Articolo metodologico

L'analisi dello spostamento della deformazione meccanica miocardiale (DIAMOND) rivela l'eterogeneità segmentale della funzione cardiaca nel pesce zebra embrionale

DOI:

10.3791/60547

⸱

6 febbraio 2020

 , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles, 2Ronald Reagan UCLA Medical Center, 3Veterans Affairs West Los Angeles Medical Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere in dettaglio un nuovo metodo per la valutazione della funzione cardiaca segmentale nel pesce zebra embrionale in condizioni fisiologiche e patologiche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I pesci zebra sono sempre più utilizzati come organismo modello per le cardiomiopatie e la rigenerazione. Gli attuali metodi di valutazione della funzione cardiaca non riescono a rilevare in modo affidabile la meccanica segmentale e non sono facilmente fattibili nel pesce zebra. Qui presentiamo un metodo semiautomatizzato e open source per la valutazione quantitativa della funzione cardiaca segmentale quadridimensionale (4D): analisi dello spostamento della deformazione meccanica miocardiale (DIAMOND). I pesci zebra embrionali transgenici sono stati immagini in vivo utilizzando un sistema di microscopia a fluorescenza a fogli luminosi con sincronizzazione del movimento cardiaco 4D. I cuori digitali 3D acquisiti sono stati ricostruiti a end-systole e end-diastole, e il ventricolo è stato segmentato manualmente in set di dati binari. Poi, il cuore fu riorientato e isotropicalemente rieseguito lungo il vero asse corto, e il ventricolo fu diviso uniformemente in otto porzioni (I-VIII) lungo l'asse corto. A causa dei diversi piani e matrici di ricampionamento in end-systole e end-diastole, è stata applicata una matrice di trasformazione per la registrazione dell'immagine per ripristinare la relazione spaziale originale tra le matrici di immagini sistoliche e diastolice ricampionate. Dopo la registrazione dell'immagine, il vettore di spostamento di ogni segmento da end-systole a end-diastole è stato calcolato in base allo spostamento dei centriidi di massa in tre dimensioni (3D). DIAMOND mostra che i segmenti miocardici basali adiacenti al canale atrioventricolare subiscono la più alta deformazione meccanica e sono i più suscettibili a lesioni cardiache indotte da doxorubicina. Nel complesso, DIAMOND fornisce nuove informazioni sulla meccanica cardiaca segmentale negli embrioni di pesce zebra oltre la tradizionale frazione di espulsione (EF) in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduzione

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Tossicità cardiaca indotta dalla chemioterapia e conseguente insufficienza cardiaca sono uno dei motivi principali per l'interruzione della chemioterapia1. Pertanto, la valutazione funzionale cardiaca svolge un ruolo cruciale nell'identificazione della tossicità cardiaca e, cosa ancora più importante, nella previsione di lesioni cardiache precoci dopo la chemioterapia2. Tuttavia, gli attuali approcci per la valutazione funzionale cardiaca incontrano limitazioni. Metodi come la frazione di espulsione sinistra ventricolare (LVEF) forniscono solo la meccanica cardiaca globale e spesso ritardata dopo la lesione3,4. L'imaging tissue Doppler fornisce informazioni segmentali sulla deformazione miocardiale, ma soffre di una significativa variabilità intraosservato e intereconomica, in parte a causa della dipendenza dell'angolo del fascio ultragrafico5. Il tracciamento delle macchie bidimensionali (2D) utilizza la modalità B dell'ecocardiografia, che teoricamente elimina la dipendenza dell'angolo, ma la sua precisione è limitata dal movimento fuori piano6. Pertanto, manca un approccio rigoroso per quantificare la funzione cardiaca segmentale sia nella ricerca che negli ambienti clinici.

