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Articolo metodologico

Valutazione della guarigione acuta delle ferite utilizzando l'impianto di spugna alcolica sottocutaneo dorsale e modelli di ferite cutanee della coda excisionali.

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DOI:

10.3791/60653

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25 marzo 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Brown University, 2Division of Surgical Research, Department of Surgery, Rhode Island Hospital and The Warren Alpert School of Medicine of Brown University

In questo articolo

Sommario

Qui vengono descritti due modelli di guarigione delle ferite murine, uno progettato per valutare le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina e l'altro per quantificare il tasso di chiusura della ferita. Questi metodi possono essere utilizzati con modelli di malattia complessi come il diabete per determinare i meccanismi di vari aspetti della scarsa guarigione delle ferite.

Abstract

La guarigione delle ferite è un processo complesso che richiede la progressione ordinata dell'infiammazione, la formazione del tessuto granulosa, la fibrosi e la risoluzione. I modelli Murine forniscono preziose informazioni meccanicistiche su questi processi; tuttavia, nessun singolo modello affronta completamente tutti gli aspetti della risposta di guarigione della ferita. Invece, è ideale utilizzare più modelli per affrontare i diversi aspetti della guarigione della ferita. Qui vengono descritti due diversi metodi che affrontano diversi aspetti della risposta di guarigione della ferita. Nel primo modello, le spugne di alcool polivinile sono impiantate sottocutaneamente lungo il dorsum del topo. Dopo il recupero della spugna, le cellule possono essere isolate da interruzioni meccaniche e i fluidi possono essere estratti dalla centrifugazione, consentendo così una caratterizzazione dettagliata delle risposte cellulari e citochine nell'ambiente della ferita acuta. Una limitazione di questo modello è l'incapacità di valutare il tasso di chiusura della ferita. Per questo, viene utilizzato un modello di escissione della pelle della coda. In questo modello, un pezzo rettangolare di coda da 10 mm x 3 mm viene espulso lungo la superficie dorsale, vicino alla base della coda. Questo modello può essere facilmente fotografato per l'analisi planimetrica per determinare i tassi di guarigione e può essere assolto per l'analisi istologica. Entrambi i metodi descritti possono essere utilizzati in ceppi di topi geneticamente alterati, o in combinazione con modelli di condizioni comorbide, come diabete, invecchiamento o infezione secondaria, al fine di chiarire i meccanismi di guarigione della ferita.

Introduzione

Ci sono molti sistemi modello murine disponibili per esaminare i processi di guarigione delle ferite, ognuno dei quali possiede vantaggi e limitazioni specifici1,2. I seguenti metodi presentano due modelli di ferite murine, ognuno dei quali affronta un particolare aspetto della risposta di guarigione della ferita e che può essere utilizzato per identificare la causa e l'effetto delle perturbazioni nella risposta alla lesione. Il processo di guarigione delle ferite avviene in fasi distinte. La prima fase è infiammatoria, caratterizzata dal rapido afflusso di piastrine, neutrofili e monociti/macrofagi, nonché dalla produzione di citochine infiammatorie e chemiochine. Dopo la risoluzione dell'infiammazione, l'ambiente passa a uno stato più riparativo con l'induzione di citochine profibrotiche e proangiogeniche e fattori di crescita. Il tessuto di granulazione si deposita e i neovessels si formano con la migrazione di miofibroblasti, fibroblasti, cellule epiteliali e cellule endoteliali. Nelle fasi finali, la matrice extracellulare provvisoria viene rimodellata e la formazione di cicatrici e la chiusura delle ferite procede2,3,4,5,6,7,8.

Nessun singolo modello murino fornisce un sistema per studiare tutte le fasi della guarigione delle ferite2. Qui vengono descritti due modelli chirurgici di ferita: uno chiarisce le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina acuta, e l'altro consente la valutazione della chiusura della ferita e delle analisi istologiche. Questi due metodi possono essere impiegati in modo complementare per valutare gli effetti di una perturbazione o comorbidità su diversi aspetti della risposta di guarigione della ferita. L'impianto sottocutaneo dorsale di spugne di alcool polivinile (PVA) è un sistema che è stato utilizzato nei modelli di roditori per decenni per chiarire numerosi aspetti delle risposte cellulari e granulare del tessuto9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Questo approccio consente il recupero di fluidi di ferita ricchi di citochine e infiltrati cellulari. In questo modello, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm pezzi di spugna PVA vengono posti in tasche sottocutanee attraverso un'incisione di 2 cm fatta alla linea mediana posteriore. L'incisione è chiusa con clip chirurgiche e le spugne possono essere recuperate in momenti successivi per l'isolamento cellulare e fluido. L'ambiente cellulare e citochina delle spugne isolate riflette le normali fasi di guarigione acuta della ferita fino a circa 14 giorni di postimplantation. In momenti successivi il modello è più vantaggioso per lo studio della formazione del tessuto granulosa e della risposta del corpo estraneo1. Con questo sistema, è possibile isolare >106 cellule, che offre un netto vantaggio per i saggi fenotipici e funzionali e l'isolamento dell'RNA, rispetto alle cellule isolate da altri metodi basati sulla biopsia1,22,23,25,26.26

