Qui, presentiamo una procedura dettagliata per eseguire un progetto di esperimento in un micro-bioreattore automatizzato seguito dal raccolto cellulare e dalla quantificazione delle proteine utilizzando una colonna di proteine A.
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Articolo metodologico
Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ottimizzazione dei bioprocessi per aumentare la resa dei prodotti desiderati è importante nell'industria biofarmaceutica. Ciò può essere ottenuto mediante la selezione della deformazione e lo sviluppo di parametri di bioprocesso. A questo scopo sono stati utilizzati flaconi Shake. Essi, tuttavia, non sono in grado di controllare i parametri di processo come il pH e l'ossigeno disciolto (DO). Questa limitazione può essere superata con l'aiuto di un microbioreattore automatico. Questi bioreattori imitano la coltivazione su scala più ampia. Uno dei principali vantaggi di questo sistema è l'integrazione del Design of Experiment (DOE) nel software. Questa integrazione consente di stabilire un progetto in cui più parametri di processo possono essere variati contemporaneamente. I parametri di processo critici e le condizioni ottimali del bioprocesso possono essere analizzati all'interno del software. L'obiettivo del lavoro qui presentato è quello di introdurre l'utente alle fasi coinvolte nella progettazione del processo nel software e nell'incorporazione del DOE all'interno della corsa di coltivazione.
Introduzione
Il mercato biofarmaceutico globale ha varato più di 250 miliardi di dollari nel 2018 ed è in continua espansione1. Le aziende farmaceutiche si stanno allontanando dalla produzione di piccoli farmaci molecolari a terapie biotecnologicamente prodotte come le proteine ricombinanti. Questi da soli sono responsabili di un fatturato di oltre 150 miliardi di dollari1. Le cellule dei mammiferi sono ora ampiamente utilizzate per la produzione di queste proteine ricombinanti farmaceutiche. Nel periodo attuale, tra i 68 prodotti approvati prodotti dalle cellule dei mammiferi, 57 sono prodotti dalle cellule ovariche di Hamster cines....
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Protocollo
1. Procedura di precultura
NOT: Per questo protocollo vengono utilizzate cellule RICO DG44 ricombinanti con una concentrazione cellulare vitale di 1 x 107 celle/mL.
- Scongelare la fiala contenente 1,2 mL di cellule a temperatura ambiente e trasferire immediatamente la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga conica da 15 mL contenente 10 mL di mezzo di semi freddi.
- Centrifugare il tubo centrifuga conico per 5 minuti a 190 x g e temperatura ambiente e scartare il supernatante.
- Preriscaldare 150 mL del mezzo seme in un flacone di scossone da 500 mL a 36,8 gradi centigrad....
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Risultati
Una panoramica della coltivazione effettuata in questo studio è presentata nella Figura 2.
Figura 2: Rappresentazione schematica delle condizioni sperimentali per testare i profili di pH e di velocità dell'agitazione nelle stazioni di coltura. La figura rappresenta anche il layout corretto per posizionare i vasi.
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Discussione
L'ottimizzazione del processo per aumentare la resa è di fondamentale importanza nell'industria biofarmaceutica. I flaconi di agitazione potrebbero essere potenzialmente utilizzati per lo screening del ceppo; tuttavia, il monitoraggio dei parametri di processo come pH e DO non sono disponibili nei flaconi. I microreattori hanno un vantaggio in quanto consentono un monitoraggio e un controllo continui del processo. Questi cicli di controllo nel microreattore forniscono anche una condizione simile a quelli su larga scala e.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Bundesministerium f'r Bildung und Forschung (BMBF), il Ministero federale dell'istruzione e della ricerca, in Germania, e il team di BioProcessing di Sartorius Stedim Biotech GmbH, Germania, per il loro sostegno.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Puntali per pipette monouso da 1 mL, sterilizzati | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutammina | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| Piastre a pozzetti profondi a 24 pozzetti | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| Puntali per pipette monouso da 5 mL, sterilizzati | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automatizzato sistema di microbioreattore | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Coltura cellulare 24 Bioreattori monouso - Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Emulsione antischiuma C | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Tappo del flacone Filtro sterile | Corning, Merck | CLS431474 | 0,1 μ m dimensione dei pori |
| CEDEX Detergente (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Contatore di cellule | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 linea cellulare | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Terreno di produzione | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Coltura stock Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Sistema di cromatografia liquida ad alta pressione | VWR International | ||
| Provetta per centrifuga conica | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Etanolo | Merck | ||
| Glicina | Carl Roth | 56-40-6 | |
| Fiale HPLC | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich, Merck | P4417 | |
| Proteina A Colonna | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1,7 mL |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodio fosfato bibasico anidro | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Seleziona |
Riferimenti
- Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018.....
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Ristampe e permessi
