Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule epiteliali da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana per determinarne l'eterogeneità e le proprietà funzionali per una possibile applicazione nei modelli clinici e fisiopatologici.
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Articolo metodologico
Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diversi protocolli sono stati riportati nella letteratura per l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali amniotiche umane (HAEC). Tuttavia, questi presuppongono che l'epitelio amniotico sia uno strato omogeneo. L'amnione umano può essere diviso in tre regioni anatomiche: riflesse, placentare e ombelicali. Ogni regione ha diversi ruoli fisiologici, come in condizioni patologiche. Qui, descriviamo un protocollo per sezionare il tessuto amnione umano in tre sezioni e mantenerlo in vitro. Nella coltura, le cellule derivate dall'amnione riflesso mostravano una morfologia cuboidale, mentre le cellule delle regioni placentarie e ombelicali erano squamose. Ciò nonostante, tutte le cellule ottenute hanno un fenotipo epiteliale, dimostrato dall'immunorilevamento dell'E-cadherin. Pertanto, poiché le regioni placentari e riflesse in situ differiscono nei componenti cellulari e nelle funzioni molecolari, potrebbe essere necessario che gli studi in vitro considerino queste differenze, poiché potrebbero avere implicazioni fisiologiche per l'uso dell'HAEC biomedica e la promettente applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa.
Introduzione
Le cellule dell'epitelio amniotico umano (HAEC) hanno origine durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, a circa otto giorni dopo la fecondazione. Nascono da una popolazione di cellule epiteliali squamose dell'epiblasto che derivano dallo strato più interno della membrana amniotica1. Così, HAEC sono considerati resti di cellule pluripotenti dall'epiblast che hanno il potenziale di differenziarsi nei tre strati germinali dell'embrione2. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per isolare queste cellule dalla membrana amniotica al termine di gestazione per caratterizzare le loro presunte proprietà legate alla pluripotenza in un modello culturale in vitro3,4.
Di conseguenza, è stato scoperto che HAEC presentano tratti caratteristici delle cellule staminali pluripotenti umane (HPSC), come gli antigeni superficiali SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; il nucleo dei fattori di trascrizione pluripotenza OCT4, SOX2 e NANOG; e il marcatore di proliferazione KI67, suggerendo che si stanno rinnovando5,6,7. Inoltre, queste cellule sono state sfidate utilizzando protocolli di differenziazione per ottenere cellule positive per marcatori specifici del lignaggio dei tre strati germinali (ectodermi, mesoderm ed endoderm)4,5,8, così come nei modelli animali di malattie umane. Infine, HAEC esprimono l'E-cadherin, che dimostrano che mantengono una natura epiteliale molto simile all'HPSC5,9.
Oltre alla loro origine embrionale, gli HAEC hanno altre proprietà intrinseche che le rendono adatte a diverse applicazioni cliniche, come la secrezione di molecole antinfiammatorie e antibatteriche10,11, fattori di crescita e citochina rilasciano12, nessuna formazione di teratomi quando vengono trapiantati in topi immunodeficienti in contrasto con HPSC2, e tolleranza logica perché esprimono HLA-G, che diminuisce il rischio di trapianto13.
Tuttavia, i rapporti precedenti hanno ipotizzato che l'amnione umano sia una membrana omogenea, senza considerare che possa essere suddivisa anatomicamente e fisiologicamente in tre regioni: placentale (l'amnione che copre la decidua basalis),ombelicale (la parte che avvolge il cordone ombelicale), e riflessa (il resto della membrana non attaccata alla placenta)14. È stato dimostrato che le regioni placentarie e riflesse dell'amnion mostrano differenze nella morfologia, nell'attività mitocondriale, nel rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno15, sull'espressione miRNA16e nell'attivazione delle vie di segnalazione17. Questi risultati suggeriscono che l'amnione umano è integrato da una popolazione eterogenea con funzionalità diverse che dovrebbero essere prese in considerazione per ulteriori studi condotti in modelli in situ o in vitro. Mentre altri laboratori hanno progettato protocolli per l'isolamento di HAEC da tutta la membrana, il nostro laboratorio ha stabilito un protocollo per isolare, coltura e caratterizzare le cellule provenienti da diverse regioni anatomiche.
