Qui viene presentata la preparazione di complessi modello di pinta SNS cobalto(II) di dehydrogenasi di alcool epatico. I complessi possono essere preparati reagendo il precursore del ligando con CoCl2n. 6H2O e possono quindi essere riconfondibili permettendo all'etere etilico di diffondersi lentamente in una soluzione acetonitrile che contiene il complesso cobalto.
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Articolo metodologico
Preparazione dei complessi di modelli di pinze SNS di Disidrogeno del Fegato
In questo articolo
Sommario
Abstract
I complessi di modelli chimici sono pronti a rappresentare il sito attivo di un enzima. In questo protocollo, una famiglia di precursori del ligando tridentato (ciascuno in possesso di due sforamenti e un atomo di atomo di atomi (SNS) e basati su composti bis-imidazole o bis-triazole) sono metallati con CoCl2-6H2O per permettersi complessi tridentati SNS pinceralt cobalto(II). La preparazione dei complessi modello di cobalto (II) per la diciamigenasi da alcol epatica è facile. Sulla base di un rapido cambiamento di colore dopo l'aggiunta della soluzione CoCl2-6H2a acetonitrile che contiene il precursore del ligando, il complesso si forma rapidamente. La formazione del complesso metallico è completa dopo aver permesso alla soluzione di riafflusso durante la notte. Questi complessi di cobalto (II) servono come modelli per il sito attivo di zinco nella dehydrogenasi di alcool epatica (LADH). I complessi sono caratterizzati da diffrazione a raggi X a cristallo singolo, spettrometria di massa elettrospray, spettroscopia visibile ultra-viola e analisi elementare. Per determinare con precisione la struttura del complesso, è necessario determinare la sua struttura a cristalli singolo. I cristalli singoli dei complessi adatti alla diffrazione a raggi X vengono quindi coltivati tramite una diffusione lenta del vapore dell'etere dietilico in una soluzione acetonitrile che contiene il complesso di cobalto(II). Per i cristalli di alta qualità, la cristallizzazione avviene in genere su un periodo di 1 settimana o più a lungo. Il metodo può essere applicato alla preparazione di altri complessi di coordinamento dei modelli e può essere utilizzato nei laboratori didattici universitari. Infine, si ritiene che altri possano trovare questo metodo di cristallizzazione per ottenere singoli cristalli benefici per la loro ricerca.
Introduzione
Lo scopo del metodo presentato è quello di preparare analoghi di piccole molecole di LADH per comprendere ulteriormente l'attività catalitica dei metallonze. LADH è un enzima dimeric che contiene un dominio di legame co-factor e zinco (II) metallo contenente dominio catalitico1. LADH, in presenza di co-fattore NADH, può ridurre chetoni e aldeidi ai rispettivi derivati dell'alcol2. In presenza di NAD,LADH può eseguire la catalisi inversa di ossidazione di alcoli a chetoni e aldeidi2. La struttura cristallina del sito attivo di LADH mostra che il suo centro metallico di zinco (II) è legato ad un atomo di azoto, fornito da una catena laterale di istidina e due atomi di zolfo e offerto da due ligandi di cisteina3. Ulteriori ricerche hanno dimostrato che il centro di metallo di zinco è ligate con una molecola d'acqua labile, con conseguente geometria pseudo-tetraedrica intorno al centro metallico4.
In precedenza abbiamo segnalato e utilizzato i precursori del ligando di pinza sNS, nonché abbiamo metalllato i precursori del ligando con snl2 per formare complessi di n (II) che contengono il precursore del ligando tridentato5,6,7. Questi precursori del ligando sono mostrati nella Figura 1. Questi complessi di zinco(II) hanno mostrato attività per la riduzione stoichiometrica delle aldeide povera di elettroni e sono quindi complessi modello per LADH. Successivamente, la sintesi e la caratterizzazione di una serie di complessi di rame(I) e rame(II) che contengono precursori di ligando SNS sono stati segnalati8,9,10.
