Method Article

Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione, abbiamo sviluppato un approccio per lo screening delle librerie di arumani lentivirali o retrovirali con array utilizzando un saggio di reporter trascrizionale basato sulla doppia luciferasi. Questo approccio offre un modo rapido e relativamente poco costoso per vagliare centinaia di candidati in un unico esperimento.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I fattori di trascrizione possono alterare l'espressione di numerosi geni bersaglio che influenzano una varietà di processi a valle, rendendoli buoni bersagli per le terapie anti-cancro. Tuttavia, il targeting diretto dei fattori di trascrizione è spesso difficile e può causare effetti collaterali negativi se il fattore di trascrizione è necessario in uno o più tessuti adulti. Identificare i regolatori a monte che attivano aberrantei i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali offre un'alternativa più fattibile, in particolare se queste proteine sono facili da sottofare. In questo articolo, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per combinare librerie di lentivirali di media portata in serie e un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. Il nostro approccio offre un modo rapido, semplice ed economico per testare centinaia di geni in un unico esperimento. Per dimostrare l'uso di questo approccio, abbiamo eseguito uno schermo di una libreria di RNAi lentivirale con array con diversi regolatori di proteine associate sì (YAP) e co-attivatore trascrizionale con motivo legante PD , due co-attivatori trascrizionali che sono gli effetti a valle del percorso di Ippona. Tuttavia, questo approccio potrebbe essere modificato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione o co-fattore e potrebbe anche essere utilizzato per lo screening delle librerie CRISPR/CAS9, cDNA o ORF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo scopo di questo saggio è quello di utilizzare librerie virali per identificare i regolatori di fattori di trascrizione in modo relativamente rapido e poco costoso. L'attività trascrizionale aberrante è associata al cancro e alla metastasi1,2,3,4,5,6, quindi prendere di mira i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali è un promettente approccio terapeutico. Tuttavia, i fattori di trascrizione sono spesso difficili da indirizzare farmacologicamente7 e molti sono necessari per la normale funzione cellulare nei tessuti adulti8,9,10. Puntare sulle vie associate al cancro che attivano aberrante i fattori di trascrizione per guidare la malattia è un approccio più fattibile con il potenziale di avere effetti collaterali meno gravi. La disponibilità commerciale di librerie di RNAi lentivirali e retrovirali con matrice, CRISPR/CAS9, cDNA o ORF consente ai ricercatori di testare l'importanza di numerosi geni in un singolo esperimento. Tuttavia, è necessaria una lettura affidabile per l'attività trascrizionale alterata.

Qui, descriviamo l'uso di un saggio di saggio di prosaggio di un giornalista trascrizionale a doppia luciferasi e di librerie lentivirali di matrice per identificare le proteine che regolano i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. In questo saggio, gli shRNA che colpiscono i geni associati al cancro vengono consegnati alle cellule tumorali dei mammiferi tramite la trasduzione lentivirale e le cellule vengono selezionati per un'integrazione stabile utilizzando la micina. Le cellule vengono successivamente trascate con un costrutto reporter che esprime luciferasi di lucciole guidate da un promotore specifico per il fattore di trascrizione che viene studiato e un costrutto di controllo che esprime Renilla luciferasi da un promotore di vulcaniamente attivo che non risponde al fattore di trascrizione in fase di studio. Dimostriamo questo approccio con uno schermo proof-of-concept per i regolatori di YAP e TA, gli eftrattieri critici a valle del percorso Hippo8,10,11. L'attività anomala di YAP e TAz promuove diversi passaggi della cascata metastatica11 ed è osservata in molti tumori11,12,13. Tuttavia, il modo in cui YAP e TAa diventano attivati aberrantemente in alcune cellule tumorali non è ancora completamente compreso. YAP e TAA non legano il DNA, ma vengono reclutati per promuovere da altri fattori di trascrizione. I membri della famiglia di fattori di trascrizione del dominio TEA (TEAD) sono i principali partner di associazione per YAP e TAA e sono fondamentali per la maggior parte delle funzioni dipendenti da YAP e TAz. Il nostro costrutto reporter esprime luciferasi di lucciole da parte di un promotore yAP/TAz-TEAD-responsive e studi precedenti hanno dimostrato che rileva fedelmente i cambiamenti nell'attività trascrizionale YAP-TEAD2,14,15.

