo K-12) Bioparticelle Texas Red coniugato	Invitrogen	E2863	Bioparticelle in polvere, da sciogliere in acqua prima dell'aggiunta all'array Zetag®
Punzone per biopsia Harris Uni-Core da 8 mm	Sigma Aldrich	Z708925	Per tagliare timbri PDMS
HetaSep	STEMCELL Technologies	7906	Agente di aggregazione eritrocitaria per la separazione del buffy coat dai globuli rossi nel sangue umano fresco
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Colorazione fluorescente del nucleo
Human L1000 Array	Raybiotech Inc.	AAH-BLG-1000-4	Array ad alta densità per rilevare 1000 proteine umane
Albumina sierica umana (HSA)	Sigma Aldrich	A5843	Bassa endotossina HSA, per preparare soluzioni al 2% in IMDM per neutrofili isolati Terreno
Dulbeccos modificato di Iscove (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440053	Per risospendere i neutrofili isolati
Provette K2-EDTA	Thermo Fisher Scientific	02-657-32	Provette per la raccolta del sangue
Fotomaschera cromata a bassa riflessione	Fotomaschera frontale	N/A	Dimensioni 5" x 5" x 0,09" (L x P x P)
Scanner per microarray	Perkin Elmer	ASCNGX00	Lettore di fluorescenza di microdomini con pattern proteici Software per
l'analisi delle immagini per microscopia - Imaris	Bitplane	9.3.0	Software per l'analisi
automatica del tracciamento cellularePacchetto software di ricerca avanzata NiS Elements	Nikon Instruments	MQS31100	Software per l'imaging automatico di cellule vive e il calcolo delle dimensioni dello sciame
Isotiocianato di fluoresceina di poli-L-lisina (PLL-FITC)	Sigma Aldrich	P3069-10MG	30.000 - 70.000 MW PLL marcato con FITC, utilizzato per etichettare in fluorescenza la soluzione CP
SecureSeal Distanziatore di imaging a 8 pozzetti	Grace Bio-Labs	654008	Distanziatore di imaging adesivo a 8 pozzetti, diametro 9 mm
Wafer di silicio Wafer	universitario	590	Silicio 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μ m SSP test
Spin Coater	Laurell	WS-650MZ-23NPPB	Utilizzato per la filatura a 40-µ m strato di fotoresist su wafer di silicio
SU-8 2025	MicroChem	2025	Fotoresist negativo per rendere il wafer master in silicio
SU-8 Sviluppatore	MicroChem	Y020100	Photoresist. Rimuovere l'SU-8 2025 non reticolato dal wafer di silicio
Sylgard 184 (polidimetilsilossano, PDMS)	Dow	1673921	Kit di elastomeri siliconici in 2 parti per la realizzazione di microtimbri e pozzetti PDMS
Sistema di mascheramento dell'esposizione ai raggi UV	Kloé	UV-KUB 2	Utilizzato per reticolare il fotoresist su wafer di silicio attraverso una maschera cromata con luce UV
	Acqua Thermo Fisher Scientific	A1287303	Acqua di alta qualità per diluire le bioparticelle
Zetag 8185	BASF	8185	Polielettrolita cationico (CP), polvere, copolimero di acrilammide e monomero cationico quaternizzato, forma una "soluzione di inchiostrazione" per microstampigliatura quando disciolto in acqua
Zymosan A S. cerevisiae BioParticelle Texas Rosso coniugato	Invitrogen	Z2843	Bioparticelle in polvere, sciogliere in acqua prima dell'aggiunta all'array Zetag