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico dell'Instituto Nacional de Perinatologa a Città del Messico (numero di registro 212250-21041). Tutte le procedure eseguite in questi studi erano conformi agli standard etici dell'Instituto Nacional de Perinatolog, della Dichiarazione di Helsinki e delle linee guida stabilite nello standard messicano ufficiale del Ministero della Salute.
1. Preparazione
- Preparare una soluzione di 1x PBS con EDTA. A tale scopo, aggiungere 500 : L di 0,5 M di scorte EDTA in 500 mL di 1x PBS per una concentrazione finale di 0,5 mM EDTA.
- Preparare il supporto di coltura per HAEC. Prendere 450 mL di alto glucosio-DMEM, integrarlo con 5 mL di piravadi di sodio (100 mM), 50 mL di siero bovino fetale termale-inattivo qualificato per le cellule staminali, 5 mL di aminoacidi non essenziali (100x), 5 mL di antibiotico-antimicotico (100x), 5 mL di glutamine (200 m), 500 l di mercaptoetanolo (1.000x).
- Sterilizzare i contenitori per il trasporto e la lavorazione del tessuto: un contenitore in acciaio inossidabile con un coperchio per trasportare l'intera placenta dalla sala operatoria al laboratorio, un vassoio (20 cm x 30 cm x 8 cm) per lavare e rimuovere il sangue dall'intera placenta prima la dissezione della membrana amniotica, e un tagliere di plastica per separare la membrana amniotica nelle tre regioni.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici (scalpel, forbici, pinze e morsetti), becher da 500 mL, garze di cotone e soluzione salina.
2. Ottenere tessuto placentare
NOTA: Le membrane amniotiche sono state ottenute dalle donne a gestazione a termine (37-40 settimane), sotto indicazione della consegna cesarea, senza alcuna prova di lavoro attivo, e senza caratteristiche microbiologiche di infezione. Le procedure complete di isolamento e cultura sono state eseguite all'interno di un gabinetto di biosicurezza in condizioni sterili.
- In sala operatoria, bloccare il cordone ombelicale per evitare il flusso sanguigno al resto del tessuto. Raccogliere l'intera placenta con il cordone ombelicale fissato nel contenitore sterile.
- Aggiungere 500 mL di soluzione salina al contenitore per idratare la placenta.
- Chiudere il contenitore e trasportare il tessuto al laboratorio a temperatura ambiente.
- Mettere il contenitore con la placenta all'interno dell'armadietto della biosicurezza.
NOTA: Nel caso in cui la dissezione non venga effettuata entro 15 min dalla raccolta della placenta, conservare il contenitore con la placenta sul ghiaccio fino alla lavorazione. Evitare più di 1 h di tempo trascorso tra l'ottenimento della placenta e l'inizio della dissezione.
3. Separazione meccanica per regione della membrana amniotica
NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili e a temperatura ambiente.
- Rimuovere l'intera placenta dal contenitore e posizionarla sul vassoio con il cordone ombelicale rivolto verso l'alto.
- Utilizzando una garza sterile di cotone, pulire i coaguli di sangue dalla superficie del chorion-amnion che copre la placenta.
- Identificare le tre regioni della membrana: l'amnione ombelicale che avvolge il cordone ombelicale, l'amnione placentare che copre la decidua basalis e la regione riflessa, che è il resto dell'amnione che non è attaccato alla placenta (Figura 1).
- Dissezio della regione dell'amnione ombelicale (Figura 2A).
- Utilizzando pinze dissetanti, tenere la porzione di membrana di amnione che copre la giunzione della placenta e del cordone ombelicale.
- Con un bisturi, sezionare la regione che circonda il cavo mentre si estende per separarlo dal chorion.
- Depositare il tessuto separato in un becher etichettato con 100 mL di soluzione salina.
- Dissezionare la regione dell'amnione placentare (Figura 2B).
- Con una garza di cotone sterile, rimuovere i coaguli di sangue dalla superficie del chorion-amnion che copre la placenta.
- Tenere la membrana sul confine tra la placenta e la regione riflessa con pinze di dissezione.
- Tagliare lungo la circonferenza della placenta con il bisturi.
- Separare l'amnione placenta dal chorion, facendo attenzione a non tagliare i vasi dalla placenta.
- Posizionare il tessuto separato in un altro becher etichettato con 300 mL di soluzione salina.
- Separare il resto della membrana amniotica che non è attaccata alla placenta (cioè la parte riflessa) dal coro (Figura 2C).
- Raccogliere la regione riflessa in un altro becher etichettato con 300 mL di soluzione salina.