In questo contesto, abbiamo sviluppato un metodo di quantificazione 4D per l'analisi della funzione cardiaca segmentale che abbiamo chiamato analisi di spostamento della deformazione meccanica miocardiale (DIAMOND), per determinare i vettori di spostamento dei centriidi di massa miocardiale nello spazio 3D. Abbiamo applicato DIAMOND per la valutazione in vivo della funzione cardiaca e della tossicità cardiaca indotta da doxorubicina con il pesce zebra (Danio rerio) come modello animale, scelto a causa del loro miocardio rigenerante e dei geni dello sviluppo altamente conservativi7. Abbiamo ulteriormente confrontato lo spostamento segmentale di DIAMOND con la determinazione della frazione di espulsione globale (EF) e la deformazione 2D a seguito del trattamento doxorubicina. Integrando lo spostamento DIAMOND con la microscopia fluorescente a fogli di luce 4D (LSFM) acquisita dei cuori embrionali di pesce zebra, DIAMOND mostra che i segmenti miocardiali basali adiacenti al canale atrioventricolare subiscono la più alta deformazione meccanica e sono i più suscettibili a lesioni cardiache doxorubicina acute8.

   

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Protocollo

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Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'UCLA Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e sono stati effettuati esperimenti nel rispetto dei protocolli approvati dall'Ufficio UCLA per la ricerca animale.

1. Allevamento Tg(cmlc2:mCherry) pesce zebra e raccolta di embrioni

  1. Seguire le procedure di alloggio, allevamento e raccolta degli embrioni come descritto nelle pratiche di allevamento e allevamento precedentemente stabilite. Per i dettagli, vedere Messerschmidt etal.
  2. Trattare gli embrioni raccolti con 0,003% 1-fenil-2-thiourea (PTU) in E3 medio 18 h dopo la fecondazione per mantenere la trasparenza degli embrioni per l'imaging LSFM.

2. Trattamento Doxorubicina per indurre lesioni cardiache

  1. A 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), trattare gli embrioni con doxorubicina ad una concentrazione di 10 M nel mezzo di acqua di pesce E3. Dopo un trattamento da 24 h a 4 dpf, sostituire il mezzo doxorubicina con un mezzo E3 fresco.
    AVVISO: La doxorubicina è un farmaco chemioterapico. Sono necessari adeguati dispositivi di protezione personale (PPE) e i rifiuti devono essere smaltiti in contenitori di rifiuti bioperrischi.

3. modulazione del percorso di notch

  1. Trattare gli embrioni di pesce zebra con l'inibitore della via di Notch (2S)-N-[(3,5-difluorofenigliyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glicine 1,1-dimethylethyl ester (DAPT) ad una concentrazione di 10 m nell'acqua di pesce E3 a media acquatica da 3 a 6 dpf.
  2. Microiniettare gli effetti a valle di Notch Notch dominio intracellulare (NICD) e Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA a concentrazioni di 10 pg/nL e 5 pg/nL, rispettivamente, negli embrioni di pesce zebra a 1 cellula8,10.
    NOTA: La microiniezione viene eseguita al microscopio con il supporto di una pompa ad aria per controllare con precisione il volume iniettato. La microiniezione di mRNA nella cellula viene eseguita quando l'uovo fecondato si trova alla prima fase cellulare. Per informazioni dettagliate sulla preparazione e la sequenza degli mRNA, vedere Chen et al.8. Per informazioni dettagliate sulla microiniezione e la preparazione degli aghi per iniezione, vedere Rosen etal.

4. Sincronizzazione dell'imaging LSFM e post-imaging

  1. Per le tecniche di imaging LSFM e l'algoritmo di sincronizzazione post-imaging, vedere i dettagli nelle pubblicazioni precedenti9,11.
    NOTA: In breve, il nostro sistema utilizza un laser a onde continue come sorgente di illuminazione per l'immagine di tutte le linee di pesci zebra transgenici. Il modulo di rilevamento è composto da due telecamere scientifiche per semiconduttori di ossido di metallo (sCMOS) e da due set di filtri per l'imaging a doppio canale. Il modulo di rilevamento è perpendicolarmente installato sul piano di illuminazione. Ogni fotogramma LSFM viene acquisito entro un tempo di esposizione di 20 msec, mentre la potenza di risoluzione nella sezione trasversale è di 0,65 m e la dimensione del gradino tra i fotogrammi consecutivi è di 2 m. Un laser da 589 nm è stato utilizzato per eccitare i segnali fluorescenti mCherry.

