Method Article

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

DOI:

10.3791/60571

⸱

January 18th, 2020

 ,  , 
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, 2NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La differenziazione in vitro delle cellule staminali embrionali umane (HESC) ha trasformato la capacità di studiare lo sviluppo umano su livelli biologici e molecolari e ha fornito cellule da utilizzare in applicazioni rigenerative. Gli approcci standard per la coltura hESC che utilizzano la coltura del tipo di colonia per mantenere hESC indifferenziati e corpo embrionale (EB) e formazione di rosetta per la differenziazione in diversi strati germinali sono inefficienti e dispendiosi in termini di tempo. Di seguito è presentato un metodo di coltura a cella singola che utilizza hESC anziché una cultura di tipo colonia. Questo metodo consente il mantenimento delle caratteristiche degli HESC indifferenziati, inclusa l'espressione di marcatori hESC a livelli paragonabili a quelli del tipo di colonia hESC. Inoltre, il protocollo presenta un metodo efficiente per la generazione di cellule progenitrici neurali (NPC) da hESC di tipo una singola cellula che produce NPC entro 1 settimana. Queste cellule esprimono altamente diversi geni marcatori NPC e possono differenziarsi in vari tipi di cellule neurali, tra cui neuroni dopaminergici e astrociti. Questo sistema di coltura a cella singola per gli HESC sarà utile per studiare i meccanismi molecolari di questi processi, gli studi di alcune malattie e gli schermi di scoperta di farmaci.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali embrionali umane (HESC) hanno il potenziale per differenziarsi nei tre strati germinali primari, che poi si differenziano in vari linee di cellule progenitrici multipotenti. Questi lignaggi successivamente danno origine a tutti i tipi di cellule nel corpo umano. I sistemi di coltura in vitro hESC hanno trasformato la capacità di studiare lo sviluppo embrionale umano e sono serviti come un valido strumento per ottenere nuove conoscenze su come questi processi sono regolati a livello biologico e molecolare. Allo stesso modo, gli studi sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) generate dalla riprogrammazione di cellule somatiche isolate da pazienti umani forniscono nuove informazioni su varie malattie. Inoltre, le cellule progenitrici e differenziate derivate dagli HESC possono essere utili per la ricerca che coinvolge la terapia con cellule staminali e lo screening farmacologico1,2,3,4.

Gli hESC possono essere indotti a differenziarsi in cellule progenitrici neurali (NPC), che sono cellule multipotenziale con un'ampia capacità di auto-rinnovamento. Successivamente, queste cellule possono essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti5,6. I PNG offrono anche un sistema cellulare per studi in vitro sulla biologia del neurosviluppo e varie malattie neurologiche. Tuttavia, gli attuali metodi di coltura del tipo di colonia che coinvolgono gli HESC e la loro differenziazione nei PNG sono inefficienti e spesso coinvolgono la cocultura così come il corpo embrionale (EB) e la formazione di rosetta5,7,8,9. Questi protocolli presentano tassi di sopravvivenza più bassi e differenziazione spontanea e richiedono più tempo.

Presentato qui è un sistema di coltura migliorato e robusto che è facilmente scalabile e utilizza la coltura di tipo a cella singola ad alta densità di hESCs10. L'inclusione dell'inibitore della chinasi Roh (ROCK) ha contribuito a migliorare significativamente l'efficienza di sopravvivenza durante la coltura a tipo di singola cellula di hESC10,11,12,13,14. In questo sistema di coltura, gli hESC possono essere facilmente mantenuti ed espansi. Inoltre, il protocollo presenta un metodo efficiente per generare NPC dalla coltura di tipo a cella singola degli hESC, che permette la produzione di percorsi di segnalazione altamente puri di NPC. Inibizione di BMP/TGF/activin con inibitori ALK inducono in modo efficiente la differenziazione degli hESC di tipo monocellulare in NPC15,16, che possono poi essere indotti a differenziarsi in lignaggi neurali funzionali, come i neuroni dopaminergici e gli astrociti.

