Protocollo di dosing stepwise per aumentare la velocità effettiva nei dati GPCR basati su impeditto per etichetta

Summary

Questo protocollo dimostra la registrazione in tempo reale delle relazioni dose-risposta completa per l'attivazione GPCR indotta da agonisti da un singolo strato di cellule coltivato su un singolo microelettrodo utilizzando misurazioni di impeditto senza etichetta. Il nuovo schema di dosso aumenta significativamente la velocità effettiva senza perdita di risoluzione del tempo.

Abstract

I saggi basati su impedimenti senza etichetta sono sempre più utilizzati per studiare in modo non invasivo l'attivazione di GPCR indotta dal ligando negli esperimenti di coltura cellulare. L'approccio fornisce il monitoraggio delle celle in tempo reale con una risoluzione temporale dipendente dal dispositivo fino a diverse decine di millisecondi ed è altamente automatizzato. Tuttavia, quando i numeri di esempio diventano elevati (ad esempio, studi di risposta alla dose per vari ligandi diversi), il costo per gli array di elettrodi usa e getta e la risoluzione del tempo disponibile per le registrazioni sequenziali bene-bene possono diventare limitanti. Pertanto, noi qui presentiamo un protocollo di addizione agonista seriale che ha il potenziale per aumentare significativamente la produzione di saggi GPCR senza etichette. Utilizzando il protocollo di aggiunta agonista seriale, un agonista GPCR viene aggiunto in sequenza nell'aumentare le concentrazioni a un singolo strato di cellule, monitorando continuamente l'impedimento del campione (modalità agonista). Con questo approccio seriale, è ora possibile stabilire una curva completa dose-risposta per un agonista GPCR da un solo strato di cella singola. Il protocollo di addizione agonista seriale è applicabile a diversi tipi di accoppiamento GPCR, G_q G_i/0 o G_s ed è compatibile con i livelli di espressione ricombinanti ed endogeni del recettore in fase di studio. Anche il blocco del recettore da parte degli antagonisti del GPCR è valutabile (modalità antagonista).

Introduction

Questo rapporto presenta una descrizione dettagliata di un protocollo di addizione seriale sviluppato per la quantificazione dell'attivazione del recettore accoppiato con proteina G (GPCR) indotta dal ligando (GPCR) nelle cellule coltivate con aderenza mediante misurazioni di impedimento senza etichette. I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono coinvolti in una moltitudine di funzioni fisiologiche e malattie umane¹. A causa di questo e della loro buona accessibilità sulla superficie cellulare, i GPCR sono uno dei più importanti bersagli farmacologici. Questa valutazione si riflette in un numero stimato di 700 dollari di farmaci approvati destinati ai GPCR, pari a una quota del 35% su tutti i farmaci commercializzati².

Lo sviluppo di nuovi farmaci comprende due processi centrali: (i) l'identificazione e la caratterizzazione funzionale delle molecole bersaglio biologiche e (ii) la scoperta di nuove sostanze di piombo e il loro sviluppo in farmaci amministrativi. In entrambi i processi, sono necessari metodi efficienti per valutare quantitativamente le interazioni farmaco-bersaglio e la successiva risposta biologica a valle. Diverse fasi del processo di sviluppo di farmaci preclinici fanno uso di diversi metodi di analisi che vanno da studi di interazione biomolecolare tra farmaco e bersaglio, su studi funzionali sulle cellule in coltura, a esperimenti su materiale di organi ascisi o animali interi. Entrambi, il significato fisiologico e la complessità biologica aumentano dal primo al secondo³. Sebbene sia l'obiettivo generale di ridurre al minimo gli esperimenti sugli animali, gli studi farmacologici che utilizzano organi isolati di animali da laboratorio o persino animali interi sono considerati inevitabili per caratterizzare in modo completo nuovi farmaci candidati. In termini di lettura analitica, gli studi di farmacologia degli organi forniscono una risposta funzionale "olistica" dissintesa e integrativa di massima rilevanza fisiologica. Uno svantaggio di tali esperimenti è che non sono compatibili con lo screening ad alta produttività per motivi tecnici ed etici e sono stati in gran parte sostituiti da studi basati sulla coltura delle cellule in vitro⁴.

