Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule epiteliali da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana per determinarne l'eterogeneità e le proprietà funzionali per una possibile applicazione nei modelli clinici e fisiopatologici.
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Articolo metodologico
Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diversi protocolli sono stati riportati nella letteratura per l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali amniotiche umane (HAEC). Tuttavia, questi presuppongono che l'epitelio amniotico sia uno strato omogeneo. L'amnione umano può essere diviso in tre regioni anatomiche: riflesse, placentare e ombelicali. Ogni regione ha diversi ruoli fisiologici, come in condizioni patologiche. Qui, descriviamo un protocollo per sezionare il tessuto amnione umano in tre sezioni e mantenerlo in vitro. Nella coltura, le cellule derivate dall'amnione riflesso mostravano una morfologia cuboidale, mentre le cellule delle regioni placentarie e ombelicali erano squamose. Ciò nonostante, tutte le cellule ottenute hanno un fenotipo epiteliale, dimostrato dall'immunorilevamento dell'E-cadherin. Pertanto, poiché le regioni placentari e riflesse in situ differiscono nei componenti cellulari e nelle funzioni molecolari, potrebbe essere necessario che gli studi in vitro considerino queste differenze, poiché potrebbero avere implicazioni fisiologiche per l'uso dell'HAEC biomedica e la promettente applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa.
Introduzione
Le cellule dell'epitelio amniotico umano (HAEC) hanno origine durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, a circa otto giorni dopo la fecondazione. Nascono da una popolazione di cellule epiteliali squamose dell'epiblasto che derivano dallo strato più interno della membrana amniotica1. Così, HAEC sono considerati resti di cellule pluripotenti dall'epiblast che hanno il potenziale di differenziarsi nei tre strati germinali dell'embrione2. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per isolare queste cellule dalla membrana amniotica al termine di gestazione per caratterizzare le loro presun....
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico dell'Instituto Nacional de Perinatologa a Città del Messico (numero di registro 212250-21041). Tutte le procedure eseguite in questi studi erano conformi agli standard etici dell'Instituto Nacional de Perinatolog, della Dichiarazione di Helsinki e delle linee guida stabilite nello standard messicano ufficiale del Ministero della Salute.
1. Preparazione
- Preparare una soluzione di 1x PBS con EDTA. A tale scopo, aggiungere 500 : L di 0,5 M di scorte EDTA in 500 mL di 1x PBS per una concentrazione finale di 0,5 mM EDTA.
- Preparare il supporto di coltura per HAEC. Prendere....
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Risultati
Gli HAEC sono stati isolati da ciascuna delle tre regioni anatomiche della membrana amniotica e coltivati individualmente in vitro. Dopo 48 h di coltura, le cellule con un fenotipo epiteliale aderito alla superficie della piastra, anche se i media contenevano anche detriti cellulari e cellule galleggianti, che sono stati rimossi una volta che il mezzo è stato cambiato (Figura 3).
Durante l'elaborazione della cultura primaria (passaggio zero, P0), potrebbero sorger.......
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Discussione
Abbiamo implementato un nuovo protocollo per isolare l'HAEC dalle membrane di termine. Si differenzia dai rapporti precedenti in quanto ogni membrana è stata divisa nelle sue tre regioni anatomiche prima dell'isolamento per analizzare le cellule da ciascuna di esse.
Uno dei passaggi più critici nel protocollo è il lavaggio della membrana per rimuovere tutti i coaguli di sangue, perché possono interferire con l'attività della trypsin quando si separano le cellule epiteliali. La mancata esecuzio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La nostra ricerca è stata sostenuta dalle sovvenzioni dell'Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 e 21081) e del CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Ringraziamo Jessica Gonzàlez Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas per il supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti per coltura | |||
| 2-Mercaptoetanolo | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| EGF umano ricombinante senza animali | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotico-antimicotico | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Integrato con EDTA ad alto contenuto di glucosio e HEPES |
| Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0,5 M | |
| Cellule staminali embrionali FBS, qualificato | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Aminoacidi non essenziali | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldeide | qualsiasi marca | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Soluzione salina (cloruro di sodio 0,9%) | qualsiasi marca | ||
| Piruvato di sodio | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Tripsina/EDTA 0,05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Materiale monouso | |||
| 100 µ m Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| Piatto di coltura trattato TC da 100 mm | Corning | 430167 | |
| Piastre a pozzetti multipli trasparenti trattate con TC a 24 pozzetti | Corning/Costar | 3526 | |
| Piastre a pozzetti multipli trasparenti con trattamento TC a 6 pozzetti | Corning/Costar | 3516 | |
| Tubo da centrifuga sterile non pirogeno | di qualsiasi marca | con conico fondo | |
| Punte sterili apirogene da 1.000 &; micro; l, 200 & micro; l e 10 µl. | |||
| Garze | |||
| Pipette sierologiche sterili da 5, 10 e 25 mL di | qualsiasi marca | ||
| Guanti chirurgici sterili | di qualsiasi marca | ||
| Equipment | |||
| Cabina | |||
| Centrifuga | |||
| Micropipette | |||
| Riempitrice/dispensatrice | |||
| Becher sterili da 500 mL | |||
| Tagliere | |||
| Bisturi, forbici, pinze, pinze sterili Contenitore | |||
| sterile in acciaio inox | |||
| Vassoio | |||
| Rotatore di provette | MaCSmix | ||
| Anticorpi e kit | Antibody ID | ||
| Anti-E-caderina | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Segnalazione cellulare | anti-SSEA-4 | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Segnalazione cellulare | anti-TRA-1-60 | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Capra Anti-Topo Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Capra Anti-Coniglio Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Kit di test Tunel | Abcam | 66110 |
Riferimenti
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem c....
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Cellule epiteliali amniotiche umaneDissezione della membrana amnioticaProtocollo di digestione enzimaticaTecnica di isolamento cellulareCentrifugazione e filtrazioneAnalisi del fenotipo epitelialeImmunorilevazione della E-caderinaMarcatore di proliferazione Ki-67Regioni placentari ombelicali riflesseColtura cellulare in vitro