Il nostro approccio è rapido, medio-velocità, e non richiede strutture di screening, robot automatizzati, o sequenziamento profondo di librerie in pool. I costi sono relativamente bassi e ci sono numerose librerie disponibili in commercio tra cui scegliere. Le attrezzature e i reagenti necessari sono relativamente standard nella maggior parte dei laboratori. Può essere utilizzato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione se un reporter basato su luciferate esiste o viene generato. Usiamo questo approccio per vagliare gli shRNA nelle cellule tumorali, ma qualsiasi linea cellulare che può essere trasfetata con una ragionevole efficienza potrebbe essere utilizzata con qualsiasi tipo di libreria in serie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: un riepilogo schematico di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione della libreria vettoriale lentivirale

NOTA: lo schermo dimostrato ha utilizzato una libreria di shRNA disposti acquistati come scorte di glicerolo in piastre di 96 pozze, ma le librerie possono anche essere assemblate manualmente sulla base di un elenco di candidati. Controlli appropriati devono essere considerati e inclusi in qualsiasi libreria. Ciò include uno shRNA di controllo non targeting (shNTC), uno shRNA di controllo che colpisce il fattore di trascrizione in fase di studio e, se possibile, una lucifera lelina mirata a shRNA.

  1. Aggiungere 1,3 mL di Luria Broth (LB) (1% bacpton bacpton, 0,5% di estratto di lievito, 1% NaCl, pH 7,5) contenente 100 g/mL di anchilina a ciascun pozzo di una piastra di pozzo profondo 96. Inoculare ogni pozzo con 2 oltere di lesicerolo e crescere a 37 gradi durante la notte con agitazione costante a 225 giri/min.
  2. Trasferire ogni coltura batterica in un tubo centrifuga di 1,5 ml e pellet i batteri per centrifugazione a 21.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min.
  3. Purificare ogni vettore utilizzando un mini-prekit kit batterico seguendo il protocollo del produttore.
  4. Determinare la concentrazione di ogni vettore utilizzando uno spettrofotometro.
  5. Conservare i plasmidi a -20 gradi centigradi.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Imballaggio della biblioteca lentivirale in serie

NOTA: Tutti i lavori che coinvolgono il lentivirus, tra cui imballaggi, infezioni e successive colture di cellule infette, devono seguire rigorosamente le norme e i regolamenti istituzionali in materia di biosicurezza.