I metodi per quantificare l'attivazione di GPCR nelle colture cellulari includono diversi saggi chimici basati su etichette, che rilevano specificamente i secondi messaggeri, lo stato di fosforolalazione delle proteine di segnalazione a valle, l'attivazione trascrizionale tramite determinati fattori di trascrizione o il traffico di recettori intracellulari indotti dal ligando^4,5. Uno degli inconvenienti di tali analisi basate su etichette è la necessità di etichettare le cellule con coloranti potenzialmente dannosi o marcatori radioattivi. Ciò richiede spesso l'esecuzione dell'espressione come endpoint-determinazione per un tempo di esposizione che deve essere specificato a priori. L'utilizzo di analisi endpoint basate su etichette soffre di questa tempistica molto limitata e di parte dell'esperimento e del rischio che etichette chimiche e sonde possano interferire con la fisiologia cellulare regolare – potenzialmente inosservata dallo sperimentatore.

Negli ultimi anni sono emersi saggi senza etichette per il monitoraggio dell'attivazione di GPCR, come tecniche basate su impedimento o metodi ottici che applicano griglie di guida d'onda risonanti^5,6. L'etichettatura delle cellule non è richiesta sperimentalmente con questi approcci. Poiché queste letture fisiche operano su segnali a bassa ampiezza, tali metodi sono considerati non invasivi, consentono un monitoraggio continuo delle cellule potenzialmente in tempo reale e il tempo di osservazione è limitato solo dalla coltura cellulare non dalla lettura. Simile alle letture da organi interi, gli approcci senza etichetta segnalano comunemente risposte olistiche cellulari, a valle dell'attivazione del recettore quando l'integrazione lungo l'intera rete di segnalazione porta a cambiamenti dipendenti dal tempo ma piuttosto non specifici nella morfologia cellulare o nella ridistribuzione di massa. Mentre i saggi basati su impedimenti misurano la firma dielettrica delle variazioni della forma cellulare^7,8, le misurazioni utilizzando griglie di guida d'onda risonanti sono sensibili ai cambiamenti nell'indice di rifrazione nell'interfaccia cellulare-substrate derivanti dalla ridistribuzione dinamica della massa (DMR)⁹. Il carattere integrativo rende i metodi privi di etichetta estremamente sensibili agli eventi mediati dal recettore indipendentemente dal tipo(s) di proteina G (G_q, G_i/0, G_s, G_12/13) o z-arrestin coinvolti nella cascata di segnalazione⁶ e adatti per i livelli di espressione endogeni del recettore.

In un saggio standard senza etichetta basato su impedance le cellule sono coltivate aderentemente in piastre multi-bene con elettrodi coplanari a pellicola d'oro depositati sul fondo di ogni pozzo¹⁰. Questi array di elettrodi sono collegati a un analizzatore di impedimenti e le risposte cellulari a uno stimolo sperimentale sono registrate da singoli pozzi da letture di impedimenti risolti nel tempo. In un tipico saggio GPCR un ligando viene aggiunto in concentrazioni singolarmente diverse ad ogni singolo pozzo. Le variazioni indotte dal ligando nel corso del tempo impedibile vengono quindi analizzate rispetto alle caratteristiche della curva come il cambio massimo del segnale, l'area sotto la curva, la variazione del segnale entro un determinato intervallo di tempo o pendenza della curva in un determinato punto temporale, al fine di quantificare la potenza e l'efficacia del ligando¹¹.

Il costo degli array di elettrodi può limitare l'applicazione di questa tecnica nelle campagne di screening ad alta produttività (HTS). Inoltre, con un numero crescente di campioni da seguire in parallelo, il numero di singole misurazioni aumenta e quindi riduce gradualmente la risoluzione del tempo disponibile per ogni pozzo , anche per le registrazioni multicanale all'avanguardia. In tali condizioni le risposte cellulari rapide e transitorie possono sfuggire alla misurazione. Inoltre, quello convenzionale bene – un approccio di concentrazione impone un fattore di tempo e di costo significativo sugli sviluppi perfusi organo su chip o corpo su chip per quanto riguarda la loro idoneità nell'analisi dell'interazione ligand-GPCR.

