Elettrochemioterapia negli sferoidi del melanoma oculare 3D utilizzando un elettrodo personalizzato

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per lo sviluppo di sferoidi di melanoma congiuntivale e uveale 3D e l'uso di elettrodi personalizzati portatili per l'elettrochemioterapia in vitro di sferoidi 3D in un pozzetto di coltura. Ciò offre nuove prospettive nell'uso dell'elettrochemioterapia nel trattamento del melanoma oculare.

Abstract

L'elettrochemioterapia (ECT) è la combinazione della formazione transitoria di pori dopo l'applicazione di impulsi elettrici con la somministrazione di farmaci citotossici, che migliora l'effetto citotossico dell'agente applicato a causa dei cambiamenti della membrana. I sistemi di coltura 3D in vitro simulano la crescita tumorale in vivo e preservano le caratteristiche biologiche dei tumori in modo più accurato rispetto alle colture cellulari monostrato convenzionali. Descriviamo un protocollo per lo sviluppo di organoidi tumorali 3D utilizzando linee cellulari di melanoma congiuntivale (CM) e melanoma uveale (UM), nonché l'uso di elettrodi portatili personalizzati, adatti per l'ECT in vitro nel pozzetto di coltura senza distruzione dell'ambiente tumorale. Questo protocollo analizza la coltura e la crescita di sferoidi 3D CM e UM e la loro reazione alla sola bleomicina (2,5 μg/mL), all'elettroporazione (EP) (750 Volt/cm, 8 impulsi, 100 μs, 5 Hz) da sola e all'ECT come combinazione di EP e bleomicina. La concentrazione del farmaco e le impostazioni EP utilizzate in questo protocollo sono state stabilite come condizioni ECT preferite in base a precedenti esperimenti. Il test utilizzato per determinare la vitalità degli sferoidi è stato condotto 3-7 giorni dopo il trattamento. L'effetto sulla vitalità e sulla crescita degli sferoidi tumorali 3D è stato significativo solo dopo l'ECT. Gli elettrodi personalizzati sono descritti in dettaglio per facilitare l'applicazione degli impulsi nel pozzetto di coltura. Questo nuovo trattamento degli sferoidi 3D UM e CM rappresenta un trampolino di lancio per future applicazioni cliniche.

Introduzione

Il melanoma uveale (UM) è il tumore intraoculare primario più comune negli adulti, mentre il melanoma congiuntivale (CM) rappresenta il 2% di tutti i melanomi oculari 1,2,3,4,5,6. La brachiterapia, la radioterapia con fasci di protoni e la fototerapia sono i trattamenti di prima linea nell'um, mentre l'enucleazione del globo può essere necessaria ^1,2,3. Il trattamento della CM varia tra i centri di oncologia oculare; La biopsia escissionale seguita da chemioterapia locale e/o radioterapia è l'approccio terapeutico più frequente⁴. Nonostante il trattamento, la CM è associata a una mortalità del 25%-30%⁵.

C'è una scarsità di letteratura sulla formazione di sferoidi CM e UM e sull'applicazione dell'ECT nel melanoma oculare ^6,7,8. Gli sferoidi tumorali hanno caratteristiche biologiche migliori rispetto alle colture cellulari 2D convenzionali e sono stati proposti come strumento utile per imitare l'ambiente tumorale in vivo⁹. L'elettrochemioterapia (ECT) combina l'uso di farmaci citotossici non permeabili con l'elettroporazione (EP)¹⁰. L'EP è l'applicazione locale di impulsi elettrici brevi e intensi che permeabilizza transitoriamente le cellule per un aumento localizzato dell'assorbimento di farmaci antitumorali nelle cellule tumorali e provoca un aumento della morte cellulare¹¹. Questo studio stabilisce un protocollo che descrive lo sviluppo degli sferoidi CM e UM e indaga i risultati dopo l'ECT con bleomicina. Questo protocollo potrebbe aiutare i ricercatori nel campo dell'oncologia oculare a utilizzare altre modalità terapeutiche sugli sferoidi o studiare ulteriori effetti dell'ECT. A causa dell'uso limitato della TEC in oftalmologia, c'è poca conoscenza riguardo all'effetto e al processo di questa modalità; Pertanto, questo esperimento potrebbe ampliare lo spettro delle opzioni di trattamento in futuro. Proponiamo una nuova impostazione personalizzata dell'elettrodo a piastra portatile, che consente l'ECT dello sferoide nei pozzetti di coltura senza alcuna distruzione dell'ambiente tumorale.