  1. Espandere le celle 293FT utilizzando supporti a crescita completa (il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4 mM L-glutamine, 4.500 mg/L di glucosio e pirevate di sodio, integrati con 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 unità/mL di penicillina, 100 streptomici e 2 mM di siero-glutamina lmutuale).
  2. Per ogni vettore nella libreria dal passaggio 1.4, eseguire il seeding di un 24-po 'con 1 x 105 293FT celle.
    NOTA: Si raccomanda di confezionare alcuni pozzi aggiuntivi di un vettore virale di controllo per testare il tipero del virus prima di procedere al passaggio 3 (vedi sotto).
  3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.
    NOTA: Un protocollo generale per l'imballaggio del lentivirus descritto in precedenza14 è stato scalato a 24 pozzi per questo protocollo. Utilizza psPAX2 per l'imballaggio lentivirale e VSVG come proteina del cappotto. Se si desidera il virus ectropico, un vettore che fornisce Eco può essere utilizzato al posto di VSVG. Si raccomanda vivamente che questo protocollo è ottimizzato per ottenere un titer virale che dà tra 30%-70% efficienza infezione delle cellule bersaglio (vedi Discussione). Vedere la Tabella supplementare 1 per un elenco di tutti i vettori utilizzati.
  4. Impostare una miscela di trasfezione per ogni vettore virale dal passaggio 1.4 come descritto di seguito. Ogni trasfezione deve contenere 250 ng del vettore virale, 125 ng di psPAX2, 125 ng di VSVG, 1,25 l di reagente di trasfezione 1 e 23,75 l di buffer di trasfezione (vedi Tabella dei materiali).
    1. Diluire ogni vettore lentivirale a 50 ng/L con acqua priva di nuclenonsi, quindi trasferire 5 (250 ng) in un pozzo di una piastra PCR di 96 pozze.
    2. Fare in modo che la super miscela di trasfezione si munti di 1,25 x di reagente di trasfezione 1 e 23,75 X del buffer di trasfezione preriscaldato, dove "X" è il numero totale di trasfettanti più diversi in più per tenere conto della perdita di volume durante la pipettaggio.
    3. Incubare la super miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Aggiungere 125 ng X di psPAX2 e 125 ng - X di VSVG al tubo di trasfezione super mix da Passo 2.4.3 e pipet delicatamente su e giù per mescolare. Procedere rapidamente al passaggio 2.4.5.
    5. Immediatamente aliquota la miscela dalla fase 2.4.4 in ogni tubo di una striscia PCR, quindi utilizzare pipetta multicanale per trasferire 25 : la miscela in ogni pozzo contenente vettore virale dalla fase 2.4.1.
    6. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
    7. Trasferire tutti i 30 gradi da ogni 96-po da Passo 2.4.6 in un pozzo del 24-pozzo contenente 293 celle FT dal Passo 2.3.
  5. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per 24 h e quindi sostituire i supporti in ogni pozzo della piastra di 24 pozze con 500 gradi di supporti di crescita completa. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per altri 24 h.
  6. Utilizzando una pipetta multicanale, raccogliere il supernatante virale da ogni pozzo e 220 L (abbastanza per 1 infezione aliquota nel Passo 3 più qualche volume extra) in due 96-pozzi ciascuno. Queste sono le placche supernatali virali schierate.
  7. Conservare le placche supernate virali in serie a -80 gradi centigradi.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Si consiglia inoltre di testare alcuni dei virus di controllo supplementare che è stato confezionato (vedi sopra) sulle cellule da infettare prima di procedere al passo 3. Questo per garantire che il titolo sia sufficiente per ottenere almeno il 30% di efficienza dell'infezione.

3. Infezione delle cellule per lo schermo

NOTA: Le cellule del melanoma umano (A375) sono state utilizzate per dimostrare questo approccio, ma questo metodo può essere applicato a tutte le cellule aderenti che infettano con lentivirus. Tuttavia, la coltura cellulare e le condizioni di placcatura devono essere ottimizzate per ogni riga di cella (vedere Discussione).

  1. Espandere le cellule per essere infettati in mezzi di crescita completa.
  2. Seme 24-bene piastre con 1 x 105 celle in 0,5 ml di supporti di crescita completa per bene. Seme uno bene per ogni vettore virale da testare (compresi i controlli) e includere un pozzo extra che non sarà infettato che servirà come un controllo per la selezione di droga nel Passo 3.7.
  3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.
  4. Infettare ogni bene dalla Fase 3.2 con un supernatante virale diverso dal supernatante lentivirale congelato array come segue.
    1. Preparare un supporto di crescita completo che contenga 20 g/mL di polibrene.
    2. Scongelare i supernatani della biblioteca lentivirale dalla fase 2.7 alla temperatura ambiente.
    3. Aspirare i mezzi di crescita dalle lastre di 24 pozzetti della Fase 3.2 e aggiungere immediatamente 200 l di supporti di crescita contenenti polibrene ad ogni pozzo.
    4. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 200 l di supernatante virale da ogni 96-po dal passo 3.4.2 ai 24 pozzi dal Passo 3.4.3.
  5. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 - 48 h.
    NOTA: Alcune linee cellulari possono richiedere più di 24 h per esprimere gli shRNA e diventare resistenti alla panina. Il vettore virale qui utilizzato fornisce un Turbo-GFP-IRES-puro-puror con uno shRNA a base di miR30 nel 3'UTR di puroR (Figura 1). L'efficienza dell'infezione e l'espressione del gene di resistenza alla puromicina e dello shRNA sono stati monitorati da proteine fluorescenti verdi.
  6. Preparare un supporto di crescita completo che contenga 2,5 g/mL di puromycina.
    NOTA: la concentrazione di selezione della puromicina varia da una cella all'altra. Si raccomanda di eseguire una curva di uccisione antibiotica per ogni linea cellulare da disattendere prima dello schermo.
  7. Aspirare i media da ogni pozzo e sostituirli con 500 - L di puromycin contenenti supporti di crescita completi.
    NOTA: Assicurarsi di aggiungere anche la puromicina a un pozzo di controllo non infetto che può essere utilizzato nei passaggi successivi per garantire che la selezione della puromicina sia completa.
  8. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 48 h.
    NOTA: È meglio selezionare per 48 h, quindi la densità di placcatura e il titer virale devono essere ottimizzati in modo che le cellule non siano sovraconfluenti prima di 48 h.
  9. Assicurarsi che le cellule infette siano verdi al microscopio fluorescente e che le cellule di un controllo non infettate siano tutte trattate con puromycinsiano siano tutte morte prima di procedere al passaggio 4.

