Le creme nucleari sono uno strumento indispensabile per studiare gli eventi cromosomici durante la meiosi. Qui dimostriamo un metodo per preparare e visualizzare cromosomi meiotici durante la profase I dagli spermatociti del pesce zebra.
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Articolo metodologico
Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
La meiosi è il processo cellulare chiave necessario per creare gameti aploidi per la riproduzione sessuale. Gli organismi modello sono stati determinanti nella comprensione degli eventi cromosomici che si verificano durante la profase meiotica, tra cui l'accoppiamento, la sinapsi e gli eventi di ricombinazione che garantiscono una corretta segregazione cromosomica. Mentre il topo è stato un modello importante per comprendere i meccanismi molecolari alla base di questi processi, non tutti gli eventi meiotici in questo sistema sono analoghi alla meiosi umana. Recentemente abbiamo dimostrato l'entusiasmante potenziale del pesce zebra come modello di spermatogenesi umana. Qui descriviamo, in dettaglio, i nostri metodi per visualizzare i cromosomi meiotici e le proteine associate nei preparati di diffusione cromosomica. Questi preparati hanno il vantaggio di consentire l'analisi ad alta risoluzione delle strutture cromosomiche. In primo luogo, descriviamo la procedura per la sezionamento dei testicoli da pesci zebra adulti, seguita da dissociazione cellulare, lisi e diffusione dei cromosomi. Successivamente, descriviamo la procedura per rilevare la localizzazione delle proteine cromosomiche meiotiche, mediante rilevamento dell'immunofluorescenza e sequenze di acidi nucleici, mediante fluorescenza nell'ibridazione in situ (FISH). Queste tecniche comprendono un utile insieme di strumenti per l'analisi citologica dell'architettura della cromatina meiotica nel sistema del pesce zebra. I ricercatori della comunità dei pesci zebra dovrebbero essere in grado di padroneggiare rapidamente queste tecniche e incorporarle nelle loro analisi standard della funzione riproduttiva.
Introduzione
La riproduzione sessuale procede attraverso la combinazione di due gameti aploidi, ognuno dei quali trasporta metà del complemento cromosomico di una cellula somatica. La meiosi è una divisione cellulare specializzata che produce gameti aploidi attraverso un ciclo di replicazione del DNA e due cicli successivi di segregazione cromosomica. Nella profase I, i cromosomi omologhi (omologi) devono subire l'abbinamento, la ricombinazione e la sinapsi, quest'ultima caratterizzata dalla formazione del complesso sinatonemale che comprende due assi omologi colmati dal subverso, Sycp1 (Figura 1A,B). La mancata esecuzione corretta di questi processi può portare a....
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Protocollo
Tutti i metodi che coinvolgono il pesce zebra sono stati effettuati utilizzando standard etici approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'UC Davis.
1. Procedura di diffusione dei cromosomi
NOTA: Il seguente protocollo è progettato per creare 4-6 vetrini, con centinaia di nuclei meiotici diffusi per diapositiva. Il numero di testicoli utilizzati dipenderà dalle dimensioni del pesce. Aspettatevi di utilizzare 20 animali a 60 giorni dopo la fecondazione (dpf) e 15 animali a 6 mesi dopo la fecondazione (mpf). Per i pesci zebra di grandi dimensioni (ad esempio, 12 mpf) dovrebbero essere sufficienti ....
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Risultati
Abbiamo delineato un metodo per preparare e visualizzare i preparativi per la diffusione dello spermatocito del pesce zebra. Se eseguita correttamente, la nostra procedura produce nuclei ben diffusi e non sovrapposti. Per recuperare tali nuclei, è importante avere la quantità appropriata di materiale di partenza (cioè testicoli), trattare i testicoli per un periodo di tempo sufficiente nella trypsina e un numero adeguato di trattamenti DNase I. Questi spread possono quindi essere macchiat.......
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Discussione
Qui descriviamo i metodi per sondare la posizione dei telomeri e delle proteine associate ai cromosomi nella superficie nucleare si diffonde dagli spermatociti isolati dai testicoli dei pesci zebra. Prevediamo che questi metodi saranno applicabili per l'analisi di spermatociti in altre specie teleost con regolazione delle dimensioni dei testicoli.
