Quantificare la Citotossicità dello Staphyloccus aureus contro il Polimorfo Umano Leukociti

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per la purificazione dei leucociti polimorfonucleari da tutto il sangue umano e due saggi distinti che quantificano la citotossicità dello Staphylococcus aureus contro queste importanti cellule immunitarie innate.

Abstract

Staphylococcus aureus è in grado di secernere una vasta gamma di leucocidi che prendono di mira e interrompono l'integrità della membrana dei leucociti polimorfonucleari (PMN o neutrofoni). Questo protocollo descrive sia la purificazione delle PMN umane sia la quantificazione di S. aureus cytotoxicity contro le PMN in tre diverse sezioni. La sezione 1 descrive in dettaglio l'isolamento delle PMN e del siero dal sangue umano utilizzando la centrifugazione della densità. Sezione 2 mette alla prova la citotossicità delle proteine extracellulari prodotte da S. aureus contro questi PMN umani purificati. Queste procedure misurano l'interruzione dell'integrità della membrana plasmatica PMN da parte di S. aureus leukocidins utilizzando l'analisi della citometria di flusso delle PMN trattate con iodide propidio, un fluoroforo legante del DNA che è impermeabile alla membrana cellulare. Collettivamente, questi metodi hanno il vantaggio di testare rapidamente S. aureus cytotoxicity contro i PMN umani primari e possono essere facilmente adattati per studiare altri aspetti delle interazioni ospite-patogeno.

Introduction

Lo Staphylococcus aureus è un batterio Gram-positivo che causa un ampio spettro di malattie negli esseri umani. Questo patogeno prominente produce numerosi fattori di virulenza che contribuiscono a diversi aspetti dell'infezione. Questi includono molecole superficiali che permettono a S. aureus di aderire a diversi tipi di tessuto ospite¹, proteine extracellulari che interferiscono con la risposta immunitaria dell'ospite²e una serie di tossine secrete che prendono di mira diversi tipi di cellule ospiti³. In questa relazione, descriviamo un metodo che quantifica la citotossicità delle proteine extracellulari prodotte da S. aureus contro i leucociti polimorfomi umani (PMN o neutrofili), cellule principali degli effetti dell'ospite innata risposta immunitaria.

Le PMN sono i leucociti più abbondanti nei mammiferi. Queste cellule immunitarie circolanti vengono rapidamente reclutate nel sito di insulto del tessuto ospite in risposta ai segnali di pericolo prodotti dalle cellule residenti o da composti unici per i microbi invasori. L'input extracellulare da queste molecole e dai contatti diretti con cellule ospiti residenti attivate durante l'estravagazione aumenta lo stato di attivazione delle PMN in un processo noto come priming^4,5. Le PMN prime che hanno raggiunto tessuti in difficoltà eseguono quindi importanti risposte immunitarie innate progettate per prevenire l'instaurazione di infezione. Questi includono il legame e l'internalizzazione, o fagocitosi, di microrganismi invasori che innesca una cascata di eventi intracellulari cumulanti nella distruzione dei microbi da una batteria di potenti composti antimicrobici⁵.

Le PMN svolgono un ruolo essenziale per proteggere gli esseri umani dall'invasione degli agenti patogeni e sono particolarmente importanti per prevenire l'infezione da S. aureus ⁴. Tuttavia, questo batterio produce una vasta gamma di geni di virulenza che impediscano diverse funzioni di PMN. Questi includono proteine extracellulari che bloccano il riconoscimento delle molecole di segnalazione, impediscono l'adesione al tessuto ospite, inibiscono la produzione di composti antimicrobici e compromettono l'integrità della membrana plasmatica⁴. S. aureus orchestra l'espressione temporale di questi geni della virulenza attraverso l'input collettivo da sistemi sensoriali a due componenti che riconoscono specifici segnali ambientali. Il sistema a due componenti SaeR/S è un importante up-regulator della trascrizione genica S. aureus virulenza durante l'infezione^{6,7,8,9,10,11}. In particolare, questo sistema a due componenti si è dimostrato fondamentale per la produzione di leucocidi di due componenti che si rivolgono specificamente a PMN umani¹².