La velocità di chiusura della ferita è determinata utilizzando il modello di escissione della pelle della coda. In questo modello, come inizialmente descritto da Falanga et al. e riportato da altri27,28,29,30, una sezione di 1 cm x 0,3 cm di spessore pieno della pelle della coda viene rimosso vicino alla base della coda. L'area della ferita è facilmente visualizzabile e può essere misurata nel tempo. In alternativa, il tessuto della coda può essere isolato per l'analisi istologica. Questo approccio può essere utilizzato come alternativa o in combinazione con il metodo ben consolidato della biopsia del pugno dorsale. Le distinzioni principali tra questi due modelli sono il tasso di chiusura della ferita, la presenza o l'assenza di pelliccia, e la struttura della pelle2,31,32. Le ferite della pelle della coda offrono un lasso di tempo più lungo in cui valutare la chiusura della ferita, in quanto ci vogliono circa 21 giorni per la chiusura completa. Questo si oppone alle biopsie di pugno dorsale non sfuse, che guariscono molto più velocemente (7-10 giorni), principalmente con la contrazione dovuta all'azione del panniculus carnosus. Le biopsie di punzone dorsali sfumate guariscono più lentamente e diminuiscono gli effetti della guarigione contrattile, ma si basano sulla presenza di un corpo estraneo per limitare i meccanismi contrattili1,2,27,30,31,33.

I modelli di ferita descritti sono informativi per comprendere i normali processi di guarigione delle ferite in assenza di perturbazione. Mentre la guarigione della pelle dei roditori differisce in modo molto significativo dalla pelle umana, tra cui la struttura allentata, la dipendenza dalla guarigione contrattile e altre differenze anatomiche, il sistema murino offre alcuni vantaggi per gli studi meccanicistici e di screening. In primo luogo è la disponibilità di ceppi inbred e mutanti genetici, trattatibilità genetica, e costi inferiori. Le intuizioni meccanicistiche acquisite dagli studi murini possono essere tradotte in modelli animali complessi che imitano più da vicino la guarigione della pelle umana, come il sistema di suini2,31.

Oltre a esaminare le risposte di guarigione della ferita nello stato stabile, questi modelli possono essere combinati con condizioni comorbide per comprendere la base dei difetti di guarigione della ferita a livello cellulare, citochine e tessuto lordo. È in questa particolare impostazione che i due modelli possono essere utilizzati in concerto per valutare gli effetti di una particolare condizione comorbida, come la polmonite postoperatoria, sia sulla risposta di guarigione della ferita cellulare acuta30.

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali qui descritti sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso istituzionale degli animali della Brown University e sono stati effettuati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali dei National Institutes of Health.  NOTA: nel video, il drappo chirurgico è stato omesso a scopo dimostrativo.