Protocollo

1. Formazione di sferoidi

1. Utilizzare linee cellulari tumorali in crescita aderente per la formazione di sferoidi.
2. Fornire tutte le fasi associate alla coltura cellulare in condizioni di banco sterile.
3. Preparare il terreno di coltura completo standard come raccomandato per le linee cellulari di interesse e riscaldarlo a 37 °C utilizzando un bagnomaria.
   NOTA: In questo caso, le linee cellulari congiuntivali umane CM2005.1, CRMM1, CRMM2 e le linee cellulari di melanoma uveale 92.1, OMM1 e OMM2 sono state utilizzate e coltivate in terreno Ham F-12 contenente il 10% di siero fetale bovino e RPMI contenente il 10% di siero fetale bovino, rispettivamente.
4. Staccare le cellule di interesse utilizzando metodi standard di digestione enzimatica (ad esempio, soluzione di tripsina-EDTA).
5. Per determinare il numero di cellule vitali, risospendere 10 μL della sospensione cellulare in 10 μL di soluzione di blu di Tripano (1:1) e contare le cellule utilizzando una camera (emocitometro o un contatore di cellule automatizzato) entro 5 minuti. Le celle devono essere <90% di confluenza e in buone condizioni.
6. Per formare sferoidi, seminare 5 x 10³ cellule per pozzetto con un volume totale di 200 μL di terreno di coltura completo in piastre di attacco ultra-basse a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
   NOTA: Per un'efficace inibizione dell'attaccamento cellulare, utilizzare piastre di attacco ultra-basse con un idrogel idrofilo legato covalentemente, non ionico, caricato in modo neutro sulla superficie. Questo idrogel inibisce l'immortalizzazione delle cellule e le costringe in uno stato sospeso per costruire sferoidi 3D.
7. Controllare la formazione degli sferoidi al microscopio.
   NOTA: Alcune linee cellulari non formano sferoidi tumorali rotondi 3D nel primo passaggio. Passaggio la coltura della sfera tumorale prima che inizino a sviluppare un centro oscuro. Dissociare le masse tumorali a seconda della linea cellulare dopo 4-10 giorni mediante tripsinizzazione. Successivamente, semina le singole cellule in una nuova piastra di attacco ultra-bassa 96. Ripetendo questa procedura per diversi passaggi, le cellule si adatteranno alla coltura 3D.