5. Ricostruzione del cuore sistolico e diastolico 3D

  1. Aprire la cartella creata dall'algoritmo post-sincronizzazione, quindi aprire la cartella "Output". Selezionare il piano centrale del cuore e caricare l'intera cartella in ImageJ. Trovare la prima fase diastolica e sistolica e registrare il numero del fotogramma.
  2. Aprire la cartella "Output/Per stato" e trovare le cartelle con gli stessi numeri dei numeri di fotogramma appena registrati. Convertire le immagini nella cartella in file 3D TIFF (formato file immagine con tag) e denominarle "diastole.tif" e "systole.tif".

6. Segmentazione del ventricolo

  1. Aprire il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali). Fare clic su File . Aprire i datie caricare "diastole.tif" e "systole.tif". Immettere la dimensione voxel in base alle impostazioni di imaging.
    NOTA: Per il sistema LSFM utilizzato, la dimensione tipica del voxel è 0,65 m x 0,65 m x 2 m.
  2. Fate clic sul pannello "SEGMENTATION" e segmentate manualmente la parte venttricale del cuore. Lo strumento incorporato "Soglia" che può selezionare tutte le regioni al di sopra di una certa intensità può facilitare questo processo. Il ventricolo è la camera più spessa con una fluorescenza più forte.
    NOTA: Assicurarsi di rimuovere il canale atrioventricolare e il tratto di deflusso nel ventricolo segmentato, perché questo influisce sull'analisi dello spostamento.
  3. Al termine della segmentazione, fare clic sul pannello "Progetto". Fare clic con il pulsante destro del mouse sul "diastole . Labels.tif" e "systole. Labels.tif" tabulazioni nella console e fare clic su "Esporta dati come" per salvare i dati come file TIFF 3D.

7. Creazione di parallele rettangolari per la registrazione delle immagini

  1. Eseguire "prepImage_1.m" nell'ambiente di programmazione (vedere Tabella dei materiali). Aprire "prepImage_1.m", "ImPath" in modo che la cartella contenga i file TIFF originali e segmentati, e cambia "slice" in linea 4 al numero di fette dei file tif 3D.
  2. Dopo aver eseguito il codice, verranno generati cinque nuovi file TIFF 3D ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" e "sysLabel200.tif") e due nuove cartelle ("resample_dia" e "resample_sys").