4. Semina le cellule per la trasfezione del giornalista a doppia luciferasi

NOTA: una trasfezione di prova deve essere eseguita per determinare la densità di semina ottimale per ogni nuova linea cellulare.

  1. Orpsinizzare ogni pozzo dal passo 3.9 e trasferire circa 1 x 105 celle in pozzi nella posizione corrispondente sulla nuova piastra 24-well come segue.
    NOTA: Questo protocollo è progettato per lo screening di librerie con centinaia di shRNA, quindi non è possibile contare ogni pozzo di cellule infette. Pertanto, i passaggi seguenti sono stati utilizzati per stimare il numero di celle in ogni pozzo per contribuire a garantire una densità di placcatura approssimativamente uguale.
    1. Raggruppare i pozzi da Passo 3.9 in 3 - 4 gruppi in modo che tutti i pozzi in un gruppo hanno una densità di cellule simile.
    2. Provate bene 1 rappresentativo da ogni gruppo con 200 gradi L di trypsin-EDTA (1x PBS integrati con 0,5 mM EDTA e 0,1% di prova) per 5 min a 37 . Quindi neutralizzare la trypsin-EDTA aggiungendo 400 l di puromycina contenente supporti di crescita completa.
    3. Contare bene ogni rappresentante per determinare il numero totale di celle e diluire la sospensione cellulare da ogni rappresentante a 2 x 105 celle/mL dell'utilizzo di supporti di crescita completi.
    4. Seme 0,5 mL (1 x 105 celle) di ciascuno bene dalla fase 4.1.3 nella posizione corrispondente su una nuova piastra di 24 pozze e incubare questa nuova piastra di 24 pozze a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per 24 h.
    5. Per ogni gruppo dal passaggio 4.1.1, utilizzare il numero di cella totale determinato nel passaggio 4.1.3 per calcolare il volume di trypsin-EDTA da aggiungere a ogni pozzo in modo che la sospensione delle celle risultante sia 1 x 106 celle / mL.
    6. Aggiungere il volume appropriato di trypsin-EDTA ad ogni pozzo e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi.
      NOTA: Per lo schermo più grande si consiglia di provare e riaffiorare le piastre a 24 pozzetti in gruppi piuttosto che tutte in una volta per garantire la vitalità delle cellule.
    7. Durante l'incubazione di cui sopra, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 400 l di mezzi di crescita completa contenenti puromicina ai pozzi corrispondenti su una nuova piastra di 24 pozzetti.
    8. Trasferire 100 l di sospensione cellulare (circa 1 x 105 celle) da ogni pozzo alla posizione corrispondente sulle nuove piastre da 24 pozze preparate nel passo 4.1.7.
    9. Ripetere i passaggi da 4.1.6 a 4.1.8 per tutte le piastre di pozze raggruppate dal passaggio 4.1.1, una piastra alla volta.
  2. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.

