Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.
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Articolo metodologico
Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La differenziazione in vitro delle cellule staminali embrionali umane (HESC) ha trasformato la capacità di studiare lo sviluppo umano su livelli biologici e molecolari e ha fornito cellule da utilizzare in applicazioni rigenerative. Gli approcci standard per la coltura hESC che utilizzano la coltura del tipo di colonia per mantenere hESC indifferenziati e corpo embrionale (EB) e formazione di rosetta per la differenziazione in diversi strati germinali sono inefficienti e dispendiosi in termini di tempo. Di seguito è presentato un metodo di coltura a cella singola che utilizza hESC anziché una cultura di tipo colonia. Questo metodo consente il mantenimento delle caratteristiche degli HESC indifferenziati, inclusa l'espressione di marcatori hESC a livelli paragonabili a quelli del tipo di colonia hESC. Inoltre, il protocollo presenta un metodo efficiente per la generazione di cellule progenitrici neurali (NPC) da hESC di tipo una singola cellula che produce NPC entro 1 settimana. Queste cellule esprimono altamente diversi geni marcatori NPC e possono differenziarsi in vari tipi di cellule neurali, tra cui neuroni dopaminergici e astrociti. Questo sistema di coltura a cella singola per gli HESC sarà utile per studiare i meccanismi molecolari di questi processi, gli studi di alcune malattie e gli schermi di scoperta di farmaci.
Introduzione
Le cellule staminali embrionali umane (HESC) hanno il potenziale per differenziarsi nei tre strati germinali primari, che poi si differenziano in vari linee di cellule progenitrici multipotenti. Questi lignaggi successivamente danno origine a tutti i tipi di cellule nel corpo umano. I sistemi di coltura in vitro hESC hanno trasformato la capacità di studiare lo sviluppo embrionale umano e sono serviti come un valido strumento per ottenere nuove conoscenze su come questi processi sono regolati a livello biologico e molecolare. Allo stesso modo, gli studi sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) generate dalla riprogrammazione di cellule somatiche isolate da ....
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Protocollo
1. Preparazione di piastre rivestite a matrice di membrana del seminterrato qualificate per l'HESC
- Scongelare lentamente la soluzione di matrice di membrana del seminterrato qualificata hESC (vedi Tabella dei materiali)a 4 gradi centigradi per almeno 2-3 h o durante la notte per evitare la formazione di un gel.
- Per preparare piastre rivestite a matrice a membrana seminterrato, diluire la matrice in DMEM freddo/F12 a una concentrazione finale del 2%. Mescolare bene e ricoprire ogni pozzetto di un 6 pozzetto con 1 mL della soluzione a matrice diluita.
- Incubare le piastre rivestite a matrice di membrana seminterrato a temper....
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Risultati
Presentato qui è un protocollo migliorato per la manutenzione e l'espansione della coltura di tipo unicellulare di hESC e la loro efficiente differenziazione in cellule progenitrici neurali, che successivamente si differenzia in vari lignaggi neurali a valle, compresi i neuroni dopaminergici e gli astrociti.
Le immagini di contrasto di fase rappresentative mostrano la morfologia cellulare in diversi passaggi durante l'adattamento del tipo di colonia hESC alla coltura a cella singola (
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Discussione
Metodi scalabili ed efficienti per la differenziazione degli HESC in vari lignaggi e la generazione di un numero sufficiente di cellule differenziate sono criteri importanti per lo screening farmacologico e la terapia con cellule staminali. Sono stati pubblicati vari metodi di passaggio di una singola cellula, in cui le cellule sono coltivate in presenza di inibitore ROCK o altre piccole molecole per migliorare la sopravvivenza, ma i prodotti finali di questi metodi di coltura sono tipo colonia hESC17
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) per la sua assistenza con l'analisi FACS. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale dell'Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale, dai National Institutes of Health, da 01-ES-101585 all'AMJ.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre m da 35 mm | ibidi | 81156 | Piastra per colture cellulari |
| Piastre a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Soluzione per il distacco delle cellule |
| Activin A | R& Sistema D | 338-AC-050 | |
| Acido ascorbico | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 integratore | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Materiali biologici applicati | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuga | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| Incubatore a CO2 | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning Matrice qualificata hESC (Magrigel) | Corning | 354277 | Matrice a membrana basale (utilizzata per la maggior parte del protocollo qui) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Soluzione di congelamento cellulare |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorfina | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Siero fetale bovino | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Materiali biologici applicati | Z101705 | |
| GDNF | Materiali biologici applicati | Z101057 | |
| matrice Geltrex | Thermo Fisher | A1569601 | matrice a membrana basale |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Integratore di glutammina, 100X |
| H9 (WA09) linea di cellule staminali embrionali umane | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC terreno di coltura |
| integratore N2 | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poli-L-ornitina | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inibitore | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Materiali biologici applicati | Z200617 | |
| Terreno progenitore neurale Stemdiff | Stemcell Technologies | 5833 | Terreno di espansione NPC |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229....
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Ristampe e permessi