Questo protocollo è suddiviso in tre diverse sezioni. La prima sezione descrive la purificazione dei PMN dal sangue umano utilizzando la centrifugazione del gradiente di densità utilizzando un protocollo che è stato adattato dai metodi stabiliti da B'yum¹³ e Nauseef¹⁴. La seconda e la terza sezione descrivono in dettaglio due diverse tecniche per esaminare S. aureus cytotoxicity; uno intossica le PMN con proteine extracellulari prodotte da S. aureus, mentre l'altro esamina la capacità dei batteri viventi di danneggiare i PMN in seguito alla fagocitosi. Queste procedure utilizzano iodio propidio per misurare la perdita di integrità della membrana plasmatica PMN causata da tossine che formano i pori di S. aureus. Propidium iodide è un fluoroforo che lega il DNA che è normalmente impermeabile alla membrana cellulare, ma può attraversare le membrane plasmatiche che sono state interrotte dalle tossine S. aureus. L'analisi della citometria di flusso consente la rapida quantificazione dei PMN positivi allo iodio di propidio per misurare la citotossicità relativa dei ceppi di S. aureus. S. aureus resistente all'ansillina (MRSA) identificata come elettroforesi gel a campo pulsato USA300 e mutante di delezione isogenica di saeR/S in questo ceppo (USA300saeR/S) sono stati utilizzati come modelli per dimostrare come queste procedure possono quantificare la citotossicità di S. aureus contro le PMN umane.

Protocol

Il sangue venoso eparano da donatori sani è stato raccolto in conformità con il protocollo approvato dall'Institutional Review Board for Human Subjects presso la Montana State University. Tutti i donatori hanno fornito il consenso scritto per partecipare a questo studio.

1. Purificazione dei leucociti polimorfonucleari umani e isolamento del siero umano

NOTA: tutti i reagenti devono essere regolarmente controllati per verificare la presenza di endotossina utilizzando un kit di rilevamento endotossina disponibile in commercio e devono contenere <25.0 pg/mL endotossina per evitare l'innesco indesiderato delle PMN.