2. Elettrochemioterapia degli sferoidi tumorali

1. Come controllo del saggio, utilizzare sferoidi non trattati e sferoidi trattati solo con EP o bleomicina da sola.
2. Regolare le impostazioni dell'elettroporatore (conteggio degli impulsi, frequenza degli impulsi, durata, tempo e tensione; vedere la tabella dei materiali). Per le cellule di melanoma, utilizzare 8 impulsi elettrici a onda quadra con intensità di 750 Volt/cm, durata dell'impulso di 100 μs, frequenza di ripetizione di 5 Hz.
3. Al giorno 3 della coltura sferoidale, preparare una soluzione fresca di bleomicina solfato in PBS sterile a una concentrazione di 5 μg/mL in una provetta da 15 mL.
4. Sostituire il terreno di coltura cellulare degli sferoidi rimuovendo 200 μL di terreno di coltura e riempiendolo con 100 μL di terreno di coltura completo fresco per ogni pozzetto.
5. Aggiungere 100 μL di soluzione di bleomicina solfato a ciascun pozzetto (concentrazione finale 2,5 μg/mL). Aggiungere 100 μl di terreno fresco ai controlli non trattati e agli sferoidi trattati solo con EP invece della soluzione di bleomicina solfato.
6. Eseguire l'elettroporazione.
   NOTA: Gli elettrodi mostrati nella Figura 1 sono stati prodotti nel laboratorio di ricerca dell'Università di Halle-Wittenberg. Sono realizzati in acciaio inossidabile e si adattano all'impugnatura dell'elettroportatore. Gli elettrodi sono stati progettati per l'uso in piastre di attacco ultra-basse a 96 pozzetti. Elettrodi simili in acciaio inossidabile possono essere facilmente prodotti anche per applicazioni alternative.
   1. Sterilizzare gli elettrodi con etanolo al 70% e lasciarli asciugare. Il diametro degli elettrodi è di 1 mm, lo spazio tra i due elettrodi è di 4 mm e la lunghezza di ciascun elettrodo è di 8 mm (Figura 1a).
   2. Posizionare gli elettrodi sul fondo del pozzetto, con gli sferoidi tra gli elettrodi. Ciò consente il posizionamento ideale dello sferoide tra i due elettrodi (Figura 1b).
   3. Agitare la piastra per consentire agli sferoidi di spostarsi dal fondo del pozzetto e di essere posizionati tra gli elettrodi. Lo sferoide sarà tra gli elettrodi solo per un paio di secondi.
   4. Avviare l'elettroporazione con le impostazioni preferite.
   5. Sostituire la soluzione di bleomicina solfato nel pozzetto scambiando 150 μl di terreno con 150 μl di terreno fresco.
   6. Incubare le cellule per un massimo di 10 giorni a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂. Se gli sferoidi non trattati iniziano a sviluppare un centro oscuro, terminare l'esperimento. Scambiare 150 μl di terreno di coltura cellulare ogni 2-3 giorni. In questo modo, è possibile evitare la rottura degli sferoidi posizionando il puntale della pipetta nella regione del bordo del pozzetto, inclinando la piastra e pipettando lentamente.

3. Determinazione della dimensione degli sferoidi

1. Misurare la dimensione dello sferoide il giorno del trattamento (punto di partenza) e 3-7 giorni dopo il trattamento utilizzando la microscopia a campo chiaro calcolando l'area della sezione trasversale degli sferoidi utilizzando ImageJ Fiji¹¹.
2. Scatta un'immagine dei singoli sferoidi con la barra della scala. Usa un ingrandimento attraverso il quale è visibile l'intero sferoide. Ad esempio, per CM2005.1 è stato utilizzato un ingrandimento 5x. Salva l'immagine come JPEG.
3. Analizza la dimensione dello sferoide calcolando l'area della sezione trasversale utilizzando ImageJ/Fiji.
   1. Installare il software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Avviare ImageJ/Fiji. Importa l'immagine sferoide: File > Apri.
   3. Per impostare la scala, scegli il pulsante della linea della barra degli strumenti e segna la linea della barra della scala nell'immagine con un clic del mouse: Analizza > Imposta scala. Utilizzando una distanza nota, riempire la distanza della barra della scala. Modificate l'unità di lunghezza in μm. Fare clic sul campo globale per assegnare le impostazioni a tutte le immagini con lo stesso fattore di ingrandimento.
   4. Convertire l'immagine a 8 bit: Tipo di > immagine > 8 bit.
   5. Scegliere Immagine > Regola > Soglia automatica (selezionare > Non reimpostare l'intervallo). Lo sferoide è contrassegnato in rosso o nero a seconda dell'indicatore di soglia scelto. Regolate i cursori in modo che i pixel sferoidi diventino rossi, ma i pixel non sferoidi non cambino colore. Chiudere la finestra di dialogo Soglia senza fare clic su alcun pulsante.
   6. Per calcolare l'area della sezione trasversale dello sferoide, scegliere Analizza > Imposta misure e fare clic su Area, Limita a soglia e Visualizza etichetta. Chiudere la finestra di dialogo Imposta misure facendo clic su OK.
   7. Per visualizzare i risultati, scegliere Analizza > Analizza particelle e modificare la dimensione (μm²) = 10000-infinito per rimuovere il rumore. Fare clic sul pulsante Visualizza risultati e chiudere la finestra facendo clic su OK. Nei risultati, vengono visualizzati gli sferoidi con l'etichetta e l'area. Ripetendo le analisi di più sferoidi, i risultati vengono elencati nella finestra Risultati .
   8. Per determinare la risposta relativa al trattamento degli sferoidi trattati con ECT rispetto ai controlli non trattati e trattati singolarmente, calcolare le variazioni percentuali dell'area della sezione trasversale.