1. Impianto sottocutaneo di spugne PVA

  1. Utilizzare le forbici per tagliare fogli di spugna PVA in pezzi 8 mm x 8 mm x 4 mm. Reidratare i pezzi di spugna PVA immergendoli in sterile 1x PBS in un becher.
  2. Autoclave le spugne in 1x PBS per sterilizzare, e raffreddare completamente. Conservare le spugne autoclaved in sterile 1x PBS a 4 gradi centigradi.
  3. Prima di eseguire l'impianto chirurgico, il numero necessario di spugne in un piatto di coltura sterile in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Conservare le spugne extra in sterile 1x PBS a 4 gradi centigradi per un uso futuro. Assicurarsi che le spugne si gonfiano a 1 cm x 1 cm x 0,5 cm dopo la reidratazione. Un'immagine di spugne PVA disidratate è mostrata nella Figura 1A.
    NOTA: Per mantenere la sterilità del sito chirurgico, la procedura di impianto della spugna PVA richiede un individuo per gestire il mouse e preparare il sito chirurgico, e una seconda persona per eseguire l'impianto.
  4. Anestesizzare un topo maschio C57BL/6J da 8-12 settimane per iniezione intraperitoneale di 80 mg/kg di ketamina. Somministrare 40 mg/kg di xilazina intraperitonealmente per l'analgesia.  Confermare la profondità dell'anestesia con la perdita di un riflesso pedale. Preparare il sito chirurgico rimuovendo i capelli lungo il dorsum con i clipper. Utilizzando una garza sterile, applicare la soluzione povidone-iodino all'area di rasatura 2x, seguita dal 70% di etanolo.
  5. Posizionare il topo su tende chirurgiche sterili. Posizionare un pad riscaldato sotto le tende chirurgiche per mantenere la temperatura interna del mouse.
  6. Indossare guanti chirurgici sterili per eseguire l'intervento chirurgico. Tirare la pelle dorsale lontano dal tessuto sottostante con pinze, e utilizzando forbici chirurgiche sterili, fare un'incisione di 2 cm lungo la linea mediana dorsale circa 2 cm anteriore alla base della coda. Tenendo l'incisione aperta con pinze sterili, utilizzare sterili forbici chirurgiche curve e smussate per formare una tasca sottocutanea lungo il dorsum in una delle posizioni indicate nella Figura 1B.
  7. Continuare a usare le pinze per sollevare la pelle lontano dal tessuto sottostante. Utilizzando forbici chirurgiche sterili, spremere delicatamente una spugna PVA nel piatto di coltura per rimuovere l'eccesso di PBS. Raccogliere la spugna PVA da un angolo utilizzando forbici chirurgiche sterili e, che conduce con l'angolo tenuto dalle forbici, posizionare la spugna nella tasca sottocutanea formata nel punto 1.4.
  8. Ripetere questo processo 5x, inserendo un totale di sei spugne in tasche sottocutanee come illustrato nella Figura 1B.
  9. Avvicinare la pelle dorsale incisa con pinze sterili e chiudere l'incisione con due clip della ferita in acciaio inossidabile.
  10. Utilizzare un nuovo set di strumenti chirurgici sterili per ogni topo. In alternativa, utilizzare uno sterilizzatore di perline per sterilizzare gli strumenti tra topi.

2. Isolamento dei fluidi dalle spugne PVA

  1. Per valutare l'ambiente di citochine acuta, isolare le spugne tra 1-14 giorni di postimplantation.
  2. Preparare un tubo di raccolta fluido nidificando la canna di una siringa da 5 mL in un tubo di coltura da 16 mL.
  3. Eutanasia un topo con spugne PVA impiantate da ASfissia CO2 seguita da lussazione cervicale.
  4. Rimuovere le graffette chirurgiche e aprire l'incisione con pinze dentate. Utilizzare le forbici per estendere l'incisione lungo la linea mediana dorsale.
  5. Utilizzando le pinze, estrarre una spugna dalla sua tasca sottocutanea e trasferirla nella canna della siringa preparata, facendo attenzione a ridurre al minimo la pressione alla spugna. Disassociare qualsiasi tessuto connettivo che rimane aderente alla superficie della spugna. Utilizzare le forbici per sezionare la spugna dal tessuto circostante, se necessario. Ripetere il processo di rimozione della spugna con le spugne rimanenti. Posizionare il tubo contenente le spugne sul ghiaccio.
  6. Per isolare il fluido della ferita, centrifugare il tubo di coltura contenente la siringa da 5 mL con le spugne a 700 x g per 10 min.
  7. Dopo la centrifugazione, scartare la siringa e le spugne. Il liquido della ferita avrà raccolto nel tubo di coltura 16 mL. Un'immagine rappresentativa del fluido raccolto da una ferita del giorno 7 è mostrata nella Figura 1D. Trasferire il liquido della ferita in un tubo pulito per un deposito a lungo termine a -80 gradi centigradi.

