Questo protocollo fornisce un metodo facile da gestire per la coltura delle cellule intestinali dal cetriolo di mare Apostichopus japonicus japonicus ed è compatibile con una varietà di campioni di tessuto ampiamente disponibili da organismi marini tra cui Echinodermata, Mollusca e Crustacea.
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Articolo metodologico
Induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule coltivate primarie sono utilizzate in una varietà di discipline scientifiche come strumenti eccezionalmente importanti per la valutazione funzionale di sostanze biologiche o la caratterizzazione di specifiche attività biologiche. Tuttavia, a causa della mancanza di mezzi e protocolli di coltura cellulare universalmente applicabili, i metodi di coltura cellulare ben descritti per gli organismi marini sono ancora limitati. Nel frattempo, la contaminazione microbica e le proprietà politropiche comunemente presenti delle cellule invertebrate marine ostacolano ulteriormente l'istituzione di una strategia di coltura cellulare efficace per gli invertebrati marini. Qui, descriviamo un metodo facile da gestire per la coltura di cellule intestinali dal cetriolo di mare Apostichopus japonicus; inoltre, forniamo un esempio di induzione e rilevamento di apoptosi in vitro nelle cellule intestinali coltivate primarie. Inoltre, questo esperimento fornisce dettagli sul metodo di raccolta delle cellule e del mezzo di coltura appropriato. Il protocollo descritto è compatibile con una varietà di campioni di tessuto ampiamente disponibili da organismi marini, tra cui Echinodermata, Mollusca e Crustacea, e può fornire cellule sufficienti per molteplici applicazioni sperimentali in vitro. Questa tecnica consentirebbe ai ricercatori di manipolare in modo efficiente le colture cellulari primarie dagli invertebrati marini e di facilitare la valutazione funzionale di materiali biologici mirati sulle cellule.
Introduzione
Le cellule di coltura in condizioni controllate artificialmente, e non nel loro ambiente naturale, forniscono materiali sperimentali uniformi per studi biologici, in particolare per specie che non possono essere facilmente coltivate in un ambiente di laboratorio. Gli invertebrati marini rappresentano oltre il 30% di tutte le specie animali1e forniscono numerosi materiali biologici per intraprendere ricerche sui meccanismi normativi di processi biologici specifici, come la rigenerazione2,3, la risposta allo stress4e l'adattamento ambientale5
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Protocollo
1. Preparazione media coltura cellulare
-
Preparazione dei fluidi coelomici
- Raccolta di fluidi coelomici: In condizioni sterili, sezionare un cetriolo di mare sano (peso umido di 85-105 g), raccogliere il liquido coelomico e conservarlo in un pallone di vetro sterile.
- Rimozione delle cellule coelomiche: Centrifugare il fluido coelomico in tubi di centrifuga 50 mL a 1.700 x g per 5 min e trasferire il supernatante in un nuovo flacone di vetro sterile; successivamente, raccogliere il fluido coelomico senza cellule del cetriolo di mare.
- Inattivazione dei compon....
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Risultati
Qui, abbiamo stabilito la coltura primaria delle cellule intestinali di A. japonicus e abbiamo fatto passare le cellule. La figura 1 mostra le celle rotonde in diverse fasi di coltura. E i saggi di colorazione EdU forniscono prove dirette per rivelare l'attività proliferaria di queste cellule rotonde nella fase successiva (Figura 2). Abbiamo anche leggermente regolato il protocollo, coltivando i blocchi di tessuto macinato invece delle cellule filtrate;.......
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Discussione
Negli ultimi decenni sono stati dedicati ampi sforzi di ricerca per stabilire le linee cellulari, tuttavia, è ancora difficile fare un progresso sulla coltura a lungo termine delle cellule da invertebrati marini14,22. È stato riferito che le cellule coltivate provenienti da tessuti olothuriani rigeneranti erano vitali per un lungo periodo di tempo e un'elevata attività di proliferazione può essere rilevata in cellule specifiche17,
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il prof. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 41876154, 41606150 e 41406137) e dai Fondi di ricerca fondamentali per le università e gli istituti di ricerca provinciali di ].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1 μ m filtro | Millipore | SLVV033RS | |
| 0,22 μ m filtro | Millipore | SLGP033RB | |
| 0,25% tripsina | genom | GNM25200 | |
| 100 μ m filtro | Falcon | 352360 | |
| piastre da 4 cm | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| soluzione di paraformaldeide al 4% | Reagente chimico Sinopharm | 80096618 | in |
| centrifughe da banco | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Reagente Chimico | 10005817 | |
| Incubatore a temperatura costante | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Desametasone | Sinopharm Reagente Chimico XW00500221 | ||
| d'acqua termostatico elettrico | senxin17 | DK-S28 | |
| Etanolo | Sinopharm Reagente chimico 80176961 | 75% | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Microscopio fluorescente | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamicina | Sinopharm Reagente chimico | XW14054101 | |
| Glucosio | Sinopharm Reagente chimico | 63005518 | |
| Hoechst33258 Soluzione colorante | Beyotime | C1017 | |
| Reagente chimico Insulina | Sinopharm | ||
| Fattore di crescita insulino-simile (IGF) | Reagente chimico PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm | 10016308 | |
| Genom L-15 di Leibovitz | GNM41300 | ||
| L-glutammina (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Reagente chimico | ||
| Na2SO4 | Sinopharm Reagente chimico | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Reagente chimico | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Reagente chimico | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillina-Streptomicina | Genom | ||
| misuratore di PH | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
Riferimenti
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G.
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Ristampe e permessi