5. Trasfezione del giornalista a doppia luciferalità

  1. Transfect ogni bene dal Passo 4.2 con il reporter dual-luciferate costruisce come segue.
    NOTA: La quantità totale di DNA e il rapporto ottimale di vettore reporter luciferasi lucciole al controllo Renilla luciferase vettore deve essere determinato prima di iniziare questo saggio. Qui, 400 ng di una miscela di DNA che contiene 20 parti firefly luciferasi reporter e 1 parte di controllo Renilla luciferase è stato utilizzato.
    1. Effettuare la miscela di diluizione di trasfezione (Tube A) e la miscela di diluizione del reporter (Tube B) mescolando i volumi indicati di ciascun reagente (Tabella 1) moltiplicato per il numero totale di trafetti (più diversi extra).
      NOTA: questo protocollo è ottimizzato per il reagente 2 (vedere Tabella dei materiali). Se viene utilizzato un reagente di trasfezione diverso, la trasfezione deve essere ottimizzata prima di questo passaggio.
    2. Mescolare la miscela di diluizione di trasfezione (Tube A) con la miscela di diluizione del reporter (Tube B) e incubare a temperatura ambiente per 15 min per produrre la miscela di trasfezione.
    3. Durante l'incubazione di cui sopra, sciacquare ogni 24-po dal Passo 4.2 con 0.25 mL di salina buffer fosfato (PBS), e aggiungere 447 L di supporti di crescita completa ad ogni pozzo.
    4. Dopo l'incubazione di 15 minuti, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 53 ll di miscela di trasfezione in ogni pozzetto delle piastre di 24 pozze.
  2. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.