Mentre solo pochi anticorpi sono stati sollevati per le proteine meiotiche dei pesci zebra, abbiamo avuto successo usando i seguenti anticorpi solle.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Trent Newman e Masuda Sharifi per i commenti sul manoscritto e An Nguyen per aver contribuito a ottimizzare i metodi per diffondere e macchiare i cromosomi dai meiociti del pesce zebra. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM079115 assegnato a S.M.B.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da centrifuga da 1,5 mL | Diverse marche commerciali disponibili | ||
| Rack per provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Diverse marche commerciali disponibili | ||
| 16% formaldeide, senza metanolo | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Diverse marche commerciali disponibili | ||
| Vetrini coprioggetto in vetro da 24 x 50 mm | Corning | 2980-245 | |
| Vetrini coprioggetti 24 x 60 mm | VWR International | 16004-312 | |
| Provette da centrifuga coniche da 50 ml | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Sacchetto per autoclave | Diverse marche commerciali disponibili | Utilizzato per realizzare vetrini coprioggetti in plastica. | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Preparare una soluzione madre da 100 mg/ml in acqua distillata sterile. |
| Filtro cellulare, 100 &; micro; m | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M capra anti-pollo IgY (H+L), altamente adsorbito in modo incrociato | Biozio | 203775-500uL | Utilizzare a 1:1000 |
| Pollo anti-zfSycp1 | Generato da Burgess lab | N/A Utilizzare | a 1:100 |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Barattolo Coplin | Diversi marche commerciali disponibili | ||
| DNasi I, grado II dal pancreas bovino | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Due sono necessari per sezionare i testicoli. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Anticorpo secondario IgY (H+L) anti-pollo di capra, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Utilizzo a 1:1000 |
| Anticorpo secondario IgY (H+L) di capra, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Utilizzo a 1:1000 |
| Capra anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Non funziona nelle nostre mani |
| Capra anti-coniglio IgG (H+L) anticorpo secondario adsorbito incrociato, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Utilizzare a 1:1000 |
| Capra anti-coniglio IgG (H+L) anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Utilizzare a 1:1000 |
| Siero | di capraSigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Sale sodico di eparina | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Camera di umidità | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Forno di ibridazione | VWR International | 230401V (Modello 5420) | |
| Agitatore per incubatrice | New Brunswick Scientific | Modello classico C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Utilizzato per la camera di umidità |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscopio | Diverse marche commerciali disponibili | È sufficiente qualsiasi microscopio standard in grado di ingrandire almeno ~1,65X. | |
| Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Topo anti-cricetoSCP3 | Abcam | ab97672 | Non funziona nelle nostre mani |
| Topo anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Non funziona nelle nostre mani |
| Topo anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Non funziona nelle nostre mani |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 soluzione | Microscopia elettronica | Scienze 74257 | |
| Pipette di trasferimento in plastica Diverse | marche commerciali disponibili | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Preparare secondo il produttore . |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Preparare secondo le istruzioni del produttore. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Coniglio anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Utilizzare in 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Utilizzare in 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Utilizzare a 1:300 |
| Citrato di sodio | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Saccarosio | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Forbici, angolo 30°, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Può anche utilizzare qualsiasi paio di piccole forbici. |
| Kit Sylgard | Fisher Scientific | NC9897184 | Preparare secondo le istruzioni del produttore. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Diluire in acqua distillata sterile per ottenere una soluzione di lavoro al 20%. Conservare a temperatura ambiente. Triton X-100 forma un precipitato quando diluito in acqua; precipitato si dissolve durante la notte. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Inibitore della tripsina dall'albume d'uovo di gallina | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Diluire in acqua distillata sterile per ottenere una soluzione di lavoro al 20%. Conservare a temperatura ambiente. |
| Forbici a molla Vannas - 4 mm (micro forbici) | Fine Science Tools | 15018-10 |
Riferimenti
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs dur....
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Ristampe e permessi