Anche se LADH è un enzima zinco(II), siamo interessati a preparare complessi modello cobalto (II) di LADH al fine di ottenere maggiori informazioni spettroscopiche sugli analoghi cobalto(II) di LADH. I complessi di cobalto(II) sono colorati, mentre i complessi di zinco(II) sono di colore bianco sporco. Poiché i complessi di cobalto (II) sono colorati, è possibile ottenere spettri visibili all'ultravioletto dei complessi, in cui è possibile raccogliere anche informazioni sulla forza del campo di ligando nei complessi di cobalto(II). Utilizzando le informazioni dei calcoli gaussiani e gli spettri visibili ultravioletti ottenuti sperimentalmente, è possibile dedurre informazioni sulla forza del campo del ligando. Il cobalto(II) è un buon sostituto dello zinco(II), poiché entrambi gli ioni hanno raggi ionici simili e simili acidità di Lewis11,12.
Il metodo presentato prevede la sintesi e la caratterizzazione dei complessi di modelli per tentare di imitare il comportamento catalitico naturale di LADH5,6. In precedenza abbiamo metalllato una famiglia di precursori di ligando con nCl2 per formare complessi di modelli di zinco (II) di LADH, che ha modellato la struttura e la reattività del sito attivo di zinco in LADH4. Attraverso molteplici esperimenti, questi ligandi a pinze si sono dimostrati robusti in diverse condizioni ambientali e sono rimasti stabili con una collezione diversificata di gruppi R collegati. 5,6
I ligandi tridentati sono preferibili rispetto ai ligandi monodentati, perché sono stati trovati per avere più successo con la metallizzazione a causa dei forti effetti chelato dei leganti tridentati. Questa osservazione è dovuta ad un'entropia più favorita della formazione di ligando a pinze tridentate rispetto a un ligando monodentato13. Inoltre, è probabile che i ligandi tridentati loghi impediscano la dimerizzazione dei complessi metallici, che è favorita perché la dimerizzazione rischia di rallentare l'attività catalitica di un complesso14. Così, l'utilizzo di ligandi pintatri tridentati si è dimostrato efficace nella chimica organometallica nella preparazione di complessi catalitici attivi e robusti. I complessi di pintes SNS sono stati studiati meno rispetto ad altri sistemi a tenaglia, poiché i complessi di pincer di solito contengono metalli di transizione di seconda e terza fila15.
Questa ricerca sui metallonze può aiutare a comprendere ulteriormente la loro attività enzimatica, che può essere applicata ad altre aree della biologia. Questo metodo di sintesi dei complessi del modello rispetto al metodo alternativo (sintesi dell'intera proteina di LADH) è favorevole per una serie di motivi. Il primo vantaggio è che i complessi modello sono a basso contenuto di massa molecolare e sono ancora in grado di rappresentare con precisione l'attività catalitica e le condizioni ambientali del sito attivo dell'enzima naturale. In secondo luogo, i complessi di modelli sono più semplici da utilizzare e produrre dati affidabili e riconoscibili.
Questo manoscritto descrive la preparazione sintetica e la caratterizzazione di due complessi modello di pinta di cobalto (II) di LADH. Entrambi i complessi presentano un ligando a tenore di spillo che contiene atomi di zolfo, azoto e donatore di zolfo. Il primo complesso (4) è basato su un precursore di imidazolo, e il secondo (5) si basa su un precursore triazolo. I complessi mostrano la reattività per la riduzione della stoichiometria delle aldeidi povere di elettroni in presenza di un donatore di idrogeno. Questi risultati di reattività saranno riportati in un manoscritto successivo.
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Protocollo
1. Sintesi del cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazole-2-thione)pyridine(II)tetrachlorocobaltate [4]
- Per preparare complesso 4, aggiungere 0,121 g (3.12 x 10-4 mol) di 2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneiidazole-2-thione)pyridine (C19H25N5S2)6 a 15 mL di acetonitrile in una flacone inferiore rotonda da 100 mL. Successivamente, a questa soluzione, aggiungere 0,0851 g (3,58 x 10-4 mol) di cloruro di cobalto (II) esadorte (CoCl2x 6H2O). La soluzione di reazione dovrebbe cambiare colore dal giallo chiaro al verde smeraldo subito dopo l'aggiunta dell'esadorazione del cloruro cobalto (II).
