Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Summary

L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.

Abstract

Lo sviluppo del sistema nervoso dei vertebrati richiede una coordinazione precisa dei comportamenti cellulari complessi e delle interazioni. L'uso di tecniche di imaging in vivo ad alta risoluzione può fornire una chiara finestra in questi processi nell'organismo vivente. Ad esempio, la divisione delle cellule e la loro progenie può essere seguita in tempo reale man mano che il sistema nervoso si forma. Negli ultimi anni, i progressi tecnici nelle tecniche multicolore hanno ampliato i tipi di domande che possono essere studiate. L'approccio multicolore Brainbow può essere utilizzato non solo per distinguere tra come le cellule, ma anche per codificare a colori più cloni diversi di cellule correlate che derivano ciascuna da una cellula progenitrice. Ciò consente un'analisi di lignaggio multiplex di molti cloni diversi e dei relativi comportamenti contemporaneamente durante lo sviluppo. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo. Ciò è particolarmente utile per seguire le interazioni cellulari tra le cellule simili, che sono difficili da etichettare in modo differenziale utilizzando i colori tradizionali guidati dal promotore. Il nostro approccio può essere utilizzato per tracciare contemporaneamente le relazioni di lignaggio tra più cloni diversi. I grandi set di dati generati utilizzando questa tecnica forniscono informazioni dettagliate che possono essere confrontate quantitativamente tra manipolazioni genetiche o farmacologiche. In definitiva, i risultati generati possono aiutare a rispondere a domande sistematiche su come si sviluppa il sistema nervoso.

Introduction

Nelle prime fasi di sviluppo, i pool di cellule progenitrici specializzate si dividono ripetutamente in zone proliferanti, producendo diverse matrici di cellule figlie. Le cellule nate durante questo periodo di sviluppo si differenziano e viaggiano per formare gli organi nascenti. Nel sistema nervoso, progenitori come la glia radiale danno origine a neuroni immaturi in zone ventricolari. Come i neuroni migrano lontano dai ventricoli e matura, il tessuto in espansione alla fine forma le strutture altamente complesse del cervello^{1,2,3,4,<....}

Protocol

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Lewis & Clark College.

1. Microiniezione di embrioni di pesce zebra

1. Impostare il tipo selvaggio, pesce zebra adulto in serbatoi di accoppiamento segregati dal sesso il pomeriggio prima di eseguire microiniezioni^39,40.
2. Preparare la soluzione del DNA la mattina delle microiniezioni. Diluire hsp:DNA plasmide di zebre^{bow 11} a una concentrazione di 10 ng/L in KCl da 0,1 mm, insieme al 2,5% di fenolo rosso e a ....

Results

Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti utilizzando l'approccio di imaging time-lapse multicolore in vivo descritto qui. Mostriamo che Brainbow cloni codificati a colori di cellule nella zona ventricolare proliferale del pesce zebra in via di sviluppo cervello posteriore¹⁴ (Figura 1).

In genere, quando le celle etichettate brainbow erano disposte lungo una particolare fibra radiale, condividevano lo stesso co.......

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare i cloni delle cellule progenitrici e neuroni nel cervello posteriore del pesce zebra in via di sviluppo e seguirli in vivo utilizzando Brainbow e microscopia confocale time-lapse¹¹. Il principale vantaggio di questo protocollo rispetto agli studi in vitro o ex vivo è la capacità di osservare direttamente la zona proliferale del cervello vertebrato nel suo ambiente naturale nel tempo. Questa tecnica si basa su studi precedenti che hanno etichett.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipetta di trasferimento da 1,5 mL (punta fine)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-fenil-2-tiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Diluito a 0,2 mM in E3 per prevenire la pigmentazione dell'embrione
Provette coniche da 50 mL	Corning	352070	Per embrioni con shock termico Lenza
pesca in nylon da 6 libbre	SecureLine	NMT250	Per la realizzazione di manipolatori di embrioni
Pipetta di trasferimento da 7,5 mL	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	Per E3
Cotton Swabs	Puritan	867-WC NO GLUE	Per fare manipolatori di embrioni
Cre ricombinasi	New England Biolabs	M0298M
Bagno secco digitale	Genemate	490016-616	Utilizzato per conservare LMA a 42 ° C
Ambito di dissezione per epifluorescenza Tubi
capillari in vetro	World Precision Instruments	TW100F-4
Incubatore	Forma Scientific	3158	Per mantenere gli embrioni a 28 gradi C
Stampi per piastre di iniezione	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp bagnomaria	Fisher	Scientific 2320	Per embrioni con shock termico
KCl	AMRESCO	0395	Per E3 e per soluzione di DNA per iniezioni Microscopio
confocale a scansione laser	Zeiss	LSM710
LE agarosio	Genemate	E3120	Per creare piastre di iniezione di agarosio agarosio
a basso punto di fusione (LMA)	AMRESCO	J234
Serbatoi di accoppiamento	Aquaneering, Inc.
blu di metilene	Sigma	M9140	per E3
MgSO4	Sigma	9397	per E3
Micromanipolatore	World Precision Instruments	M3301
Estrattore per micropipette	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaina-S	Western Chemical, Inc.		Stock prodotto a 4 mg/mL in acqua di osmosi inversa (RO), quindi aggiunto goccia a goccia a E3 fino alla concentrazione finale di 0,2 mM per anestetizzare gli embrioni
NaCl	J.T. Baker	4058-01	Per
piastre di Petri E3 (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	Per alloggiare gli embrioni e creare una camera di imaging (60 mm)
Rosso fenolo	Sigma	P0290
Marcatori	ad anello per punti morbidiTrifoglio Needlecraft, Inc.	354	Per la creazione di camere di imaging con piastra di Petri
Super colla (Ultra gel control)	Loctite	1363589	Per la realizzazione di manipolatori di embrioni
Aghi per siringhe	Beckton Dickinson	BD329412	Per la dechorionizzazione di embrioni