Per questo motivo, abbiamo sviluppato un protocollo di dosaggio stepwise che consente la registrazione di curve di risposta alla dose completa dell'attivazione GPCR indotta dal ligando in monostrati cellulari coltivati monitorando continuamente l'impedimento di un singolo pozzo mentre la concentrazione agonista aumenta di passo. Il protocollo di addizione agonista seriale aumenta significativamente la produttività per bene da una concentrazione a 10 o più concentrazioni, come mostrato nell'attuale esempio di cellule umane U-373 MG, che endogenamente esprimono il recettore dell'istamina 1 (H1R). Pertanto, il metodo ha il potenziale per migliorare significativamente la produttività negli studi di risposta alla dose senza etichette, mentre la risoluzione del tempo viene mantenuta al massimo strumentale.

Protocol

1. Semina cellulare su array di elettrodi

NOTA: La selezione del layout degli elettrodi è un compromesso tra sensibilità e numero di cellule in studio. Più piccolo è l'elettrodo, più sensibile è la misura, ma minore è il numero di cellule in fase di studio. Per le cellule che mostrano forti fluttuazioni di impeditto nel tempo in condizioni di base, sono preferibili elettrodi più grandi o interdigitati.

1. Preriscaldare tutte le soluzioni necessarie per il passaggio e il semina di cellule standard in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Per i saggi con cellule umane U-373 MG che prende: fosfato tamponato salina (PBS) senza calcio e magnesio, 0.05% (w/v) trypsin, mezzo di coltura cellulare (EMEM minimo dell'Aquila) integrato con il 5% (v/v) siero di vitello fetale (FCS), 2 mM L-glutamina e 100 g/mL penicillina/streptomicina).
2. Sciacquare lo strato cellulare della coltura stock coltivata sul fondo dei flaconi di coltura cellulare convenzionali o piatti con PBS due volte.
3. Rimuovere il PBS, aggiungere la soluzione di orpsina (1 mL per 25 cm²) e lasciare che le cellule si incubano a 37 gradi centigradi per 5 min (si applica alle cellule U-373 MG).
4. Controllo per il distacco completo delle cellule dal fondo del substrato di crescita mediante microscopia.
5. Interrompere la reazione di trypsin non appena le cellule sono completamente staccate aggiungendo 9 mL di mezzo di coltura cellulare per 1 mL di trypsin alla sospensione cellulare. Risciacquare con attenzione le cellule rimanenti dal fondo del substrato di coltura cellulare digitando la sospensione sopra il substrato.
6. Raccogliere la sospensione cellulare con una pipetta e trasferirla in un tubo di centrifugazione (15 mL o 50 mL).
7. Abbassare le cellule con la centrifugazione a 110 x g per 10 min a temperatura ambiente.
8. Rimuovere con attenzione il supernatante e ri-sospendere accuratamente il pellet cellulare nel mezzo di coltura prima di contare le cellule (ad esempio utilizzando un emacytometro per microscopi a contrasto di fase e conteggio manuale).
9. Regolare la sospensione cellulare in base alla densità di cella desiderata. Per esperimenti con cellule U-373 MG, utilizzare 100 000 cellule/cm² per far crescere uno strato di cellule confluenti entro 48 h. Questo si traduce in una densità di cellule di 200 000 celle/mL per array di elettrodi a 8 pozze con un'area di crescita di 0,8 cm² e un volume di pozzo di 400 .L.
   NOTA: per gli esperimenti di attivazione GPCR riproducibili, le cellule dovrebbero essere coltivate a monostrati confluenti sugli array di elettrodi. Per garantire la corretta espressione del recettore sulla superficie cellulare, le cellule devono essere semiate almeno 36 h prima di eseguire l'esperimento. Testare diverse densità cellulari per la semina cellulare è spesso significativo per identificare le migliori condizioni sperimentali.
10. Aggiungere la sospensione cellulare ai pozze dell'array di elettrodi e lasciare che le vendite si stabilizzino a temperatura ambiente per 10 – 15 min al fine di garantire la distribuzione omogenea delle cellule sul fondo dei pozzi.
11. Coltivare cellule per almeno 36 h in un'incubatrice di coltura cellulare standard con 5% di CO₂ (a seconda del tipo medio) a 37 gradi centigradi e atmosfera umidificata. Modificare il mezzo di coltura cellulare 24 h prima dell'esperimento.
12. Il giorno dell'esperimento, ispezionare gli strati cellulari sugli array di elettrodi mediante microscopia (contrasto di fase) per garantire una copertura completa degli elettrodi con le cellule.

