Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

Summary

Qui, presentiamo una procedura dettagliata per eseguire un progetto di esperimento in un micro-bioreattore automatizzato seguito dal raccolto cellulare e dalla quantificazione delle proteine utilizzando una colonna di proteine A.

Abstract

L'ottimizzazione dei bioprocessi per aumentare la resa dei prodotti desiderati è importante nell'industria biofarmaceutica. Ciò può essere ottenuto mediante la selezione della deformazione e lo sviluppo di parametri di bioprocesso. A questo scopo sono stati utilizzati flaconi Shake. Essi, tuttavia, non sono in grado di controllare i parametri di processo come il pH e l'ossigeno disciolto (DO). Questa limitazione può essere superata con l'aiuto di un microbioreattore automatico. Questi bioreattori imitano la coltivazione su scala più ampia. Uno dei principali vantaggi di questo sistema è l'integrazione del Design of Experiment (DOE) nel software. Questa integrazione consente di stabilire un progetto in cui più parametri di processo possono essere variati contemporaneamente. I parametri di processo critici e le condizioni ottimali del bioprocesso possono essere analizzati all'interno del software. L'obiettivo del lavoro qui presentato è quello di introdurre l'utente alle fasi coinvolte nella progettazione del processo nel software e nell'incorporazione del DOE all'interno della corsa di coltivazione.

Introduction

Il mercato biofarmaceutico globale ha varato più di 250 miliardi di dollari nel 2018 ed è in continua espansione¹. Le aziende farmaceutiche si stanno allontanando dalla produzione di piccoli farmaci molecolari a terapie biotecnologicamente prodotte come le proteine ricombinanti. Questi da soli sono responsabili di un fatturato di oltre 150 miliardi di dollari¹. Le cellule dei mammiferi sono ora ampiamente utilizzate per la produzione di queste proteine ricombinanti farmaceutiche. Nel periodo attuale, tra i 68 prodotti approvati prodotti dalle cellule dei mammiferi, 57 sono prodotti dalle cellule ovariche di Hamster cines....

Protocol

1. Procedura di precultura

NOT: Per questo protocollo vengono utilizzate cellule RICO DG44 ricombinanti con una concentrazione cellulare vitale di 1 x 10⁷ celle/mL.

1. Scongelare la fiala contenente 1,2 mL di cellule a temperatura ambiente e trasferire immediatamente la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga conica da 15 mL contenente 10 mL di mezzo di semi freddi.
2. Centrifugare il tubo centrifuga conico per 5 minuti a 190 x g e temperatura ambiente e scartare il supernatante.
3. Preriscaldare 150 mL del mezzo seme in un flacone di scossone da 500 mL a 36,8 gradi centigrad....

Results

Una panoramica della coltivazione effettuata in questo studio è presentata nella Figura 2.

Figura 2: Rappresentazione schematica delle condizioni sperimentali per testare i profili di pH e di velocità dell'agitazione nelle stazioni di coltura. La figura rappresenta anche il layout corretto per posizionare i vasi.

Discussion

L'ottimizzazione del processo per aumentare la resa è di fondamentale importanza nell'industria biofarmaceutica. I flaconi di agitazione potrebbero essere potenzialmente utilizzati per lo screening del ceppo; tuttavia, il monitoraggio dei parametri di processo come pH e DO non sono disponibili nei flaconi. I microreattori hanno un vantaggio in quanto consentono un monitoraggio e un controllo continui del processo. Questi cicli di controllo nel microreattore forniscono anche una condizione simile a quelli su larga scala e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Puntali per pipette monouso da 1 mL, sterilizzati	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0040
200 mM L-glutammina	Corning, Merck	25-005-CV
Piastre a pozzetti profondi a 24 pozzetti	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0038
Puntali per pipette monouso da 5 mL, sterilizzati	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0039
ambr 15 automatizzato sistema di microbioreattore	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-2804
ambr 15 Coltura cellulare 24 Bioreattori monouso - Sparged	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-1B86
Emulsione antischiuma C	Sigma-Aldrich, Merck	A8011
Tappo del flacone Filtro sterile	Corning, Merck	CLS431474	0,1 μ m dimensione dei pori
CEDEX Detergente (3% Mucosol)	Roche Innovatis AG	05-650-658-001
Contatore di cellule	Roche Innovatis AG	05-650-216-001	CEDEX HiRes
CHO DG44 linea cellulare	Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA)	Sigma-Aldrich, Merck	CR80025
CHOKO Feed Media B (FMB)	Sigma-Aldrich, Merck	CR80026
CHOKO Terreno di produzione	Sigma-Aldrich, Merck	CR80027
CHOKO Coltura stock Meium	Sigma-Aldrich, Merck	CR80028
Sistema di cromatografia liquida ad alta pressione	VWR International
Provetta per centrifuga conica	Corning, Merck	SIAL0790
Etanolo	Merck
Glicina	Carl Roth	56-40-6
Fiale HPLC	VWR International	SUPLSU860181
PBS	Sigma-Aldrich, Merck	P4417
Proteina A Colonna	Thermo Fisher Scientific	1502226	POROS™ A 1,7  mL
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich,Merck	7647-14-5
Sodio fosfato bibasico anidro	Sigma-Aldrich,Merck	7558-79-4
Trypan Blue	VWR International	VWRVK940
YSI	YSI Inc	2900D	YSI 2900 Seleziona