Method Article

Test di emocompatibilità degli impianti che si contattono con il sangue in un modello di flusso a ciclo continuo che imita il flusso sanguigno umano

DOI:

10.3791/60610

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March 5th, 2020

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1Department of Thoracic, Cardiac and Vascular Surgery, University Hospital Tuebingen, 2Acandis GmbH, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Stuttgart, 4Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic

In This Article

Summary

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Questo protocollo descrive una valutazione completa dell'emocompatibilità dei dispositivi di contatto con il sangue utilizzando impianti neurovascolari tagliati al laser. Un modello di ciclo di flusso con sangue umano fresco ed eparinizzato viene applicato per imitare il flusso sanguigno. Dopo la perfusione, vari marcatori ematologici vengono analizzati e confrontati con i valori ottenuti direttamente dopo la raccolta del sangue per la valutazione dell'emocompatibilità dei dispositivi testati.

Abstract

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L'uso crescente di dispositivi medici (ad esempio, innesti vascolari, stent e cateteri cardiaci) per scopi temporanei o permanenti che rimangono nel sistema circolatorio del corpo richiede un approccio affidabile e multiparametrico che valuti le possibili complicanze ematologiche causate da questi dispositivi (cioè, attivazione e distruzione di componenti ematici). Il primo passo verso un'implementazione in vivo di successo è il test completo di emocompatibilità in vitro degli impianti a contatto con il sangue. Pertanto, un'analisi approfondita secondo l'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione 10993-4 (ISO 10993-4) è obbligatoria prima dell'applicazione clinica. Il ciclo di flusso presentato descrive un modello sensibile per analizzare le prestazioni emostatiche degli stent (in questo caso, neurovascolare) e rivelare effetti negativi. L'uso di sangue fresco umano intero e di un leggero prelievo di sangue sono essenziali per evitare la preattivazione del sangue. Il sangue viene perfuso attraverso un tubo eparano contenente il campione di prova utilizzando una pompa peristaltica ad una velocità di 150 mL/min a 37 gradi centigradi per 60 min. Prima e dopo la perfusione, i marcatori ematologici (ad es. numero di cellule del sangue, emoglobulina, ematocrito e marcatori plasmatici) che indicano l'attivazione di leucociti (poliomorfonucleari [PMN]-elastassi), piastrine (tromrusbotina z -TG]), il sistema di coagulazione (thombin-antithrombin iii [TAT]), e la cascata superiore (SC5b-9) sono analizzati. In conclusione, presentiamo un modello essenziale e affidabile per test di emocompatibilità estesa di stent e altri dispositivi di contatto con il sangue prima dell'applicazione clinica.

Introduction

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L'applicazione in vivo di impianti e biomateriali, che interagiscono con il sangue umano, richiede intensi test preclinici incentrati sullo studio di vari marcatori del sistema emostatico. L'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione 10993-4 (ISO 10993-4) specifica i principi centrali per la valutazione dei dispositivi di contatto con il sangue (cioè stent e innesti vascolari) e considera la progettazione del dispositivo, l'utilità clinica e i materiali necessari1.

Il sangue umano è un fluido che contiene varie proteine e cellule plasmatiche, tra cui leucociti (globuli bianchi [WBC]), eritrociti (globuli ....

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Protocol

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La procedura di campionamento del sangue è stata approvata dal Comitato Etico della facoltà di medicina dell'Università di Tuebingen (codice di identificazione del progetto: 270/2010BO1). Tutti i soggetti hanno fornito il consenso scritto e informato per l'inclusione prima della partecipazione.

1. Preparazione delle Monovette caricate da Eparina

  1. Mescolare l'eparina non diluita (5.000 IU/mL) con cloruro di sodio (NaCl, 0,9%) soluzione e preparare una soluzione con una concentrazione di 15 IU/mL di eparina.
  2. Aggiungere 900 l della soluzione di eparina diluita a ciascuna monovette neutra (9 mL) per ottenere una concentrazion....