3. Isolamento delle cellule dalle spugne PVA

  1. Per valutare l'ambiente cellulare di guarigione della ferita acuta, raccogliere spugne tra 1-14 giorni di impianto post-spongesata. Le spugne ottenute da una ferita 7 giorni dopo l'impianto sono mostrate nella Figura 1E.
  2. Preparare il mezzo di raccolta che contiene 1x HBSS (calcio/zmagnesio/fenolo rosso) integrato con 1% FBS, 1% HEPES e 1% penicillina-streptomia.
  3. Aliquota 5 mL di supporto di raccolta HBSS in un tubo conico da 15 mL.
  4. Estrarre le spugne PVA dai topi eutanasia come descritto in 2.2–2.4. Posizionare le spugne nel tubo conico contenente 5 mL del mezzo di raccolta HBSS.
  5. Trasferire le spugne e il mezzo di raccolta HBSS in un sacchetto di frullatore da 80 mL versando. Appendere il sacchetto del frullatore dal portello del frullatore a pale, posizionato in modo che le pale colpiscano le spugne e i supporti. Regolare le impostazioni del frullatore a pale per funzionare in alto per 60 s. Premere start.
  6. Trasferire il supporto dal sacchetto del frullatore al tubo conico da 15 mL con una pipetta, lasciando le spugne dietro nella borsa. Spremere le spugne per rilasciare accuratamente il supporto. Regolare le impostazioni del frullatore a pale per correre per 30 s in alto. Aggiungere 5 mL di supporti al contenitore del frullatore e ripetere il processo di stomaco 2x per un totale di tre lavature di spugna.
  7. Centrifugare il tubo conico a 250 x g per 5 min. Un pellet rosso di cellule e globuli rossi sarà visibile nella parte inferiore del tubo conico dopo la centrifugazione.
  8. Scartare il supernatante ed eseguire una lisi di globuli rossi: aggiungere 900 -L di dH2O al pellet e pipetta di cellule da mescolare. Neutralizzare con 100 L di 10x PBS. Aggiungere 4 mL di 1x PBS al tubo per neutralizzare completamente la lisi, quindi centrificare a 250 x g per 5 min.
    NOTA: il passaggio di lisi deve essere breve; lasciare l'acqua a contatto con le cellule per più di 3-5 s potrebbe provocare lisi di globuli non rossi.
  9. Dopo la centrifugazione, un pellet di globuli bianchi contenente cellule ferite prive di globuli rossi sarà presente nella parte inferiore del tubo conico. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet cellulare nel mezzo desiderato per le analisi a valle.

4. Analisi della citometria a flusso opzionale di leucociti innati isolati dalle ferite della spugna PVA

  1. Risospendere 0,5–1 x 106 cellule della ferita in 25 - L di una soluzione 2x di anticorpo di blocco contenente 10 anti-CD16/CD32 FISI/III anticorpo diluito in 1x PBS - 1% BSA.
    NOTA: Tutti gli anticorpi devono essere titoldati per determinare le concentrazioni ottimali per l'analisi della citometria del flusso.
  2. Incubare le cellule con anticorpi di blocco per 10 min sul ghiaccio.
  3. Fare un mix master 2x di anticorpi contenenti 2,5 mg/mL di PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/mL di FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, e 10 mg/mL di eFluor660-F4-80 diluito in 1 PBS. Aggiungere direttamente 25 -L del cocktail anticorpo alle cellule che si incubano nell'anticorpo di blocco.
  4. Incubare le cellule per 20 min sul ghiaccio, protetto dalla luce.
  5. Lavare le cellule 2x con 1x PBS.
  6. Fare un mix master di colorability amine-reactive fissabile-eFluor506 diluito 1:1,000 in 1x PBS. Risospendere il pellet cellulare in 50 - L della soluzione di tintura di vitalità.
    NOTA: il siero deve essere escluso dalla fase di fattibilità fissabile, in quanto impedirà il legame del tinero alle proteine endogene. Incubare le cellule per 20 min sul ghiaccio, protetto dalla luce.
  7. Lavare le cellule 2x con 1x PBS. Risospendere il pellet cellulare in 50 - L dell'1% di paraformaldeide.
  8. Incubare le cellule con 1% paraformaldeide per 15 min sul ghiaccio, protetto dalla luce.
  9. Lavare le celle 1x con 1x PBS e rimettere in sospensione il pellet in 1x PBS per l'analisi citometrica del flusso.