1. Portare 50 mL del 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 mL dello 0,9% NaCl (w/v), 20 mL dell'1,8% NaCl (w/v), 12 mL di 1,077 g/mL di soluzione di gradiente di densità e 20 mL di grado di iniezione o irrigazione a temperatura ambiente.
2. Per isolare il siero umano, incubare 4 mL di sangue umano appena prelevato senza anti-coagulante a 37 gradi centigradi in un tubo di vetro da 15 mL per 30 min. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 2.000-3.000 g per 10 min a temperatura ambiente. Trasferire lo strato superiore del siero in un tubo di centrifuga conica fresco da 15 mL e posizionarlo sul ghiaccio.
3. Combinare 25 mL di sangue umano eparano appena disegnato (1000 unità/mL) con 25 mL di temperatura ambiente 3% dextran-0,9% NaCl (rapporto 1:1) in due replica 50 mL tubi centrifugai conici (50 mL di volume totale per tubo). Mescolare delicatamente a dondolo ogni 50 mL di tubo conico e poi lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 min.
4. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente, appariranno due strati separati. Trasferire lo strato superiore di ogni miscela dextran-blood in nuovi tubi conici da 50 mL e centrifugare a 450 x g per 10 min a temperatura ambiente con freni bassi o no.
5. Aspirare con attenzione entrambi i supernatanti e scartare senza disturbare i pellet cellulari. Resospendere delicatamente ogni pellet cellulare in 2 mL di temperatura ambiente 0.9% NaCl, combinare i pellet risospesi in un singolo tubo conico 50 mL, quindi aggiungere il rimanente 0.9% NaCl (volume finale di 35 mL).
6. sottoposto con attenzione 10 mL di temperatura ambiente di 1.077 g/mL soluzione di gradiente di densità sotto la sospensione cellulare utilizzando una pipetta a mano. Girare a 450 x g per 30 min a temperatura ambiente con freni bassi o assenza. Aspirare delicatamente il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Il supernatante conterrà cellule mononucleari del sangue periferiche che possono essere raccolte come descritto in precedenza¹⁴.
7. Lyse i globuli rossi risuspendendo il pellet cellulare in 20 mL di acqua a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente dondolando il tubo per 30 s. La lisi dei globuli rossi sarà accompagnata da una netta diminuzione della torbidità.
8. Aggiungere immediatamente 20 mL di 1,8% NaCl (a temperatura ambiente [RT]) e centrifugare il campione a 450 s g per 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: È importante ridurre al minimo il tempo necessario per ridurre al minimo il tempo necessario per la sola gestione dei pN a seguito della lisi dei globuli rossi per massimizzare la resa del PMN e prevenire l'ustione e/o l'attivazione.
9. Aspirare con attenzione il super-natante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 2 mL di RTMI 1640 medio e posto sul ghiaccio.
10. Contare le cellule usando un emocitometro. Risospendere le PMN purificate a una concentrazione di 1 x 10⁷ cellule/mL con RPMI ghiacciate e tenere il ghiaccio.
11. Unire 100 l di PMN purificate (1 x 10⁶ celle) con 300 l di tubi salini con buffer di fosfato (DPB) a vento freddo con 1 L di colorazione di iodide di propidio in due tubi di citometria di flusso di flusso. Per un controllo positivo del danno della membrana plasmatica, aggiungere 40 -L di 0,5% soluzione Triton X-100 in uno dei tubi di citometria di flusso e mescolare accuratamente.
12. Utilizzare la citometria di flusso per misurare la colorazione di dispersione, dispersione laterale e iodio propidio (massimo di eccitazione/emissione a 535/617 nm) di cellule purificate(Figura 1).
    NOTA: l'analisi della dispersione in avanti e laterale identificherà le popolazioni indesiderate di linfociti e monociti. Il iodio di propidio macchia solo le cellule con una membrana plasmatica compromessa e PMN purificati che hanno popolazioni pronunciate di cellule positive di iodio propidio non dovrebbero essere utilizzate. Per questi studi, le PMN purificate sono state utilizzate solo se comprendevano il >98% delle cellule purificate e il <5% macchie positive per lo iodio di propidio.
13. Preparare una piastra di 96 pozzetto per i saggi di citotossicità PMN ricoprendo i singoli pozzi che verranno utilizzati in questo saggio con 100 l del 20% di siero umano isolato che è stato diluito con DPBS.
    NOTA: la placcatura di PMN direttamente su plastica o vetro causerà l'attivazione delle cellule. Assicurati di includere almeno un pozzo di controllo negativo che riceverà solo i media e almeno un pozzo di controllo positivo che riceverà lo 0,05% Triton X-100.
14. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 30 min. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetto rivestiti due volte con DPBS ghiacciato per rimuovere qualsiasi siero in eccesso. Toccare delicatamente il piatto a testa in giù per rimuovere qualsiasi DPBS residuo e posizionare sul ghiaccio.
15. Aggiungere delicatamente 100 l di PMN umani purificate a 1 x 10⁷ celle/mL per ogni pozzetto (1 x 10⁶ PMN/pozzo). Lasciare che le PMN si depositino in pozze incubando la piastra sul ghiaccio per almeno 5 min. Mantenere il livello della piastra per consentire la distribuzione uniforme delle cellule in ogni pozzo e lasciare sul ghiaccio per evitare l'attivazione indesiderata di PMN.

