Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.
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Articolo metodologico
Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunohistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per esplorare l'espressione e la localizzazione delle proteine sia durante i normali stati di sviluppo che di malattia. Sebbene molti protocolli di immunohistochimica siano stati ottimizzati per le sezioni dei tessuti e dei tessuti dei mammiferi, questi protocolli spesso richiedono modifiche e ottimizzazione per gli organismi modello non mammiferi. I pesci zebra sono sempre più utilizzati come sistema modello nella ricerca di base, biomedica e traslazionale per studiare i meccanismi biologici molecolari, genetici e cellulari dei processi di sviluppo. Il pesce zebra offre molti vantaggi come sistema modello, ma richiede anche tecniche modificate per un rilevamento ottimale delle proteine. Qui, forniamo il nostro protocollo per l'immunohistochimica a fluorescenza integrale in embrioni di pesce zebra e larve. Questo protocollo descrive inoltre diverse strategie di montaggio che possono essere impiegate e una panoramica dei vantaggi e degli svantaggi offerti da ciascuna strategia. Descriviamo anche modifiche a questo protocollo per consentire il rilevamento di substrati cromogenici nell'intero tessuto di montaggio e il rilevamento della fluorescenza nel tessuto larvale sezionato. Questo protocollo è ampiamente applicabile allo studio di molte fasi di sviluppo e strutture embrionali.
Introduzione
Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente modello per lo studio dei processi biologici per diversi motivi, tra cui tempi di breve generazione, rapido sviluppo e amenabilità alle tecniche genetiche. Di conseguenza, i pesci zebra sono comunemente utilizzati in schermi ad alta produttività di piccole molecole per la ricerca tossicologica e la scoperta di farmaci. Il pesce zebra è anche un modello interessante per lo studio dei processi di sviluppo, dato che una singola femmina può produrre regolarmente 50-300 uova alla volta e gli embrioni otticamente chiari si sviluppano esternamente consentendo una visualizzazione efficiente dei processi di svilupp....
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Protocollo
Le procedure per lavorare con gli adulti e gli embrioni di allevamento di pesci zebra descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Murray State University.
1. Raccolta e fissazione dell'embrione
- Preparare i serbatoi di deposizione delle uova mettendo coppie di sesso misti di pesce zebra adulti o gruppi in serbatoi con una rete o fodera scanalata riempita con acqua di sistema durante la notte.
- All'accesa, cambiare l'acqua del serbatoio di deposizione delle uova per l'acqua del sistema fresco per rimuovere le feci. Utilizzare un ciclo scuro chiaro di....
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Risultati
L'immunohistochimica integrale utilizza anticorpi per rilevare il modello spaziale dell'espressione proteica nell'animale intatto. Il flusso di lavoro di base dell'immunoistochimica (illustrata nella figura 1) prevede l'allevamento del pesce zebra, l'allevamento e la preparazione di embrioni, il blocco di antigeni non specifici, l'utilizzo di un antigene primario specifico dell'antigene per colpire la proteina di interesse, il rilevamento di tale anticorpo pr.......
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Discussione
L'immunohistochimica è uno strumento versatile che può essere utilizzato per caratterizzare l'espressione spatio-temporale di praticamente qualsiasi proteina di interesse in un organismo. L'immunohistochimica è utilizzata su un'ampia varietà di tessuti e organismi modello. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso nel pesce zebra. L'immunostochimica in specie diverse può richiedere diverse tecniche di fissazione e manipolazione, soluzioni di blocco a seconda delle specie e la presenza di perossie endogene e tempi d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno informazioni da divulgare.
Ringraziamenti
Finanziamenti della sovvenzione NIH 8P20GM103436 14.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Foglio di alluminio, resistente | Kirkland | Qualsiasi marca può essere sostituita Anticorpo | |
| anti-NMDA | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-fosfo-istone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA recettore (GluR1-4) | Millipore Sigma | ||
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Nitrato di calcio [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Provette da centrifuga, 1,5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Smalto trasparente | Sally Hanson | Qualsiasi smalto o indurente può essere sostituito | |
| Thermo Scientific | 1855920 | ||
| Terreno embrionale, Danieau, 30% | 17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES in acqua ultrapura. | ||
| Terreno embrionale, E2 | 7,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 μ M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L blu di metilene | ||
| Supporto per provetta galleggiante | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Microscopio composto a fluorescenza | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Stereomicroscopio a fluorescenza | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Vetrini coprioggetti 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Vetrini coprioggetti 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Vetrini Fisher | Scientific | 12-544-4 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| IgG antitopo capra Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Soluzione HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Camera umida con coperchio | Simport | M920-2 | |
| Perossido di idrogeno, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Spille per insetti, misura 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Solfato di magnesio (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Filtro a rete | Oneida | Qualsiasi marca può essere sostituita | |
| Metanolo | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Blu di metilene | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Blocco del tappo della microprovetta | Research Products International | 145062 | |
| Forno a microonde | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Siero di capra normale | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Miscelatore nutante | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldeide | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pipette Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Mezzo di montaggio Permount | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Piastra di Petri (vetro) | Pyrex | 3160100 | |
| Piastra di Petri (plastica) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-fenil 2-tiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x, pH 7,4 | Gibco | 70011-044 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x | 1x a partire da 10x stock diluito in dH2O | ||
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Idrossido di potassio (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronasi | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinasi K | Invitrogen | AM2544 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Vasca di deposizione delle uova con coperchio e inserto | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + vetrini | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8,0; 150 mM di NaCl; 0,1% Tween20; made in dH2O | ||
| Pipetta di trasferimento | Fisher | 13-711-7M | |
| Acido tricloroacetico (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Pinza ultrafine | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Acqua, ultrapura/doppia distillazione | Fisher Scientific | W2-20 |
Riferimenti
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31
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Ristampe e permessi