2. Equilibration di cellule in mezzo senza siero

1. Mezzo preriscaldato privo di siero, in questo studio: mezzo L15 di Leibovitz.
2. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare dalle cellule coltivate su array di elettrodi e sostituirlo con un mezzo preriscaldato privo di siero. Utilizzare 200 l per le serie di elettrodi di formato 8-well e 150 L per array di elettrodi 96-well.
3. Lasciare che le cellule eclichino in mezzo senza siero a 37 gradi centigradi per almeno 2 h. Il tempo di acquisione dipende fortemente dal tipo di cellula. Ad esempio, le cellule U-373 MG hanno bisogno di 2 h, le cellule CHO hanno bisogno di 4 h, BAEC può richiedere l'equilibratione durante la notte nel mezzo L-15.
   NOTA: il supporto L-15 è indipendente da CO₂ e richiede un'atmosfera senza_CO2. Per l'equilibratore in L-15 impostare l'incubatrice a 0 % CO₂. L'equilibratore può essere monitorato da letture impediti, che si consiglia di fare per i primi esperimenti.

3. Monitoraggio dell'equilibratione cellulare con letture impediti

1. Posizionare l'array di elettrodi nel supporto dell'array di collegamento dell'analizzatore di impedimenti.
2. Assicurare un corretto contatto a basso impedibile tra elettrodi e analizzatore di impedimenti. Questo controllo è individualmente diverso per diversi strumenti.
   NOTA: Se lo strumento non riesce a effettuare il collegamento agli elettrodi, aprire nuovamente il morsetto a contatto, riadattare l'array di elettrodi per il corretto posizionamento all'interno del supporto e riprovare.
3. Selezionare il tipo di elettrodo e/o il formato multi-bene dall'interfaccia utente del software.
4. Impostare i parametri di misurazione. Sono disponibili diverse opzioni.
   NOTA: Per selezionare la frequenza AC più sensibile, ci riferiamo alla letteratura e manuali di strumenti in quanto dipende dal layout dell'elettrodo e dal tipo di cella in studio. In genere, la frequenza di rilevamento è compresa tra 4 kHz – 50 kHz. Qui, le cellule U-373 MG sono state coltivate su elettrodi circolari di 250 m di diametro e sono state monitorate ad una frequenza AC di 12 kHz.
   1. Se sono disponibili modalità di acquisizione dati a frequenza singola e a più frequenze, selezionare la modalità a frequenza singola per garantire la massima risoluzione del tempo. La misurazione verrà eseguita a questa singola frequenza. Per gli strumenti più diffusi, c'è una serie di frequenze preimpostate lungo la finestra di frequenza disponibile.
   2. Se il numero di pozzi in fase di studio è basso o la risoluzione del tempo non è critica, selezionare invece più registrazioni di frequenza. Le letture impennti a un determinato numero di frequenze saranno registrate per ogni pozzo per una successiva analisi approfondita.
      NOTA: la risoluzione temporale diminuisce con un numero crescente di frequenze registrate per pozzo e un numero crescente di pozzetti. Le opzioni per la selezione della modalità di acquisizione della frequenza e dei dati variano in base al tipo e alla versione dello strumento.
5. Avviare l'acquisizione dei dati del corso di tempo.
6. Seguire lo strato cellulare impedire (almeno 2 h) fino a quando l'impedito si è stabilizzato. Nel frattempo, preparate le soluzioni agoniste.
7. Quando gli strati cellulari hanno raggiunto un livello di impedimento stabile, (i) procedere all'aggiunta agonista seriale all'interno dello stesso esperimento o (ii) terminare l'acquisizione dei dati e avviare un nuovo set di dati per il monitoraggio dell'attivazione del recettore indotta dall'agonista.