- Aggiungere una barra di agitazione al pallone. Reflusso e mescolare la reazione per 20 h per garantire una reazione completa. Rimuovere il solvente con un rotovap sotto pressione ridotta.
2. Ricristallizzazione del cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropile-N'-methyneimidazole-2-thione)cobalto(II)tetrachlorocobaltate [4] da lenta diffusione
- Sciogliere il soluto in acetonitrile (7,5 mL), filtrare la soluzione e mettere la soluzione in modo uniforme in 1 dram. Riempire ogni fiala con 1,5 mL di soluzione acetonitrile.
- Aggiungere cotone per tappi le fiale, che consente una lenta diffusione del vapore. Montare il cotone comodamente nell'apertura nella parte superiore della fiala.
- Posizionare le fiale in un barattolo da 240 mL contenente 50 mL di etere dietil. Chiudere il barattolo con un tappo.
- Lasciare che i cristalli crescano per un periodo di 1 settimana.
NOTA: la ricristallizzazione può richiedere più di 1 giorno.
3. Sintesi di cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazozole-2-thione)pyridine(II)tetrachlorocobaltate [5]
- Per preparare complesso 5, aggiungere 0.183 g (4.70 x 10-4 mol) di 2,6-bis(N-isopropyl-N'-metilofriazole-2-thione)pyridine (C17H23N7S2)6 a 15 mL di acetonitrile in un flacone inferiore rotondo 100 mL. A questa soluzione, aggiungere 0,223 g (9,37 x 10-4 mol) di esahydrare cramuro di cobalto (CoCl2x 6H2O). La soluzione di reazione dovrebbe cambiare colore dal giallo chiaro al blu reale subito dopo l'aggiunta dell'esadiatore al cloruro cobalto (II).
- Aggiungere una barra di agitazione al pallone. Reflusso e mescolare la reazione per 20 h per garantire una reazione completa. Rimuovere il solvente con un rotovap sotto pressione ridotta.
4. Ricristallizzazione del cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropile-N'-methylenetriazozole-2-thione)cobalto(II)tetrachlorocobaltate [5] da lenta diffusione
- Sciogliere il soluto in acetonitrile (9,0 mL), filtrare la soluzione e mettere la soluzione in modo uniforme in 1 dram. Riempire ogni fiala con 1,5 mL di soluzione acetonitrile.
- Aggiungere cotone per tappi le fiale, che consente una lenta diffusione del vapore. Montare il cotone comodamente nell'apertura nella parte superiore della fiala.
- Mettere le fiale in un barattolo contenente 50 mL di etere etilico. Chiudere la fiala con un tappo.
- Lasciare che i cristalli crescano per un periodo di 1 settimana.
NOTA: la ricristallizzazione può richiedere più di 1 giorno.
5. Cristallografia a raggi X
- Montare un cristallo di 4 su un anello di nylon. Raccogliere i dati su un diffrazione Diffrazione di Rigaku diffractometro. Qui, i dati di diffrazione a raggi X vengono raccolti a 173(2) K. Risolvere la struttura cristallina utilizzando i programmi di soluzione della struttura Olex216 e ShelXT17 utilizzando metodi diretti. Perfezionare la struttura con il pacchetto di perfezionamento ShelXL18 utilizzando la minimizzazione dei minimi quadrati.
- Montare un cristallo di 5 su un anello di nylon. Raccogliere i dati di diffrazione a raggi X su un diffractometro di diffrazione di Rigaku Oxford. Qui, i dati di diffrazione a raggi X vengono raccolti a 173(2) K. Risolvere la struttura cristallina utilizzando i programmi di soluzione della struttura Olex216 e ShelXT17 utilizzando metodi diretti. Perfezionare la struttura con il pacchetto di perfezionamento ShelXL18 utilizzando la minimizzazione dei minimi quadrati.