4. Determinazione della vitalità degli sferoidi

1. Misurare la vitalità degli sferoidi 3-7 giorni dopo il trattamento utilizzando un test di vitalità cellulare adatto per colture cellulari 3D secondo le istruzioni del produttore. Il test deve penetrare e lisare grandi sferoidi per consentire il rilevamento della vitalità mediante quantificazione dell'ATP, che segnala la presenza di cellule metabolicamente attive.
   NOTA: In questo esperimento, è stato utilizzato un test basato sulla luminescenza come metodo di lettura. La vitalità degli sferoidi trattati con ECT è stata confrontata con i controlli sette giorni dopo il trattamento.

Risultati

Gli esperimenti sono stati condotti con elettrodi portatili personalizzati, composti da acciaio inossidabile di alta qualità. Lo spessore degli elettrodi è di 1 mm, la larghezza è di 4 mm, lo spazio tra i due elettrodi è di 4 mm e la lunghezza di ciascun elettrodo è di 8 mm (Figura 1). L'EP e la bleomicina da sole non hanno alcun effetto significativo sulla vitalità e sulla crescita degli sferoidi tumorali UM e CM. L'ECT mostra una significativa riduzione della vitalità tumorale e delle dimensioni degli sferoidi. La perdita dell'architettura sferoidale con frammenti cellulari decostruiti attorno agli sferoidi e la necrosi sulla regione centrale e periferica di tutti gli sferoidi testati sono stati osservati dopo l'ECT con bleomicina. La Figura 2 mostra i risultati delle linee cellulari CM2005.1. Le linee cellulari metastatiche di UM hanno mostrato una risposta più elevata rispetto alle linee cellulari primarie dopo ECT⁸.

Figura 1: Elettrodi portatili personalizzati. Gli elettrodi sono realizzati in acciaio inossidabile di alta qualità. L'impugnatura degli elettrodi è fornita con l'elettroporatore. Lo spessore degli elettrodi è di 1 mm, la larghezza è di 4 mm, lo spazio tra i due elettrodi è di 4 mm e la lunghezza di ciascun elettrodo è di 8 mm (a); Elettroporazione di sferoidi in un formato a 96 pozzetti (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto citotossico dell'elettrochemioterapia sugli sferoidi tumorali della linea cellulare di melanoma congiuntivale CM2005.1. L'elettrochemioterapia (ECT, 750 V/cm dopo l'applicazione di 2,5 μg/mL di bleomicina) ha causato effetti citotossici più forti negli sferoidi rispetto alla sola elettroporazione (EP) o alla chemioterapia con bleomicina (2,5 g/mL) da sola. L'effetto citotossico è stato misurato calcolando sia l'area della sezione trasversale che un test di vitalità come percentuale del controllo non trattato sette giorni dopo il trattamento. I box plot mostrano l'area media della sezione trasversale degli sferoidi (a); la vitalità media degli sferoidi (b); Immagini rappresentative di sferoidi, barra di scala = 200 μm (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'EP è utilizzato in varie applicazioni biotecnologiche e cliniche¹². Nuovi sviluppi tecnologici, come elettrodi appositamente progettati con un'elevata specificità per ogni cellula e sito bersaglio, possono aiutare il tessuto bersaglio dell'ECT in qualsiasi parte del corpo¹². Il design e la posizione degli elettrodi devono consentire la completa accessibilità del tumore e garantire che il tessuto sano sia solo minimamente interessato o non danneggiato dal trattamento¹³.