2. Analisi di citotossicità delle proteine extracellulari S. aureus contro i leucociti polimorfonucleari umani

1. Cultura S. aureus durante la notte in brodo di soia tripla (TSB) utilizzando un incubatore agitazione impostato a 37 gradi centigradi. Per questi studi, 20 mL di TSB in flaconi separate di 150 mL Erlenmeyer sono stati inoculati con colture congelate di ceppi S. aureus USA300 o USA300,saeR/S, e coltivati per circa 14 h con agitazione a 250 giri/m.
2. Subcultura S. aureus eseguendo una diluizione 1:100 della coltura batterica durante la notte con supporti freschi. Incubare a 37 gradi centigradi con lo scuotimento fino a quando i batteri raggiungono la fase di crescita stazionaria precoce.
   NOTA: Per questi esperimenti, 20 mL di brodo di soia tripmatica in flaconi Erlenmeyer da 150 mL sono stati inoculati con 200 gradi disaeR/S coltivati durante la notte e incubati a 37 gradi centigradi con tremori a 250 rpm per 5 h.
3. Quando i batteri hanno raggiunto la fase iniziale di crescita stazionaria, trasferire 1 mL di S. aureus subcolto in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 5.000 g per 5 min a temperatura ambiente.
4. Dopo la centrifugazione, trasferire supernatali in una siringa da 3 mL. Passare i supernatanti attraverso un filtro da 0,22 m e in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml sul ghiaccio.
5. Eseguire diluizioni seriali di supernatanti con supporti ghiacciati utilizzati per la coltura S. aureus.
   NOTA: Per gli esperimenti illustrati, i superanatanti provenienti da USA300 e USA300saeR/S sono stati sottoposti a quattro diluizioni consecutive di log 1/2 con TSB ghiacciato.
6. Aggiungere delicatamente campioni supernatanti o supporti da soli (per controlli negativi e positivi) ai singoli pozzi di 96 pozze contenenti PMN sul ghiaccio dal punto 1.15. Per questi esperimenti, ad ogni pozzo sono stati aggiunti 10 campioni di supernatali USA300 oUSA300-saeR/S. Piastra delicatamente rocciosa per distribuire i supernatanti in pozzi e incubare a 37 gradi centigradi.
7. Nei momenti desiderati, rimuovere la piastra dall'incubatrice e metterla sul ghiaccio. Aggiungere bene 40 -L di 0,5% Triton X-100.
8. Pipette delicatamente i campioni su e giù in ogni pozzo per tirare completamente fuori tutte le PMN aderitate alla piastra, quindi trasferire i campioni a flow cytometrici tubi sul ghiaccio che contengono 300 -L di GHIACCIO-freddo DPBS con 1 L di propidium iodide.
9. Misurare la proporzione di PMN positivi allo iodio del propidio utilizzando la citometria di flusso (Figura 2A). Quando è legato al DNA, lo iodio di propidio ha eccitazione/emissione a 535/617 nm.

3. S. aureus citotossicità analisi contro i leucociti polimorfonucleari umani dopo la fagocitosi

NOTA: Le curve di crescita definite dalla densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) e la concentrazione di batteri devono essere determinate empiricamente per i ceppi S. aureus da testare prima di iniziare questo test. Il successo di questi esperimenti richiede il raccolto costante di concentrazioni uguali di ogni ceppo S. aureus testato in fase di crescita intermedia utilizzando l'OD₆₀₀ di batteri sub-coltivati.

1. Iniziare le colture notturne di ceppi Di Aureus e batteri della sottocoltura come descritto nei passaggi 2.1.1 e 2.1.2.
2. Raccogliere il raccolto subcolto S. aureus quando ha raggiunto la crescita media-esponenziale trasferendo 1 mL di batteri coltivati a un tubo di microcentrifuga di 1,5 mL e centrifugando a 5.000 g per 5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Nelle nostre condizioni di crescita, USA300 e USA300saeR/S hanno raggiunto la fase di crescita media-esponenziale dopo circa 135 min di incubazione⁶.
3. Lavare S. aureus a seguito della centrifugazione aspirando il supernatale, risudando i batteri pelleta in 1 mL di DPBS, vorticendo il campione per 30 s, e centrifugeno a 5.000 g per 5 min a temperatura ambiente.
4. Opsonize S. aureus ricomponendo il pellet batterico in 1 mL di 20% siero umano diluito con DPBS e incubato a 37 gradi centigradi con agitazione per 15 min.
5. Centrifuga batteri opsonizzati a 5.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare S. aureus dopo la centrifugazione aspirando il super-natante, rimettendo i batteri pelletati in 1 mL di DPBS, quindi vortice il campione fino a quando il pellet batterico è completamente rotto più altri 30 secondi. Centrifuga batteri a 5.000 g per 5 min a temperatura ambiente.
6. Risospendere opsonizzato ceppi S. aureus in 1 mL RPMI, vortice il campione fino a quando pellet batterico è completamente rotto, e quindi per altri 30 s. Posizionare i batteri sul ghiaccio.
7. Diluiti ceppi S. aureus opsonizzati alla concentrazione desiderata con RPMI ghiacciato. Vortice per 30 s e posto sul ghiaccio.
8. Confermare la concentrazione di S. aureus opsonizzato placcando 1:10 diluizioni seriali di batteri su agar di soia a trittico.
   NOTA: Poiché le differenze nella concentrazione di batteri utilizzati in questa analisi possono avere un impatto importante sulla successiva permeabilità della membrana plasmatica PMN (Figura 3A), è molto importante che la concentrazione di ogni ceppo testato sia determinata per ogni esperimento ed equivalsi tra i ceppi.
9. Aggiungete delicatamente 100 gradi/pozza di ogni ceppo S. aureus o RPMI (per controlli positivi e negativi) alle PMN nella piastra 96-well sul ghiaccio dal punto 1.14. Piastra di roccia delicatamente per distribuire S. aureus in pozzi.
10. Sincronizzare la fagocitosi centrifutrando la piastra a 500 s g per 8 min a 4 gradi^centigradi. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi immediatamente dopo la centrifugazione (T - 0).
11. Nei momenti desiderati, rimuovere la piastra dall'incubatrice e metterla sul ghiaccio. Aggiungere bene 40 -L di 0,5% Triton X-100.
12. Pipette delicatamente i campioni su e giù in ogni pozzo per tirare completamente fuori tutte le PMN aderitate alla piastra, quindi trasferire i campioni a flusso di tubi di citometria sul ghiaccio contenenti 200 L di DPBS ghiacciato con 1 L di propidium iodide.
13. Analizzare i campioni per la colorazione dello ioodio di propidio usando la citometria di flusso, come descritto nel passaggio 2.9.

