Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

Summary

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Abstract

La differenziazione in vitro delle cellule staminali embrionali umane (HESC) ha trasformato la capacità di studiare lo sviluppo umano su livelli biologici e molecolari e ha fornito cellule da utilizzare in applicazioni rigenerative. Gli approcci standard per la coltura hESC che utilizzano la coltura del tipo di colonia per mantenere hESC indifferenziati e corpo embrionale (EB) e formazione di rosetta per la differenziazione in diversi strati germinali sono inefficienti e dispendiosi in termini di tempo. Di seguito è presentato un metodo di coltura a cella singola che utilizza hESC anziché una cultura di tipo colonia. Questo metodo consente il mantenimento delle caratteristiche degli HESC indifferenziati, inclusa l'espressione di marcatori hESC a livelli paragonabili a quelli del tipo di colonia hESC. Inoltre, il protocollo presenta un metodo efficiente per la generazione di cellule progenitrici neurali (NPC) da hESC di tipo una singola cellula che produce NPC entro 1 settimana. Queste cellule esprimono altamente diversi geni marcatori NPC e possono differenziarsi in vari tipi di cellule neurali, tra cui neuroni dopaminergici e astrociti. Questo sistema di coltura a cella singola per gli HESC sarà utile per studiare i meccanismi molecolari di questi processi, gli studi di alcune malattie e gli schermi di scoperta di farmaci.

Introduction

Le cellule staminali embrionali umane (HESC) hanno il potenziale per differenziarsi nei tre strati germinali primari, che poi si differenziano in vari linee di cellule progenitrici multipotenti. Questi lignaggi successivamente danno origine a tutti i tipi di cellule nel corpo umano. I sistemi di coltura in vitro hESC hanno trasformato la capacità di studiare lo sviluppo embrionale umano e sono serviti come un valido strumento per ottenere nuove conoscenze su come questi processi sono regolati a livello biologico e molecolare. Allo stesso modo, gli studi sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) generate dalla riprogrammazione di cellule somatiche isolate da ....

Protocol

1. Preparazione di piastre rivestite a matrice di membrana del seminterrato qualificate per l'HESC

1. Scongelare lentamente la soluzione di matrice di membrana del seminterrato qualificata hESC (vedi Tabella dei materiali)a 4 gradi centigradi per almeno 2-3 h o durante la notte per evitare la formazione di un gel.
2. Per preparare piastre rivestite a matrice a membrana seminterrato, diluire la matrice in DMEM freddo/F12 a una concentrazione finale del 2%. Mescolare bene e ricoprire ogni pozzetto di un 6 pozzetto con 1 mL della soluzione a matrice diluita.
3. Incubare le piastre rivestite a matrice di membrana seminterrato a temper....

Results

Presentato qui è un protocollo migliorato per la manutenzione e l'espansione della coltura di tipo unicellulare di hESC e la loro efficiente differenziazione in cellule progenitrici neurali, che successivamente si differenzia in vari lignaggi neurali a valle, compresi i neuroni dopaminergici e gli astrociti.

Le immagini di contrasto di fase rappresentative mostrano la morfologia cellulare in diversi passaggi durante l'adattamento del tipo di colonia hESC alla coltura a cella singola (

Discussion

Metodi scalabili ed efficienti per la differenziazione degli HESC in vari lignaggi e la generazione di un numero sufficiente di cellule differenziate sono criteri importanti per lo screening farmacologico e la terapia con cellule staminali. Sono stati pubblicati vari metodi di passaggio di una singola cellula, in cui le cellule sono coltivate in presenza di inibitore ROCK o altre piccole molecole per migliorare la sopravvivenza, ma i prodotti finali di questi metodi di coltura sono tipo colonia hESC¹⁷

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre m da 35 mm	ibidi	81156	Piastra per colture cellulari
Piastre a 6 pozzetti	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	Soluzione per il distacco delle cellule
Activin A	R& Sistema D	338-AC-050
Acido ascorbico	Sigma Aldrich	A4403
B27 integratore	Thermo Fisher	17504044
B27 (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	Materiali biologici applicati	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
Centrifuga	DAMON/ICE	428-6759
Incubatore a CO2	Thermo Fisher	4110
Corning Matrice qualificata hESC (Magrigel)	Corning	354277	Matrice a membrana basale (utilizzata per la maggior parte del protocollo qui)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	Soluzione di congelamento cellulare
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorfina	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
Siero fetale bovino	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	Materiali biologici applicati	Z101705
GDNF	Materiali biologici applicati	Z101057
matrice Geltrex	Thermo Fisher	A1569601	matrice a membrana basale
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	Integratore di glutammina, 100X
H9 (WA09) linea di cellule staminali embrionali umane	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
Knockout DMEM	Thermo Fisher	10829018
Knockout Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC terreno di coltura
integratore N2	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	P3655
ROCK inibitore	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Materiali biologici applicati	Z200617
Terreno progenitore neurale Stemdiff	Stemcell Technologies	5833	Terreno di espansione NPC