5. Escissione cutanea coda

  1. Anestesizzare un topo maschio C57BL/6J di 8-12 settimane mediante iniezione intraperitoneale di 80 mg/kg di chetamina. Somministrare 40 mg/kg di xilazina intraperitonealmente per l'analgesia. Confermare la profondità dell'anestesia con la perdita di un riflesso pedale.
  2. Preparare il sito chirurgico sulla coda del topo anetizzato utilizzando garza sterile per applicare la soluzione povidone-iodio 2x, seguita da un'applicazione del 70% di etanolo.
  3. Definire una sezione di 10 mm x 3 mm sulla superficie dorsale della coda, 10 mm dalla base della coda (Figura 1C) utilizzando un marcatore permanente per tracciare da un modello prefatto.
  4. Posizionare il topo anetizzato su tende chirurgiche sterili.
  5. Indossare guanti chirurgici sterili per eseguire le procedure chirurgiche. Con una lama sterile del bisturi, fai un'incisione di spessore pieno lungo i bordi destro, inferiore e sinistro dell'area della ferita.
  6. Utilizzando pinze sterili, sbucciare la pelle eccitata lontano dalla coda e utilizzare forbici chirurgiche sterili per tagliare il bordo superiore della zona della ferita.
  7. Applicare la pressione con garza sterile per fermare il sanguinamento.
  8. Applicare una pellicola di barriera spray al letto della ferita.
  9. Fotografare le ferite da una distanza fissa a intervalli di tempo regolari. Analizzare le fotografie in base all'analisi planimetrica per determinare le misurazioni dell'area della ferita. In alternativa, utilizzare le pinze per ottenere le misure di lunghezza e larghezza della ferita.

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Risultati

Risposta infiammatoria sistemica dopo l'impianto di spugna PVA
La chirurgia di impianto di spugna PVA ha generato una risposta infiammatoria sistemica, come dimostrato dall'induzione di IL-6 nel plasma 1 giorno dopo il ferimento (Figura 2A). Altre citochine infiammatorie, tra cui TNF-z e IL-1, così come una serie di chemiochine tra cui CCL2 e CXCL1 sono stati indotti sistemicamente nei primi 7 giorni di impianto di spugna post-PVA, e sono stati descritti altrove

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Discussione

Questo articolo descrive due modelli di ferite murine trattabili che consentono la valutazione della risposta di guarigione acuta della ferita. Il primo metodo prevede l'impianto chirurgico di spugne PVA nello spazio sottocutaneo dorsale. Questo approccio offre un netto vantaggio rispetto ai modelli di ferita basati sulla biopsia per studiare la risposta di guarigione cellulare della ferita a causa del gran numero di cellule e della quantità di fluidi della ferita ottenuti dalle spugne isolate. Per la riuscita esecuzione...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Kevin Carlson del Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility per la consultazione e l'assistenza con esperimenti di citometria di flusso. Immagini in Figura 1B e C sono state create con BioRender. Kayla Lee e Gregory Serpa sono ringraziati per la loro assistenza fotografica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dei seguenti: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Formazione in Patologia Ambientale) e il Brown University Research Seed Award.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x Soluzione salina tamponata con fosfatoFisher ScientificBP3991
Provette da centrifuga da 15 mL, OlympusGenesee28-103
1x HBSS (+Calcio, +Magnesio, – Rosso fenolo)ThermoFisher Scientific 14025076
Siringa da 5 mlBD309646
Anti-topo CD45.2-APC Fire750BioLegend109852Clone 104
Anti-topo F4/80-eFluor660ThermoFisher Scientific50-4801-82Clone BM8
Anti-topo Ly6C-FITCBD Biosciences553104Clone AL-21
Anti-topo Ly6G-PerCP-eFluor710ThermoFisher Scientific46-9668-82Clone 1A8-Ly6g
Anti-topo Siglec-F-APC-R700BD Biosciences565183Clone E50-2440
Autoclip Clip per ferita in acciaio inossidabileBraintree ScientificNC9021392
Autoclip clip per ferite in acciaio inossidabile, 9mmBraintree ScientificNC9334081
Sacca per frullatore, 80 ml FisherScientific14258201
provetta per coltura, 16 ml, 17x100Genesee Scientific21-130
Siero fetale bovino - StandardThermoFisher Scientific10437028
Colorante di vitalità fissabile eFluor506ThermoFisher Scientific65-0866-14
Hepes Solution, 1MGenesee Scientific25-534
ImageJ SoftwareNIH
Penicillina-Streptomicina (5000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070-063
Spugna di alcol polivinilico - pori di grandi dimensioniIvalon/PVA Soluzione illimitatadi www.sponge-pva.com
di iodio povidone, 10%Fisher Scientific3955-16
Pellicola barriera spray, Cavilon3M3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110VSeward0080/000/AJ

Riferimenti

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