NOTA: Aggiungere continuamente una soluzione salina durante la dissezione per evitare che il tessuto si secchi.
- Raccogliere la regione riflessa in un altro becher etichettato con 300 mL di soluzione salina.
4. Lavare le membrane
NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili a temperatura ambiente.
- Scartare separatamente la soluzione salina di ogni regione della membrana.
- Aggiungere 100 mL di soluzione salina fresca alla regione ombelicale.
- Aggiungere 300 mL di soluzione salina fresca rispettivamente alle regioni placentari e riflesse.
- Mescolare le membrane con l'aiuto di piscio di dissezione per rimuovere i residui di sangue.
- Eliminare la soluzione salina.
- Ripetere i lavamenti e l'agitazione almeno 3x fino a quando le membrane sono traslucide.
- Posizionare ed estendere le membrane sulla scheda per pulire con garza sterile i coaguli di sangue che non sono stati rimossi con i lavatori.
NOTA: È molto importante rimuovere il maggior numero possibile di eritrociti, poiché la loro presenza influisce sulla funzione della trypsin e sulla fattibilità delle successive colture cellulari.
5. Digestione enzimatica delle membrane provenienti da diverse regioni
NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.
- Tagliare le regioni riflesse e placentari in due o tre frammenti.
- Non tagliare la regione ombelicale.
- Posizionare i frammenti di ogni regione in tubi di centrifuga. Aggiungere 20 mL dello 0,5% di trypsin/EDTA alle regioni riflesse e placentari e di 5 mL dello 0,5% trypsin/EDTA rispettivamente all'area ombelicale.
NOTA: È importante tagliare le regioni riflesse e placentari in pezzi più piccoli perché devono essere completamente immerse nella soluzione trypsin. - Agitare leggermente i tubi di centrifuga per 30 s. Scartare la metapsina.
- Aggiungere 30 mL di nuovo 0,5% trypsin/EDTA alle regioni riflesse e placentari e 15 mL di nuovo 0,5% trypsin/EDTA rispettivamente nella regione ombelicale.
- Posizionare i tubi in un rotatore all'interno dell'incubatrice.
- Incubare con rotazione (20 giri/) per 40 min a 37 gradi centigradi.
NOTA: Se non è disponibile un rotatore di tubi, agitare leggermente i tubi manualmente ogni 10 min. - Trasferire le soluzioni trypsin/cell da ogni regione in nuovi tubi di centrifuga.
- Aggiungere 2 volte il volume dei supporti HAEC preriscaldati a 37 gradi centigradi per tubo per inattivare l'enzima.
- Conservare la prima digestione sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi di 5,6 x 5,8 per un secondo periodo di digestione.
- Per ogni regione, tenere un'estremità della porzione di amnione utilizzando pinze dissetanti, e con un'altra coppia stringere lungo il tessuto per rimuovere file di cellule epiteliali che non si staccavano completamente durante i precedenti periodi di incubazione.
- Raccogliere la seconda digestione in un altro set di tubi di centrifuga e inattivare con 2 volte il volume dei supporti HAEC.
- Scartare le membrane digerite in un contenitore di rischio biologico.
6. Isolamento dell'HAEC
NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.
- Centrifugare tutti i tubi a 200 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Scartare il supernatante e aggiungere 10 mL di supporti HAEC preriscaldati (a 37 gradi centigradi) per tubo e pipet delicatamente per disaggregare ogni pellet.
- Combinare le sospensioni cellulari delle due digestione in un singolo tubo per ogni regione della membrana.
- Filtrare le sospensioni cellulari utilizzando più di 100 ceppi cellulari m per rimuovere i detriti della matrice extracellulare e ottenere singole cellule.
- Preparare tre aliquote con 90 litri di trippan blu in un tubo di microcentrifuga.
- Aggiungere 10 litri di ciascuna sospensione cellulare per regione di membrana nei tubi di microcentrismo e mescolare.
- Contare le cellule con un emocitometro al microscopio del campo luminoso.
7. Cultura dell'HAEC
- Semina l'HAEC delle tre regioni separatamente ad una densità di 3 x 104 cellule/cm2 con supporti HAEC preriscaldati, integrati con 10 ng/mL del fattore di crescita epidermico umano (EGF).
- Semina le cellule in piastre da 100 mm per mantenerle in vitro o in 24 pozze per l'analisi immunochimica.