6. Quantificazione dell'attività a doppia luciferalità

  1. Misurare l'attività luciferasi utilizzando un lettore di lamiere e un kit di prova reporter a doppia luciferalasi come descritto di seguito.
    NOTA: questo protocollo è ottimizzato per il kit di analisi reporter indicato (vedere Tabella dei materiali) e segue il protocollo consigliato dal produttore.
    1. Preparare abbastanza 1x buffer di lisi passiva per tutti i pozzi più diversi extra (75 è necessario per bene) diluindo 5x buffer di lisi passiva (fornito in kit) 1 a 5 con acqua deionizzata. Anche scongelare il reagente A e il buffer B del reagente (fornito nel kit, per ogni pozzo è necessario 100 l di ciascuno).
    2. Aspirare il supporto da ogni pozzo della piastra 24-po' dal Passo 5.2.
    3. Aggiungere 75 luna di 1x tampone di lisi passiva ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per 30 min con occasionalmente agitazione.
    4. Preparare il reagente B diluindo il substrato 50x reagente B (fornito in kit) 1:50 con buffer reagente B scongelato.
    5. Aggiungere 30 l di 1x buffer di lisi passiva a 4 pozze per lo svuotamento (vedere la tabella supplementare 2).
    6. Trasferire 30 luna di lispetto dalla fase 6.1.3 in pozze duplicate di una piastra di analisi bianca inferiore piatta 96-well.
    7. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 -L di reagente A ad ogni pozzo e leggere il segnale luciferasi lucciola con un lettore di piastre.
    8. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 -L di reagente B da Passo 6.1.4 a ogni pozzo e leggere il segnale Di Renilla luciferaree con un lettore di piastre.
  2. Elaborare i dati non elaborati come segue (per una descrizione dettagliata, vedere la tabella supplementare 2).
    1. Escludere i campioni con un segnale molto basso di Renilla luciferate come valori bassi indicano che il costrutto virale era tossico o che troppo poche cellule trasfette sono state valutate.
      NOTA: Come spiegato nella discussione, il segnale di Renilla luciferase significativamente "basso" può portare a risultati anomali. Qui sono stati esclusi i pozzi in cui il segnale di Renilla luciferate era superiore a 1 deviazione standard al di sotto della media (cfr. tabella supplementare 2). Questo si basava su studi precedenti eseguiti utilizzando questo sistema di reporter in queste cellule14, ma può differire in altre linee cellulari.
    2. Normalizzare il valore di luciferasi lucciola cruda di ogni pozzo per il valore crudo Renilla luciferase dello stesso pozzo per ottenere il rapportoluccio/Renilla.
    3. Calcolare laRenilla media dei rapporti lucciola/Renilla di tutti i pozzi di controllo di replica e quindi dividere bene il rapporto lucciola/Renilla di ogni altro con quel numero per ottenere un cambio di piega.Renilla
    4. Assegnare il campione di controlloRenilla e impostare il suo valore del rapporto lucciola/Renilla a 1.
    5. Calcolare laRenilla media dei rapporti lucciola/Renilla dei pozzi duplicati e tracciare con la deviazione standard.
      NOTA: La deviazione standard non viene utilizzata per l'analisi statistica, ma come mezzo per identificare i pozzi in cui le repliche differiscono in modo significativo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il nostro costrutto reporter YAP/TAz-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contiene un promotore SV-49 minimo con 5 ripetizioni dell'elemento di legame TEAD canonico (MCAT)15 che guida il gene luciferasi della lucciola ( Figura1). È co-transfettato in cellule insieme al vettore di controllo PRL-TK (Promega), che esprime Renilla luciferate...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, dimostriamo un approccio per lo screening a medio velocità delle librerie virali di serie in combinazione con un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi che può essere utilizzato per identificare e testare nuovi regolatori di fattori di trascrizione. È fondamentale caratterizzare e ottimizzare il sistema di reporter per ogni riga di cella prima di qualsiasi schermata. Gli esperimenti dovrebbero essere fatti per confermare che il reporter risponde all'attività alterata del fattore di trascr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross per aver assistito nella preparazione dei vettori shRNA. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una Susan G. Komen Career Catalyst Grant che ha assegnato a J.M.L. (#CCR17477184).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastra in polipropilene a 96 pozzetti da 2,0 mlUSA Scientific1896-2000Per mini-prep batterica
Tripsina - 2,50%Gibco15090-046Componente della piastra per
saggio bianca a fondo piatto a 96 pozzettiCorning3922Per il test a doppia luciferasi
Ampicillina - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EAPer mini-prep batterica
Bacto-triptone - polvereSigma-Aldrich95039Componente del sistema di
analisi del reporter a doppia luciferasi del brodo LB, che include il reagente LAR II (reagente A), Stop & Glo (substrato del reagente B) e Stop & Tampone Glo (tampone reagente B) - KitPromegaE1960Per il dosaggio della doppia luciferasi
salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio, magnesio e rosso fenolo - 9,6 g/LHimediaTS1006Per PBS
EDTA - 0,5 MVWR97061-406Componente della tripsina-EDTA
Etanolo - 100%Pharmco-AAPER111000200Per mini-prep fetale batterico
Siero bovino - 100%VWR97068-085Componente del terreno di crescita completo
Bromuro di esadimetrina (polibrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268Per l'infezione virale
HyClone DMEM/Alto glucosio - 4 mM L-glutammina; 4500 mg/L di glucosio; piruvato di sodioGE Healthcare life sciencesSH30243.01Componente del terreno di crescita completo
I3-P/i3 Micropiastra multimodale/EADispositivi molecolariPer il dosaggio della doppia luciferasi
BDHBDH9286Componente del brodo LB
NanoDrop One Spettrofotometro UV-Vis a microvolumeThermo scientificPer misurare la concentrazione di DNA vettoriale
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%Gibco31985-062Per trasfezioni
Penicillina Streptomicina - 10.000 Unità/ml (Penicillina); 10.000 µ g/ml (Streptomicina)Gibco15140-122Componente del terreno di coltura completo
Kit Miniprep Plasmidico Rapido PureLink - KitThermo Fisher ScientificK210010Per mini-prep batterico
Puromicina - 2,5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255Per la selezione degli antibiotici dopo l'infezione
Contatore cellulare automatizzato TC20Bio-RadPer la conta cellulare
Reagente per trasfezione del DNA X-tremeGENE 9 (Reagente per trasfezione 1) - 100%Roche6365787001Per il confezionamento di virus
Estratto di lievito - polvereVWRJ850Componente del brodo LB
P3000 (Reagente per trasfezione 3) - 100%Life technologiesL3000008Per trasfezioni
Soluzione L-glutammina - 200 mM Gibco 25030-081 Componente del terreno di crescita completo Lipofectamina 3000 (Reagente di trasfezione 2) - 100%Life technologies L3000008 Per le trasfezioni Biologia molecolare Acqua - 100%VWR 02-0201-0500 Per la diluizione del vettore shRNA per il confezionamento di virus NaCl - polvere

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519(2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269(2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976(2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcription Factor RegulatorsMedium Throughput ScreeningArrayed Lentiviral LibrariesDual Luciferase ReporterYAP TAZ RegulationHippo Pathway ScreeningRNAi Library ScreeningViral Vector ProductionLuciferase Activity AssayPuromycin Selection

Related Articles