Results

Abbiamo dimostrato come le procedure descritte sopra possono essere utilizzate per quantificare relativamente la citotossicità di S. aureus contro le PMN umane utilizzando USA300 di tipo MRSA PFGE e unmutante di delezione isogenica di saeR/S in questo ceppo (USA300 szzaeR/S) generata negli studi precedenti 6 . I PMN isolati utilizzando le procedure descritte nella sezione 1 di questo protocollo sono stati macchiati con iodio propidio ed esaminati utilizzando la citometria di flusso. I grafici a dispersione in avanti e laterali sono stati utilizzati per illustrare la contaminazione delle PMN purificate da monociti o linfociti (Figura 1A,B) e l'integrità del PMN è stata determinata utilizzando la colorazione dello iodido di propidio (Figura 1C). Il metodo descritto di purificazione del PMN umano può produrre costantemente 0,5 x 10⁷ a 1 x 10⁸ PMN che sono >98% puri e sono >95% iodidi di propidio negativo.

La citotossicità delle proteine extracellulari prodotte da USA300 e USA300saeR/S è stata testata rispetto alle PMN purificate (Figura 2) seguendo le procedure descritte nella sezione 2 del presente protocollo. Questi esperimenti dimostrano un aumento dipendente dalla concentrazione nella colorazione dello iodio del propidio delle PMN purificate a seguito di 30 min di intossicazione con proteine extracellulari prodotte da USA300 (Figura 2B). Studi precedenti hanno dimostrato che il sistema a due componenti SaeR/S è importante per l'espressione di numerose leucocidine bi-componente destinate alle PMN umane^6,10^,11,16. Congruenti con questi risultati precedenti, sono state rilevate pochissime PMN propidio positivi allo iodio in seguito all'esposizione a proteine extracellulari prodotte da USA300saeR/S (Figura 2B). Ulteriori esperimenti hanno dimostrato un costante aumento della percentuale di PMN lismi dopo l'intossicazione da parte delle proteine extracellulari USA300 che si sono stabilizzati dopo circa 30 min (Figura 2C). La lisi minima delle PMN umane è stata notata in tutti i tempi in seguito all'esposizione a proteine extracellulari prodotte da USA300saeR/S. Questi risultati illustrano l'utilità di questo saggio per la quantificazione relativa della citotossicità da parte delle proteine extracellulari S. aureus contro le PMN umane.