- Incubare i piatti a 37 gradi centigradi in condizioni di norma (5% CO2)in un'incubatrice umidificata.
- Aggiungere EGF ogni giorno e cambiare il supporto ogni terzo giorno.
NOTA: Le cellule diventeranno confluenti dopo 4/6 giorni. - Utilizzare le cellule per l'immunohistochimica convenzionale, l'analisi di smistamento cellulare, criopreservazione, estrazione di RNA e proteine, o per continuare il passaggio.
8. Passaggio di HAEC
- Rimuovere il supporto HAEC e lavare 2x con soluzione PBS/EDTA 0.01M.
- Incubare con una soluzione PBS/EDTA 0,01M per 15 min a 37 gradi centigradi.
- Rimuovere il PBS/EDTA e aggiungere 1,5 mL di 0,5% trypsin/EDTA.
- Incubare per 5/8 min a 37 gradi centigradi.
- Inattivare l'enzima con due volumi di supporti HAEC.
- Raccogliere la soluzione mista e centrifugare per 5 min a 200 x g.
- Contare le celle e continuare con i passaggi successivi o utilizzare le cellule per ulteriori analisi.
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Risultati
Gli HAEC sono stati isolati da ciascuna delle tre regioni anatomiche della membrana amniotica e coltivati individualmente in vitro. Dopo 48 h di coltura, le cellule con un fenotipo epiteliale aderito alla superficie della piastra, anche se i media contenevano anche detriti cellulari e cellule galleggianti, che sono stati rimossi una volta che il mezzo è stato cambiato (Figura 3).
Durante l'elaborazione della cultura primaria (passaggio zero, P0), potrebbero sorger...
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Discussione
Abbiamo implementato un nuovo protocollo per isolare l'HAEC dalle membrane di termine. Si differenzia dai rapporti precedenti in quanto ogni membrana è stata divisa nelle sue tre regioni anatomiche prima dell'isolamento per analizzare le cellule da ciascuna di esse.
Uno dei passaggi più critici nel protocollo è il lavaggio della membrana per rimuovere tutti i coaguli di sangue, perché possono interferire con l'attività della trypsin quando si separano le cellule epiteliali. La mancata esecuzio...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La nostra ricerca è stata sostenuta dalle sovvenzioni dell'Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 e 21081) e del CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Ringraziamo Jessica Gonzàlez Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas per il supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti per coltura | |||
| 2-Mercaptoetanolo | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| EGF umano ricombinante senza animali | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotico-antimicotico | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Integrato con EDTA ad alto contenuto di glucosio e HEPES |
| Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0,5 M | |
| Cellule staminali embrionali FBS, qualificato | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Aminoacidi non essenziali | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldeide | qualsiasi marca | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Soluzione salina (cloruro di sodio 0,9%) | qualsiasi marca | ||
| Piruvato di sodio | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Tripsina/EDTA 0,05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Materiale monouso | |||
| 100 µ m Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| Piatto di coltura trattato TC da 100 mm | Corning | 430167 | |
| Piastre a pozzetti multipli trasparenti trattate con TC a 24 pozzetti | Corning/Costar | 3526 | |
| Piastre a pozzetti multipli trasparenti con trattamento TC a 6 pozzetti | Corning/Costar | 3516 | |
| Tubo da centrifuga sterile non pirogeno | di qualsiasi marca | con conico fondo | |
| Punte sterili apirogene da 1.000 &; micro; l, 200 & micro; l e 10 µl. | |||
| Garze | |||
| Pipette sierologiche sterili da 5, 10 e 25 mL di | qualsiasi marca | ||
| Guanti chirurgici sterili | di qualsiasi marca | ||
| Equipment | |||
| Cabina | |||
| Centrifuga | |||
| Micropipette | |||
| Riempitrice/dispensatrice | |||
| Becher sterili da 500 mL | |||
| Tagliere | |||
| Bisturi, forbici, pinze, pinze sterili Contenitore | |||
| sterile in acciaio inox | |||
| Vassoio | |||
| Rotatore di provette | MaCSmix | ||
| Anticorpi e kit | Antibody ID | ||
| Anti-E-caderina | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Segnalazione cellulare | anti-SSEA-4 | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Segnalazione cellulare | anti-TRA-1-60 | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Capra Anti-Topo Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Capra Anti-Coniglio Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Kit di test Tunel | Abcam | 66110 |
Riferimenti
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