Qui, descriviamo uno strumento di modifica del genoma basato sulla stabilizzazione temporale e condizionale della proteina 9 (Cas9) associata a ripetizione palindromica corta (CRISPR)(Cas9) raggruppata regolarmente intervallata sotto la piccola molecola, Shield-1. Il metodo può essere utilizzato per cellule in coltura e modelli animali.
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Articolo metodologico
Un nuovo toolkit per la valutazione delle funzioni geniche utilizzando la stabilizzazione condizionale Cas9
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnologia clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associata alla proteina 9 (CRISPR/Cas9) è diventata uno strumento di laboratorio prevalente per introdurre modifiche accurate e mirate nel genoma. La sua enorme popolarità e la rapida diffusione sono attribuite alla sua facilità d'uso e precisione rispetto ai suoi predecessori. Tuttavia, l'attivazione costitutiva del sistema ha applicazioni limitate. In questo articolo, descriviamo un nuovo metodo che consente il controllo temporale dell'attività CRISPR / Cas9 basato sulla stabilizzazione condizionale della proteina Cas9. La fusione di un mutante ingegnerizzato della proteina legante la rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) consente la rapida degradazione di Cas9 che a sua volta può essere stabilizzata dalla presenza di un ligando sintetico FKBP12 (Shield-1). A differenza di altri metodi inducibili, questo sistema può essere adattato facilmente per generare sistemi bi-cistronici per co-esprimere DD-Cas9 con un altro gene di interesse, senza regolazione condizionale del secondo gene. Questo metodo consente la generazione di sistemi tracciabili e la manipolazione parallela e indipendente degli alleli presi di mira dalla nucleasi Cas9. La piattaforma di questo metodo può essere utilizzata per l'identificazione sistematica e la caratterizzazione di geni essenziali e l'interrogazione delle interazioni funzionali dei geni in contesti in vitro e in vivo.
Introduzione
CRISPR-Cas9 che sta per"clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9"è stato scoperto per la prima volta come parte di studi sull'immunità adattativa batterica1,2. Oggi, CRISPR / Cas9 è diventato lo strumento più riconosciuto per l'editing genetico programmabile e sono state sviluppate diverse iterazioni del sistema per consentire modulazioni trascrizionali ed epigenetiche3. Questa tecnologia consente la manipolazione genetica altamente precisa di quasi tutte le sequenze di DNA4.
I componenti ....
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Protocollo
1.Il vettore DD-Cas9
- Ottenere il vettore DD-Cas9 da Addgene (DD-Cas9 con sequenza di filler e Venere (EDCPV), Plasmide 90085).
NOTA: Questo è un plasmide lentivirale DD-Cas9 con un promotore U6 che guida la trascrizione dell'RNA a guida singola (sgRNA) mentre il promotore EFS guida la trascrizione DD-Cas9. La sequenza DYKDDDDK (flag-tag) è presente al C-terminale di Cas9 seguita da 2A peptide auto-scissione (P2A) che separa DD-Cas9 e la proteina fluorescente modificata Venere (mVenus).
2. Piccolo design dell'RNA guida (sgRNA)
- Progettare un piccolo RNA guida (sgRNA) che verrà clonato nel vettore DD-Cas9 utilizzan....
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Risultati
Per consentire l'espressione condizionale di Cas9, abbiamo sviluppato un doppio costrutto vettoriale lentivirale costituito da un promotore guidato da U6 per esprimere costitutivamente sgRNA e un promotore core EF-1α per guidare l'espressione della proteina di fusione DD-Cas9 (Figura 1A)19. Come paradigma per illustrare la robustezza e l'efficienza del sistema, abbiamo trasdotto la linea cellulare A549 carcinomatosa polmonare con il co.......
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Discussione
La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la capacità di interrogare funzionalmente i genomi2. Tuttavia, l'inattivazione dei geni spesso si traduce in letalità cellulare, deficit funzionali e difetti dello sviluppo, limitando l'utilità di tali approcci per lo studio delle funzionigeniche 7. Inoltre, l'espressione costitutiva di Cas9 può provocare tossicità e la generazione di effetti fuori bersaglio6. Sono stati sviluppati diversi approcci per contr.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo i precedenti membri del nostro laboratorio e lo scienziato Serif Senturk per il lavoro precedente. Ringraziamo Danilo Segovia per aver letto criticamente questo manoscritto. Questo studio è stato possibile e supportato da Swim Across America e dal programma Cancer Target Discovery and Development Center del National Cancer Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest tampone | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S kit colorimetrico | |
| BCA Pierce | 23225 | ||
| DMEM, glicemia alta, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Kit di estrazione del DNA genomico | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | NEB | M0530S | |
| oligonucleotidi | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polibrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Kit di pulizia del gel | anticorpi secondari Qiagen | 28506 | |
| LICOR | |||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3, cellule batteriche competenti | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR, kit di rilevamento mutazioni | Transgenomico/IDT | ||
| T4, PNK | NEB, | M0201S, | |
| Taq DNA Polimerasi | NEB | M0273S | |
| &alfa;-tubulina [DM1A] mAb di topo | Millipore | CP06-100UG |
Riferimenti
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats....
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