In sintesi, il protocollo di coltura di tipo unicellulare che utilizza hESC offre un modello interessante per studiare la differenziazione di queste cellule in varie linee, tra cui i PNG. Questo protocollo è facilmente scalabile e quindi adatto per la generazione di cellule per la ricerca che coinvolge la terapia rigenerativa e lo screening farmacologico.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione di piastre rivestite a matrice di membrana del seminterrato qualificate per l'HESC

  1. Scongelare lentamente la soluzione di matrice di membrana del seminterrato qualificata hESC (vedi Tabella dei materiali)a 4 gradi centigradi per almeno 2-3 h o durante la notte per evitare la formazione di un gel.
  2. Per preparare piastre rivestite a matrice a membrana seminterrato, diluire la matrice in DMEM freddo/F12 a una concentrazione finale del 2%. Mescolare bene e ricoprire ogni pozzetto di un 6 pozzetto con 1 mL della soluzione a matrice diluita.
  3. Incubare le piastre rivestite a matrice di membrana seminterrato a temperatura ambiente (RT) per almeno 3 h o a 4 gradi durante la notte.
    NOTA: Le piastre con matrice di membrana seminterrato possono essere conservate a 4 gradi centigradi per 1 settimana prima che la soluzione a matrice venga rimossa e vengano utilizzate piastre.

2. Adattamento del tipo di colonia hESC alla coltura hESC a cella singola

  1. Per passare le colture senza alimentatore di colonia tipo H9 (WA09) hESCs cresciuto sulla matrice della membrana seminterrato, aspirare il mezzo dai pozzi (Figura 1A)9.
  2. Lavare 1x con 1 mL di DPBS. Aggiungere 1 mL di soluzione dispase (1 U/mL) per pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 20 min.
  3. Rimuovere il dispasi, lavare delicatamente le celle 1x con 2 mL di DMEM/F12, rimuovere il mezzo e aggiungere 2 mL di DMEM/F12 ad ogni piastra.
  4. Staccare delicatamente le colonie pipettando su e giù e trasferire in un tubo da 15 mL.
  5. Centrifugare i pellet per 2 min a 370 x g e aspirare il mezzo.
  6. Per dissociare i pellet cellulari in singole cellule, aggiungere 2 mL di soluzione di distacco cellulare (1x concentrazione, vedere Tabella dei materiali) e incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
  7. Centrifugare le cellule per 2 min a 370 x g e rimuovere la soluzione di distacco.
  8. Aggiungere il mezzo ESC umano mTeSR1 fresco e dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù.
  9. Per adattare gli hESC di tipo colonia a una coltura di tipo a cella singola, piastra di circa 1,5–2,0 x 106 hESC in ogni pozzo della matrice di membrana del seminterrato rivestita 6 pozze in 2 mL di mTeSR1 contenente 10 - M inibitore ROCK per 24 h (Figura 1A).
  10. Dopo 24 h, sostituire il supporto hESC con mTeSR1 fresco senza inibitore ROCK e consentire agli hESC di crescere come tipo a cella singola per 3 giorni. Cambiare il mezzo giornaliero.
  11. Il giorno 4, quando le colture raggiungono quasi il 100% di confluenza, dissociare le cellule in soluzione di distacco, quindi rifare piastrare come descritto al punto 2.6.
    NOTA: L'inibitore ROCK migliora la sopravvivenza delle cellule durante le 24 h iniziali di coltura hESC di tipo a cellula singola.

3. Formazione e differenziazione del corpo embrionale in tre strati germinali(Figura 2)

  1. Per formare gli EB, prima risospendere le cellule in 3 mL di mezzo mTeSR1 con 10 inibitori o più di ROCK durante le prime 24 h, quindi incubare perladurante in piatti a basso attaccamento da 60 mm in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per consentire l'aggregazione.
  2. Dopo 24 h, i piccoli EB vengono trasferiti in un tubo da 15 mL. Lasciare che gli EB si depositino sul fondo del tubo e rimuovere delicatamente il mezzo con una pipetta. Trasferire gli EB nel mezzo EB (knockout-DMEM integrato con la sostituzione del siero da buoi del 20%, supplemento 1x glutammina [vedi Tabella dei materiali],1% NEAA [aminoacidi non essenziali; vedi Tabella dei materiali], e 0,2% z-mercaptoetanolo) e consentire loro di espandersi in piatti a basso attacco per 7 giorni. Il mezzo può essere modificato a giorni alterni come descritto in precedenza (Figura 2A).
  3. Il giorno 7, raccogliere gli EB dai piatti e trasferirli in un tubo da 15 mL. Rimuovere delicatamente il mezzo con una pipetta e trasferire gli EB in una piastra a matrice a matrice seminterrato rivestita 6 pozzetto.
  4. Lasciare che gli EB si attacchino alla piastra e incubano per 12 giorni in media EB, durante i quali si differenziano nei tre strati germinali (Figura 2B). Cambiare il supporto ogni due giorni.
    NOTA: durante l'aggregazione delle cellule, il piatto a basso attacco aiuta a evitare l'attacco EB.