Abbiamo testato USA300 e USA300saeR/S utilizzando il saggio S. aureus cytotoxicity contro le PMN umane dopo la fagocitosi descritta nella sezione 3 di questo protocollo (Figura 3). Un aumento dipendente dalla concentrazione nella percentuale di PMN positivi allo iodio propidio è stato osservato 90 min dopo la fagocitosi dell'USA300 (Figura 3A). Si è osservata una diminuzione significativa della percentuale di PMN che erano positivi al propidio iodide positivo dopo la fagocitosi dell'USA300-saeR/S (Figura 3A), a sostegno di altri risultati che indicano che il sistema saeR/S bicomponente è importante per la citotossicisia di S. aureus contro le PMN umane (Figura 2)^7. Come accennato e dimostrato in precedenza nella Figura 3A, le differenze nella concentrazione di S. aureus hanno un impatto pronunciato sulla lisi di PMN dopo la fagocitosi. L'enumerazione dell'inoculum USA300 e USA300 -saeR/S utilizzato in ciascuno di questi esperimenti ha dimostrato che il contrasto nella citotossicità tra questi ceppi non era dovuto alle differenze nella concentrazione di batteri utilizzati (Figura 3B). Questi risultati mostrano come il saggio di citotossicità di S. aureus citotossicità contro le PMN umane dopo la fagocitosi possa essere utilizzato per valutare la capacità di diversi ceppi S. aureus di compromettere l'integrità umana della membrana plasmatica PMN.

Figura 1: analisi della citometria di flusso delle PMN purificate. Rappresentativi della citometria di punti di PMN umani (A) e di PMN(B)che sono stati volutamente contaminati da cellule mononucleari periferiche del sangue. (C) Istogramma di citometria rappresentativo della citometria che dimostra una colorazione minima di iodio di propidio (<1%) di PMN purificati (grigio scuro) rispetto ai PMN trattati con 0,05% Triton X-100 (rosso scuro). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi della citometria di flusso di PMN intossicati da proteine extracellulari prodotte da S. aureus. (A) Istogramma di citometria di flusso rappresentativo dei PMN macchiati con iodino propidio dopo 30 min di incubazione con controllo dei supporti (blu ombreggiato), filtrato supernata USA300 ad una concentrazione finale di 1:110 (grigio ombreggiato), o 0,05% Triton X-100 (rosso ombreggiato). (B) La percentuale di PMN positivi allo iodio di propidio dopo 30 min di incubazione con diverse concentrazioni di USA300 o USA300saeR/S supernatants. (C) La percentuale di PMN positivi di iodio propidio nel tempo a seguito dell'incubazione con USA300 o USA300,saeR/S supernatant ad una concentrazione finale di 1:110. I dati sono presentati come media: SEM di almeno 3 esperimenti separati con , come determinato dal test t a due code, viene presentato da un SEM di almeno 3 esperimenti separati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi della citometria di flusso delle PMN dopo la fagocitosi di S. aureus. (A) La percentuale di PMN positivi di propidio iodide 90 min dopo la fagocitosi di diverse concentrazioni di USA300 o USA300saeR/S ( B) Concentrazione di ceppi S. aureus opsonizzati utilizzati per gli esperimenti mostrati nel pannello A. I dati sono presentati come media di 4 esperimenti separati con . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo descrive la purificazione dei PMN dal sangue umano e due saggi distinti che utilizzano ioduro propidio per quantificare la citotossicità di S. aureus contro queste importanti cellule immunitarie innate. Il successo di queste procedure dipenderà dalla qualità delle PMN purificate e dall'adeguata preparazione delle proteine S. aureus ed extracellulari prodotte da questo agente patogeno. Per l'isolamento delle PMN, è importante ridurre al minimo l'attivazione di PMN durante e dopo la purificazione utilizzando reagenti privi di contaminazione da endotossina, trattando delicatamente i preparati delle cellule e mantenendo le cellule alla temperatura appropriata. I segni che indicano l'attivazione delle PMN includono l'agglomeramento delle cellule durante la purificazione e quando più del 5% delle cellule isolate macchie positive per lo iodio propidio. A causa della durata relativamente breve delle PmN, queste cellule devono essere isolate dal sangue umano e testate nello stesso giorno. Le PMN inizieranno a mostrare segni di apoptosi spontanea se lasciati sul ghiaccio per più di 3 h dopo la purificazione. Come accennato in precedenza, è molto importante che ogni preparazione PMN sia attentamente valutata utilizzando l'analisi della citometria di flusso della dispersione in avanti e laterale, nonché la colorazione dello ioodio di propidio per garantire la purezza e l'integrità delle cellule isolate.