Pubblicazioni precedenti hanno mostrato l'effetto della TEC in sospensioni di cellule di melanoma umano in vitro ^7,8. La letteratura che si riferisce all'applicazione dell'ECT in modelli cellulari oculari 3D o in altri ambienti simili in vivo, consentendo un utilizzo terapeutico più sicuro, è limitata. Brun et al. postulano che le cellule 3D nello scaffold durante l'analisi morfologica abbiano una forma rotonda diversa dalla forma allungata mostrata nelle colture 2D ma estremamente simile alle cellule delle biopsie dei pazienti⁹. Il perfezionamento delle impostazioni terapeutiche e degli strumenti utilizzati nelle colture 3D può portare a un'ottimizzazione dei parametri ECT, consentendo un approccio clinico più accurato⁹.

Descriviamo uno sviluppo tecnologico riguardante nuovi elettrodi per l'applicazione dell'ECT in colture cellulari 3D. La bleomicina è l'agente citotossico più comunemente somministrato in combinazione con l'ECT¹¹. Studi precedenti del nostro gruppo hanno dimostrato che le impostazioni EP applicate (750 Volt/cm, 8 impulsi, 100 ms, 5 Hz) erano adatte per il trattamento dei tumori oculari in vitro. Le fasi critiche della tecnica includono il breve tempo necessario per eseguire l'ECT mentre lo sferoide sta affondando dopo la mobilizzazione, nonché la dimensione precisa degli elettrodi. La necessità di elettrodi personalizzati era dovuta alle difficoltà nell'eseguire l'ECT nei pozzetti con gli strumenti disponibili. I dati non pubblicati del nostro gruppo hanno mostrato un aumento del danno agli sferoidi durante il trasferimento degli sferoidi in un pozzetto più grande o in una cuvetta per prepararli al trattamento e poi di nuovo nel pozzetto di coltura. Un vantaggio della tecnica descritta è la mancanza di manipolazione degli sferoidi per eseguire il trattamento, perché gli organoidi non vengono trasferiti in piastre o pozzetti più grandi. Pertanto, tutti gli sferoidi mantengono la loro forma. Un altro vantaggio è l'uso di saggi di vitalità 3D più robusti per determinare la citotossicità dell'ECT rispetto ai saggi di vitalità standard, come il test MTT. In questo modo, tutte le cellule dello sferoide vengono lisate e sono necessari un ulteriore lavaggio delle cellule, la rimozione del terreno e più fasi di pipettaggio.

I limiti dei metodi descritti sono la breve durata di vita degli sferoidi, che influisce sulle dimensioni del tumore e sulla necrosi cellulare, come si vede al centro dell'organoide tumorale. L'alto tasso di mortalità associato sia nella CM che nella UM e le limitate opzioni terapeutiche richiedono l'arricchimento delle possibilità terapeutiche esistenti. L'ECT può offrire una modalità adiuvante per il miglioramento della qualità della vita del paziente e prolungare la sopravvivenza del paziente. Queste condizioni in vitro imitano un ambiente in vivo con maggiore precisione, offrendo risultati promettenti per ulteriori applicazioni sull'uomo. Studi futuri che utilizzano sferoidi preparati da colture primarie possono fornire risultati più rappresentativi per l'ottimizzazione delle impostazioni ECT per un trattamento mirato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bleomicina solfato	Enzo	BML-AP302-0010	10 mg
Pallone per colture cellulari 75 cm	TPP	TPP90076
Pallone per colture cellulari TC175 cm	Sarstedt	83,39,12,002	Standard con filtro
Cliniporator	IGEA	EPS01	Elettroporatore
Corning Costar Piastra a pozzetti multipli con attacco ultrabasso, 96 pozzetti, fondo	rotondoCorning	7007	96Well clear fondo rotondo, piastre di fissaggio ultra basse
EGF 1MG	Sigma-Aldrich	E4127-.1MG
F-12 K Nut Mix (1x)	Gibco	21127-022
Siero fetale bovino, sudamericano	Corning	35-079-CV	LOTTO Nr. 35079010, Reservierungsnummer: EU00478541
FKS
KGM-2	Lonza	CC-3103
PBS senza CaCl e MgCl	PromoCell	C-40232	500 ml
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ml
RPMI 1640	Gibco	11504566	modifica ATCC, HEPES, liquido, 500 ml
Tecan Infinity M Plex	Tecan
Trypsin-EDTA 1x Soluzione	Sigma-Aldrich	59430C-100ml