4. Differenziazione del tipo a cella singola hESCs nei PNG (Figura 3)

  1. Per indurre la differenziazione nPC, dissociare il tipo monocellulare hESCs con 1 mL di soluzione di distacco (1x) e incubare per 10 min a 37 gradi centigradi.
  2. Centrifugare le cellule per 2 min a 370 x g e rimuovere la soluzione di stacco supernatante. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 e rimettere in sospensione le celle con un leggero pipettaggio.
  3. Piastre di cellule su una membrana seminterrato rivestito 6 pozzetto ad una densità di 2 x 105 cellule / bene in 2 mL di mTeSR1 contenente 10 - M inibitore ROCK.
  4. Dopo 24 h, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di induzione neurale (DMEM con 1% B27 meno vitamina A) integrato con 1 dorsomorfina M e 5 SB431542.
  5. Cambiare il mezzo ogni due giorni durante i primi 4 giorni di induzione neurale, quindi ogni giorno fino a raggiungere la confluenza al giorno 7 (Figura 3B).
    NOTA: (1) La Dorsomorfina inibisce la via BMP prendendo di mira i recettori ALK2,3,6 e inibisce anche l'AMPK; SB431542 è un inibitore della via TGF/Activin prendendo di mira ALK5,7. (2) Lo stesso protocollo è stato testato con un'altra linea ESC (WA01), che ha dato risultati simili a quelli di WA0916. (3) Abbiamo generalmente usato Matrigel per la matrice della membrana seminterrato; tuttavia, le cellule possono essere coltivate su Geltrex e quindi differenziate in PNG con risultati molto simili, come indicato dall'espressione di diversi marcatori NPC (Figura 4D,E). Maneggiare Geltrex allo stesso modo di Matrigel (vedere la sezione 1).

5. Espansione e crioconservazione NPC

  1. Dopo 7 giorni di induzione neurale, dissociare le cellule con 1 mL di soluzione di distacco (1x) e incubare per 10 min a 37 .
  2. Centrifugare le cellule per 2 min a 370 x g e rimuovere la soluzione di stacco supernatante. Aggiungete 1 mL di mezzo di espansione NPC (vedere Tabella dei materiali)e sospendete nuovamente le celle con un delicato pipettaggio.
  3. Piastra 1 x 105 cellule in 2 mL di mezzo di espansione NPC su membrana seminterrato rivestito a matrice 6 piastre di pozzo.
  4. Passaggio npc più volte, se necessario, quando le culture raggiungono quasi il 90% di confluenza. Durante i primi 3-4 passaggi, aggiungere 10 m l'inibitore ROCK durante l'iniziale 24 h per prevenire la morte cellulare. Dopo questi passaggi, le cellule possono essere smistati e coltivate senza inibitore ROCK. Cambiare il supporto ogni due giorni durante l'espansione.
  5. Crioconservare i PNG quando le culture raggiungono la confluenza.
    1. Per la crioconservazione, dissociare le cellule in 1 mL di soluzione di distacco (1x) per 5 min a 37 gradi centigradi, quindi centrifugare la sospensione per 2 min a 370 x g per rimuovere la soluzione di distacco.
    2. Aggiungere la soluzione di congelamento delle cellule (vedere Tabella dei materiali) ai PNG dissociati a 1 x 106 cellule/mL e distribuire 1 mL di aliquote ai crioviali.
    3. Mettere i crioviali nel contenitore di congelamento e conservarli per una notte in un congelatore a -80 gradi centigradi.
  6. Conservare le crioviali nell'azoto liquido.