8. Ricampionare i cuori 3D sistolici e diastolici lungo il piano dell'asse corto

  1. Importare tutti e cinque i file TIFF 3D nel software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: la dimensione del voxel è invariata.
  2. Vai al pannello MULTIPLANAR. Scegliere "diastole_200.tif" come dati primari. Allineare l'asse X (la linea verde nel piano XY) con l'asse lungo verticale del ventricolo e allineare l'asse z (la linea rossa nel piano Y) con l'asse lungo orizzontale del ventricolo.
    NOTA: L'asse lungo verticale viene determinato individuando l'asse più lungo che collega l'apice e il tratto di deflusso nel piano XY, e l'asse lungo orizzontale viene determinato individuando l'asse più lungo che collega l'apice e il tratto di deflusso nel piano Y. Ruotare l'asse posizionando il cursore all'estremità dell'asse.
  3. Scegliete in senso antiorario tre punti casuali dal piano Obliquo Yà (il piano dell'asse corto) in senso antiorario e registrate le relative coordinate di posizione 3D.
    NOTA: Assicurarsi che i punti siano scelti in senso antiorario.
  4. Ripetere i passaggi 8.2 e 8.3 per "systole_200.tif".
  5. Fare clic sul pannello "PROGETTO". Creare un oggetto "Slice" per "diastole_200.tif" facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto "diastole_200.tif" e cercando"Slice". Fate clic con il pulsante sinistro del mouse sull'oggetto Slice appena creato e nel pannello Proprietà ( Properties) Opzioni,selezionare" Imposta piano " e scegliere tre punti in "Definizione piano". Immettere le coordinate dei tre punti del punto 7.3.
  6. Ripetere il passaggio 8.5 per "systole_200.tif".
    NOTA: l'oggetto slice creato deve avere il nome "Slice 2".
  7. Fare clic con il pulsante destro del mouse su "diastole_200.tif" e cercare "Ricampiona immagine trasformata" e creare l'oggetto. Nel pannello Proprietà, scegliete "Sezione" come"Riferimento"e fate clic su Applica. Questo dovrebbe generare un oggetto denominato "diastole_200.transformed".
  8. Fare clic con il pulsante destro del mouse su "diastole_200.transformed" e cercare "Ricampiona" e creare l'oggetto. Scegliete "Voxel Size" come "Mode" e modificate "Voxel Size" in modo che sia x , 1, y , 1 e z 1 nel pannello Proprietà.
  9. Fare clic su "Applica". Questo dovrebbe generare un oggetto denominato "diastole_200.resampled". Fare clic con il pulsante destro del mouse su "diastole_200.resampled" e salvarlo come file TIFF 3D.
  10. Ripetere lo stesso passaggio per "diaLabel.tif" e "test.tif". Salvare "diaLabel.resampled" e "test.resampled" come file TIFF 3D. Ripetere lo stesso passaggio per "systole_200.tif", "sysLabel.tif" e "test.tif" utilizzando "Slice 2" come riferimento e salvare "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" e "test2.resampled" come file TIFF 3D.
    NOTA: Assicurarsi che in questo passaggio siano presenti in totale sei file TIFF salvati.

9. Divisione del cuore rieseguito

  1. Importare tutti e sei i file ricampionati dal passaggio 8 a ImageJ. Selezionare una fetta di "systole_200.resampled" in cui il canale atrioventricolare è chiaramente visualizzato. Registrare il numero della sezione.
    1. Utilizzare l'opzione "Immagine Proprietà Transform . Ruota" funzione di ImageJ in modo che il canale atrioventricolare sia verticale. Applicare la stessa rotazione a tutti i file. Chiudere tutte le finestre e salvare tutte le modifiche.
    2. Spostare "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" e "test.resampled" nella cartella "resample_dia" e spostare "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" e "test2.resampled" nella cartella "resample_sys".
  2. Aprire "divider_2_8_pieces.m". Modificare "ImPath" in linea 5 e "ImPath" nella riga 395 nella directory dell'immagine. Modificare la variabile "Middle" nella linea 22 e la linea 411 in base ai numeri di taglio in cui il canale atrioventricolare è chiaramente visualizzato in "systole_200.resampled" e "diastole_200.resampled".
  3. Eseguire il codice, e nelle finestre richieste fare clic una volta al centro del ventricolo e fare clic una volta al centro del canale atrioventricolare. Questa operazione deve essere eseguita due volte sia per le immagini sistole che per le immagini diastole.

10. Registrazione delle matrici di immagini sistolice e diastolice

  1. Aprire "register_3.m" e modificare "ImPath" nella riga 4 per il percorso della cartella dell'immagine. L'esecuzione di questo codice potrebbe richiedere 5-20 min a seconda della potenza di calcolo del sistema.
    NOTA: Le parallelepipe parallele create artificialmente nel passaggio 7 vengono utilizzate per la registrazione rigida 3D che mantiene la distanza tra due punti e angoli sottoscritti da tre punti. Quando la parallelepiped rettangolare end-diastole (rosso) viene registrata nel parallelepiped rettangolare end-systole (verde), la conseguente discrepanza di screpolature 3D consente la derivazione di una matrice univoca di trasformazione rigida costituita dalla rotazione e dalla traslazione dalla matrice end-sastole alla matrice end-systole (Figura 1H). Eseguiamo la registrazione e regolarizzato minimizzazione dell'energia per disturbare la matrice dopo la trasformazione utilizzando una cassetta degli attrezzi di elaborazione delle immagini (vedere Tabella dei materiali). Per una descrizione matematica dettagliata, vedere Chen etal.