L'espressione delle leucocidine bi-componente di S. aureus è responsabile della maggior parte dell'integrità della membrana plasmatica PMN compromessa che si osserva utilizzando i saggi descritti in questo protocollo. Variazione nell'espressione di queste tossine e altri peptidi che formano i pori, come i moduli fenoli-solubili, tra i ceppi di S. aureus produrrà differenze di citotossicità contro le PMN umane. Inoltre, il rapporto tra S. aureus e PMN nei saggi di fagocitosi ha un impatto importante sulla successiva permeabilità della membrana plasmatica PMN (Figura 3A) e questi esperimenti richiedono il raccolto costante di concentrazioni uguali di ogni ceppo S. aureus testato a metà fase di crescita esponenziale utilizzando l'OD₆₀₀ di batteri subcoltivati. Date queste considerazioni, è molto importante definire le curve di crescita per tutti i ceppi che verranno esaminati prima di iniziare i saggi di citotossicità. Non raccomandiamo questi metodi per analizzare S. aureus citotoxicity con ceppi che presentano significative differenze di crescita in vitro.

USA300 è un isolare MRSA virulento che è noto per essere altamente citotossico contro pmN umani¹⁵ e la perdita di SaeR / S in questo ceppo riduce drasticamente la trascrizione di numerose leucidine bi-componente che colpiscono PMN umani^6,12, rendendo questi ceppi ideali per confrontare la citotossicità utilizzando gli spersi. Tuttavia, c'è un'ampia variazione genetica tra diversi isolati di S. aureus e i parametri descritti in questi protocolli potrebbero non portare a cambiamenti sostanziali nella citotossicità contro le PMN umane durante il test di altri ceppi di S. aureus. Personalizzare le condizioni di crescita, i volumi di supernatants aggiunti, o il rapporto tra batteri e PMN può essere richiesto per il successo con questi metodi utilizzando altri ceppi di S. aureus.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, USP, 500 mL Contenitore in plastica VIAFLEX Baxter		2B1323Q	Purificazione PMN
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL con tappi a scatto VWR		89000-044	Utilizzato nelle celle di lavaggio
cloruro di sodio all'1,8%	Sigma-Aldrich	S5150
Provette per coltura 12x75mm	VWR	60818-430	Utilizzato come citometria a flusso provette
20% (p/p) destrano	Sigma-Aldrich	D8802	Purificazione PMN
3125 Contatore di conteggio manuale	Prodotti tracciabili	3125CC	Per il conteggio delle cellule
Provette da centrifuga coniche da 50 mL	VWR	89039-656	Per terreni di dispensazione
Bacto Tryptic Brodo di soia, Digest di soia e caseina Medium	FischerScientific	211823	Per la coltivazione di colture cellulari
Siringhe monouso BD con punte Luer-Lok, 3 mL	FischerScientific	BD 309657	Per filtrare i surnatanti
Emocitometro Bright-Line	Sigma-Aldrich	Z359629	Apparecchio per il conteggio delle cellule
DPBS, 1x (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) con calcio e magnesio	Corning	21-030-CV	Utilizzato nelle celle di lavaggio
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	Purificazione PMN
Fisherbrand Polistirene sterile Pipette sierologiche monouso	FischerScientific	13-678-11E	Per liquido aspirante
Greiner CELLSTAR Piastre a 96 pozzetti	Millipore Sigma	M0687	Piastra per la conservazione di campioni sperimentali
Filtri per siringhe OMICRON	Omicron Scientific	SFPV13R	Per la filtrazione di surnatanti
Propidio ioduro	ThermoFisher Scientific	P3566	Colorazione di DNA impermeabile alla membrana
PYREX Marca 4980 Fiasche di Erlenmeyer	Cole-Parmer	EW-34503-24	Per la crescita di colture cellulari
RPMI 1640, 1X senza L-glutammina, rosso fenolo	Corning	17-105-CV	Utilizzato nelle cellule risolutrici
Acqua sterile per l'irrigazione, USP	Baxter	2F7113	Purificazione
PMNLa pompa per pipette	Bel-Art Products	F37898	Per l'aspirazione di liquidi
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Controllo positivo dell'integrità della membrana