6. Preparazione di piastre poli-L-ornitine (PLA) e Laminin rivestite

  1. Per preparare le piastre rivestite di PLO/laminin, diluire la soluzione di riserva Di PLO in PBS o acqua fino a una concentrazione finale di 10 g/mL. Mescolare bene e coprire ogni pozzetto di un 6 pozzetto con 1 mL di soluzione LLO diluita.
  2. Incubare per almeno 2 h a 37 gradi centigradi o peruna notte a 4 gradi centigradi.
  3. Lavare ogni pozzo con PBS.
  4. Soluzione disfusione di laminina diluita in PBS freddo o acqua a 10 g/mL. Mescolare bene la soluzione di laminina. Rimuovere il PBS e ricoprire immediatamente ogni pozzetto con 1 mL della soluzione laminina. Conservare i piatti a 4 gradi centigradi e utilizzarli entro 1 settimana. Lavare con PBS e aggiungere immediatamente il supporto di coltura.
    NOTA: Non lasciare asciugare i piatti rivestiti di PLO/laminin.

7. Differenziazione dei PNG derivati da hESC nei neuroni dopaminergici (Figura 6A)

  1. Piastra npPc in piatti rivestiti di PLO/laminina nel mezzo di espansione NPC ad una densità di circa il 50%.
  2. Dopo 24 h, cambiare il mezzo a DA1 medio (mezzo neurobasale contenente 2 mM supplemento glutammina, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/mL SHH, e 100 ng/mL FGF8) e cambiare il mezzo ogni altro giorno.
  3. Le culture di passaggio quando raggiungono la confluenza. Dissociare le cellule con 1 mL di soluzione di distacco (1x) e incubare per 10 min a 37 gradi centigradi.
  4. Centrifugare le cellule per 2 min a 370 x g e rimuovere la soluzione di stacco supernatante. Aggiungere 1 mL di DA1 medio e rimettere in sospensione le celle con pipettaggio delicato.
  5. Piastra 1 x 105 cellule in 2 mL di DA1 medio su PLO/lamininin rivestito 6 piatti ben rivestiti.
  6. Dopo 10 giorni, passare al mezzo DA2 (mezzo neurobasale contenente supplemento di 2 mM glutammina, 1x NEAA, 1x B27, 200 M acido ascorbico, 20 ng/mL BDNF, e 20 ng/mL GNDF) e cambiare il mezzo ogni altro giorno per altri 20 giorni (Figura 6A).
    NOTA: Aggiungere giornalmente l'acido ascorbico fresco al mezzo DA2. Entro i primi 14 giorni, le cellule differenziate devono essere passate quando raggiungono il 90% di confluenza, ma non più dopo.

8. Differenziazione dei PNG derivati dal CES in astrociti

  1. Cellule progenitrici neurali su placche rivestite di PL/laminina nel mezzo di espansione NPC ad una densità di circa il 50%.
  2. Dopo 24 h, cambiare il mezzo a astrocito medio (DMEM/F12 medio tra cui 1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/mL IGF, 10 ng/mL activin A, 10 ng/mL heregulin - 1 e 8 ng/mL bFGF) e cambiare il mezzo ogni altro giorno.
  3. Le culture di passaggio quando raggiungono la confluenza. Dissociare le cellule con 1 mL di soluzione di distacco (1x) e incubare per 10 min a 37 gradi centigradi.
  4. Centrifugare le cellule per 2 min a 370 x g e rimuovere la soluzione di stacco supernatante. Aggiungere 1 mL di mezzo astrocite e rimettere in sospensione le celle con una leggera pipettatura.
  5. Piatto 1 x 105 cellule in 2 mL di mezzo astrocito su PLO/laminin-coated 6 piatti ben rivestiti.
  6. Consentire alla differenziazione di continuare per un totale di 5-6 settimane (Figura 6B).