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Risultati
Sintesi
Le sintesi dei complessi 4 e 5 sono state eseguite con successo reagendo una soluzione acetonitrile contenente un precursore del ligando bis-thione con esadiadio al cobalto (II) cloruro (Figura 2). Questa reazione si è verificata ad una temperatura di reflusso in presenza di aria. In generale, i complessi 4 e 5 sono stati osservati per essere solubili in acetonitrile, solfuro ditilo, dichlorometan...
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Discussione
La preparazione dei complessi 4 e 5 è facile. Il passo chiave è quello di aggiungere il CoCl solido2- 6H2O a una soluzione acetonitrile che contiene il rispettivo precursore del ligando. La soluzione diventa verde scuro in pochi secondi dopo l'aggiunta di CoCl2- 6H2O per formare complesso 4. La soluzione diventa blu brillante dopo l'aggiunta di CoCl2- 6H2O per formare complesso 5. Per gara...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
John Miecznikowski ha ricevuto sostegno finanziario da quanto segue per questo progetto: Connecticut NASA Space Grant Alliance (Award Number P-1168), Fairfield University Science Institute, College of Arts and Sciences Publication Fund, Fairfield University Faculty Summer Research Stipend, e National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (Grant Number CHE-1827854) per i fondi per acquisire uno spettrometro NMR a 400 MHz. Ringrazia anche Terence Wu (Università di Yale) per l'assistenza nell'acquisizione di spettri di massa elettrospray. Jerry Jasinski riconosce il National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (Grant Number CHE-1039027) per i fondi per l'acquisto di un diffractometro a raggi X. Sheila Bonitatibus, Emilse Almanza, Rami Kharbouch e Samantha Eygmont riconoscono l'Hardiman Scholars Program per aver fornito il loro stipendio di ricerca estiva.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pallone a fondo tondo da 100 ml | vetro chimico | CG150691 | pallone a fondo tondo a collo singolo da 100 ml, 19/22 giunto esterno |
| Acetonitrile | Fisher | HB9823-4 | di grado HPLC |
| per roto-vap | Lauda | L000638 | Alpha RA 8 |
| Cloruro di cobalto esaidrato | Acros Organics | AC423571000 | Acros Organics |
| Etere | dietilicoFisher | E-138-1 | di etiletere anidoro |
| Fisher | S63456 | a cilindro graduato da 25 mL | |
| Fisher | 11-100-49SH | Isotemp Basic Stirring Piastra riscaldante | |
| Barattoli | Fisher | 05-719-481 | Barattoli da 250 mL |
| Ligand | ----- | ----- | Sintetizzato in precedenza dal professor Miecznikowski |
| medium batuffoli di cotone | Fisher | 22-456-80 | batuffoli di cotone medi |
| fiale da un dram | Fisher | 03-339 | fiale da un dram con pipetta TFE Lined Cap |
| Fisher | 13-678-20B | pipette da 5,75 pollici | |
| pipette bulbi Fisher | 03-448-21 | Fisher Brand Latex Bulb per | |
| pipetta piatto di ricristallizzazione per bagno di sabbia | Fisher | 08-741 D | 325 mL piatto ricristallizzante per bagno di sabbia |
| condensatore a riflusso | Chem Glass | CG-1218-A-22 | Condensatore con giunto interno 19/22 |
| Rotovap | Heidolph Collegiate | 36000090 | Brinkmann; Heidolph Evaporatore rotante collegiato con bagno ecologico Heidolph WB Evaporatore rotante Heidolph |
| di mare per bagno di sabbia | Acros Organics | 612355000 | sabbia di mare lavata per bagno di sabbia |
| Agitatore | Fisher | 07-910-23 | Agitatore magnetico a forma di uovo |
| Grasso sottovuoto | Fisher | 14-635-5D | Dow Corning Pompa per vuoto per grasso ad alto vuoto |
| per rotovap | Heidolph Collegiate | 36302830 | Controllo della valvola Rotovac Heidolph |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