11. Uscita dei vettori di spostamento

  1. Aprire "displacement_4.m" e modificare "ImPath" in linea 4 per il percorso della cartella dell'immagine.
  2. Eseguire "displacement_4.m", che genera un file "vector8.txt" nella cartella "vectors". Una volta aperto il file "vector8.txt", ci sarà una matrice 8 x 4. Ogni riga della matrice ha quattro numeri, che sono le magnitudini del componente X, il componente Y, il componente s e la grandezza SUM del vettore di spostamento di un segmento specifico del ventricolo.
    NOTA: Il vettore di spostamento viene ottenuto calcolando lo spostamento del centroide di massa di ciascun segmento nello spazio 3D. Calcoliamo figure-protocol-1 le coordinate centroide di massa 3D (PS e PD)(dove k indica rispettivamente la coordinata X, Y, o z) di ogni segmento (I-VI) nel set di dati di segmentazione dalla sistole alla diastole ( Figura1J). Definiamo la figure-protocol-2 centroide di massa nello spazio 3D come segue:
    figure-protocol-3
    where Cx = X, Cy = Y, and Cz = Z, Mi = the mass of each segment (I ≤ i ≤ VI), m = the number of voxels of each segment, and ρ = the density function as the segmented region is 1 whereas the rest is 0. La norma L2 dei vettori di sotto-spostamento lungo gli assi X, Y e z e il vettore di spostamento della somma vengono calcolati durante il ciclo cardiaco. Nella matrice sono presenti un totale di otto righe. La prima fila e l'ottava fila contengono il canale atrioventricolare e vengono quindi ignorate nella nostra analisi. I segmenti da I a VI sono rappresentati dalla seconda riga alla settima riga.

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Risultati

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Il processo mediante il quale DIAMOND è stato sviluppato per valutare la funzione cardiaca segmentale 3D è presentato nella Figura 1. In seguito all'acquisizione e alla ricostruzione dell'immagine LSFM in 3D del cuore di pesce zebra embrionale (Figura 1A), il vero piano dell'asse corto è stato determinato come piano perpendicolare agli assi lunghi verticali e orizzontali, entrambi determinati in un visualizzatore multiplano (

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Discussione

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Una strategia rigorosa per la quantificazione della funzione miocardiale segmentale è fondamentale per valutare la meccanica cardiaca al di là della tradizionale EF, nota per essere un indicatore insensibile e ritardato della lesione miocardiale1,4,12. Quindi, c'è stato un crescente interesse per i marcatori dei primi cambiamenti miocardici, e un corpo crescente di letteratura supporta i parametri di deformazione miopidea come i...

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Dichiarazioni

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Gli autori hanno dichiarato che non esiste alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Il presente lavoro è stato finanziato dall'American Heart Association concede 16SDG30910007 e 18CDA34110338, e dalle sovvenzioni HL083015, HL111437, HL118650 e HL129727.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Amira6FEISoftware di analisi delle immagini
DAPTMillipore SigmaD5942-5MG
Doxorubicina cloridratoMillipore SigmaD1515-10MG
Etile 3-amminobenzoato metanosolfonatoMillipore SigmaE10521-10GTricaina
MATLABMathWorksAmbiente di programmazione
Toolbox per l'elaborazione delle immagini MATLAB Toolboxper l'elaborazione delle immagini di MathWorks

Riferimenti

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