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Results

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Brevemente riassunto, il sangue umano intero è stato raccolto in monovette caricate in eparina poi raggruppate e utilizzate per valutare i livelli di base dei conteggi cellulari e dei marcatori di emocompatibilità plasmatica.

Successivamente, il tubo contenente i campioni di impianto neurovascolare è stato riempito, e il sangue è stato perfuso per 60 min a 150 mL/min e 37 gradi centigradi utilizzando una pompa peristaltica. Anche in questo caso, il numero di cellule è stato analizzato in tutti.......

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Discussion

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Il protocollo presentato descrive un metodo completo e affidabile per il test di emocompatibilità degli impianti a contatto con il sangue in conformità con ISO 10993-4 in un modello di flusso di taglio che imita il flusso sanguigno umano. Questo studio si basa sul test di impianti neurovascolari tagliati al laser, ma può essere eseguito con una varietà di campioni. I risultati dimostrano che questo metodo consente l'analisi ampia di vari parametri come il numero di cellule del sangue, la prevalenza di diversi marcatori d.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Per l'esecuzione della microscopia elettronica a scansione, ringraziamo Ernst Schweizer della sezione di Medical Materials Science and Technology dell'University Hospital Tuebingen. La ricerca è stata sostenuta dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport del CR nell'ambito del Programma Nazionale di Sostenibilità II (Progetto BIOCEV-FAR LQ1604) e dal progetto della Fondazione scientifica ceca n. 18-01163S.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
aqua ad iniectabiliaFresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germania1088813
beta-TG ELISADiagnostica Stago, Duesseldorf, Germania00950
Centrifuga Rotana 460 RAndreas Hettich, Tuttlingen,Germania-Citrat
monovette (1.4 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Germania6,16,68,001
monovette CTAD (2,7 mL)BD Biosciences, Heidelberg, Germania367562
monovette EDTA (1,2 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Germania6,16,62,001
Etanolo p.A. (1000 mL)AppliChem, Darmstadt, Germania1,31,08,61,611
Glutaraldeide (25 % in acqua)SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germania23114.01
Rivestimento in eparina per provetteEnsion, Pittsburgh,
(25.000 IE/ 5 mL)LEO Pharma, Neu-Isenburg, GermaniaPZN 15261203
Lettore multipiastra Mithras LB 940Berthold, Bad Wildbad,Germania-NaCl
0,9%Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germania1312813
Monovette neutre (9 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Germania2,10,63,001
tampone PBS (senza Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania70011044
Pompa peristaltica ISM444BCole Parmer, Wertheim, Germania3475
Pipetta (100 &; L)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germania3124000075
Pipetta (1000 &; micro; L)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germania3123000063
Contenitore in plastica (100 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Germania7,55,62,300
PMN-Elastase ELISADemeditec Diagnostics, Kiel GermaniaDEH3311
Provetta di cloruro di polivinileSaint-Gobain Performance Plastics Inc., CourbevoieFrance-Reaction
Tubes (1.5 mL)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germania30123328
impianti neurovascolari tagliati al laserAcandis GmbH, Pforzheim01-0011x
SC5b-9 ELISATECOmedical, Buende, GermaniaA029
Microscopio elettronico a scansioneCambridge Instruments, Cambridge, Regno Unito-Nastro
sigillante (piastra a 96 pozzetti)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germania15036
Siringa 10/12 mL Norm-JectHenke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germania10080010
TAT micro kitSiemens Healthcare, Marburgo, GermaniaOWMG15
Bagnomaria Tipo 1083Gesellschaft fü r Labortechnik, Burgwedel, Germania-
USA-Heparin-Natrium

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
  2. Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99(2018).
  3. Li, Y., Boraschi, D.

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Hemocompatibility TestingBlood Contacting ImplantsFlow Loop ModelISO 10993 4Stent EvaluationWhole Blood PerfusionPlatelet ActivationCoagulation AnalysisComplement ActivationScanning Electron Microscopy

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