9. Immunofluorescenza Colorazione

  1. Cellule di coltura in piatti da 35 mm, come descritto sopra per ogni tipo di cellula. Aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL di 4% soluzione PFA per piatto e incubare per 20 min a RT.
  2. Lavare 2 volte per 5 min con PBS.
    NOTA: Una volta che le celle sono fissate, le piastre di analisi possono essere sigillate con parafilm e conservate a 4 gradi centigradi. Macchia con un anticorpo entro 1 settimana dalla fissazione.
  3. Aggiungere 300 ll di soluzione di blocco (siero di capra o asino in PBS) per piatto e incubare a RT per 30-60 min.
  4. Lavare il piatto 2x con PBS per 5 min.
  5. Aggiungere 300 l di anticorpi primari(tabella 1)(diluito nella soluzione di blocco) e incubare a RT per 1,5 h o peruna durante la notte a 4 gradi centigradi.
  6. Lavare 2x con PBS per 10 min.
  7. Aggiungere 300 l di anticorpo secondario coniugato fluorescente (Tabella 1) nella soluzione di blocco e incubare al buio per 1 h a RT.
  8. Lavare le cellule 2x per 10 min con PBS.
  9. Aggiungere la soluzione di colorazione Hoechst (1 m di concentrazione finale in PBS) ai nuclei macchiati. Incubare le cellule al buio per 5 min a RT.
  10. Lavare le celle 1x con PBS per 5 min e quindi aggiungere 500 -L di PBS. Tenere i piatti al buio, quindi osservare la fluorescenza con un microscopio confocale (Figura 2B, Figura 5C, Figura 6Ae Figura 7B).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentato qui è un protocollo migliorato per la manutenzione e l'espansione della coltura di tipo unicellulare di hESC e la loro efficiente differenziazione in cellule progenitrici neurali, che successivamente si differenzia in vari lignaggi neurali a valle, compresi i neuroni dopaminergici e gli astrociti.

Le immagini di contrasto di fase rappresentative mostrano la morfologia cellulare in diversi passaggi durante l'adattamento del tipo di colonia hESC alla coltura a cella singola (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodi scalabili ed efficienti per la differenziazione degli HESC in vari lignaggi e la generazione di un numero sufficiente di cellule differenziate sono criteri importanti per lo screening farmacologico e la terapia con cellule staminali. Sono stati pubblicati vari metodi di passaggio di una singola cellula, in cui le cellule sono coltivate in presenza di inibitore ROCK o altre piccole molecole per migliorare la sopravvivenza, ma i prodotti finali di questi metodi di coltura sono tipo colonia hESC17

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) per la sua assistenza con l'analisi FACS. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale dell'Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale, dai National Institutes of Health, da 01-ES-101585 all'AMJ.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastre m da 35 mmibidi81156Piastra per colture cellulari
Piastre a 6 pozzettiCorning3516
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104-500Soluzione per il distacco delle cellule
Activin AR& Sistema D338-AC-050
Acido ascorbicoSigma AldrichA4403
B27 integratoreThermo Fisher17504044
B27 (-Vit A)Thermo Fisher12587010
BDNFMateriali biologici applicatiZ100065
bFGFPeprotech100-18C
CentrifugaDAMON/ICE428-6759
Incubatore a CO2Thermo Fisher4110
Corning Matrice qualificata hESC (Magrigel)Corning354277Matrice a membrana basale (utilizzata per la maggior parte del protocollo qui)
Cryostor CS 10Stemcell Technologies7930Soluzione di congelamento cellulare
DispaseStemcell Technologies7923
DMEMThermo Fisher10569-010
DMEM/F12Thermo Fisher10565-018
DorsomorfinaTocris3093
EGFPeprotechAF-100-16A
Siero fetale bovinoFisher ScientificSH3007003HI
FGF8Materiali biologici applicatiZ101705
GDNFMateriali biologici applicatiZ101057
matrice GeltrexThermo FisherA1569601matrice a membrana basale
GlutaMaxThermo Fisher35050061Integratore di glutammina, 100X
H9 (WA09) linea di cellule staminali embrionali umaneWiCellWA09
Heregulin b-1Peprotech100-3
IGFPeprotech100-11
Knockout DMEMThermo Fisher10829018
Knockout Serum ReplacementThermo Fisher10828028
LamininSigma AldrichL2020
mTeSR1Stemcell Technologies85850hESC terreno di coltura
integratore N2Thermo Fisher17502001
NEAAThermo Fisher11140050
NeurobasalThermo Fisher21103049
Poli-L-ornitinaSigma AldrichP3655
ROCK inibitoreTocris1254
SB431542Tocris1614
SHHMateriali biologici applicatiZ200617
Terreno progenitore neurale StemdiffStemcell Technologies5833Terreno di espansione NPC

References

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