4. Preparazione di soluzioni agoniste per esperimenti in modalità agonista

1. Calcolare la concentrazione di soluzioni agoniste secondo necessità per ogni fase del dosing seriale in base all'equazione (1). n varia da 1 al numero totale di aggiunte seriali i. x denota concentrazione e volume nel pozzo al passo n. y denota concentrazione e volume della "soluzione da aggiungere" nel passaggio n.

NOTA: considerare il numero di repliche e calcolare il volume totale di "soluzione da aggiungere" per ogni fase di concentrazione. I risultati di un calcolo tipico sono riportati nelle tabelle 1-4. Ci vuole un'idea generale circa la gamma di concentrazione agonista per essere studiato come la gamma definisce le concentrazioni e il numero di porzioni da somministrare durante l'addizione seriale. Utilizzando il protocollo di addizione agonista seriale la concentrazione agonista è aumentata passo avanti. Pertanto, la quantità di agonista già nel pozzo quando viene aggiunta la dose successiva deve essere presa in considerazione. Quando il numero di molecole agoniste presenti già nel pozzo è n_x c_x x_{V x} (con la concentrazione corrente c_{x x} e volume V_x) e il numero di molecole nel pozzo dopo la prossima aggiunta è n_x-y, il numero di molecole da aggiungere n_y è determinato dalla concentrazione c_y e dal volume V_y della soluzione da applicare al pozzo (n_y - c_y y_y). Dopo aver aggiunto una porzione di agonista, la nuova quantità di molecole agoniste nel pozzo è: c_x Questo calcolo si applica per ogni passaggio successivo. A causa dell'interdipendenza della concentrazione agonista nel pozzo e della quantità di agonista nelle porzioni da aggiungere ad ogni passo, è importante definire le concentrazioni finali dopo ogni passo in anticipo.

Modalità 1: Il volume nel pozzo aumenterà ad ogni passo come liquido viene continuamente aggiunto.
Utilizzando questa modalità e un formato a 8 bengeti, utilizzare V_x1 , 200 L e V_{y1 ....} V_yi , 30 L.

Modalità 2: Il volume nel pozzo è costante in quanto il volume aggiunto con ogni passaggio viene rimosso appena prima dell'aggiunta successiva.
Utilizzando questa modalità e un formato di 96 pozze, utilizzare V_x1 , 150 L e V_{y1 ....} V_yi , 75 L.

2. Stampare la scheda dati con il volume totale per concentrazione e istruzioni dettagliate per la pipettatura.
3. Preparare tutte le soluzioni nella quantità richiesta. Rendere tutte le soluzioni agoniste nello stesso mezzo senza siero utilizzato per l'equilibratione delle cellule.
   AGGIORNAMENTO: Il dihydrochlor di istamina è considerato pericoloso dallo standard di comunicazione di pericolo 2012 OSHA (29 CFR 1910.1200). L'istamina provoca irritazione cutanea, grave irritazione oculare, può causare una reazione allergica della pelle, allergia, sintomi di asma o difficoltà respiratorie se inalato e può causare irritazione respiratoria. Si prega di prendere in considerazione la scheda dati di sicurezza.
   NOTA: Rendere le soluzioni agoniste il più fresche possibile. La stabilità degli agonisti in soluzione può variare considerevolmente. Conservare le soluzioni a 4 gradi centigradi o inferiori fino all'utilizzo nell'esperimento. Per alcune molecole ulteriori additivi stabilizzanti, come BSA quando si utilizzano molecole a base di peptidi o lipidi, può essere considerato per prevenire l'assorbemento alle pareti di pozzi e tubi.
4. Se si esegue l'esperimento in formato 96 pozzetti, trasferire le soluzioni a una piastra convenzionale da 96 pozzetti (senza elettrodi) e utilizzare un tubo di canale 8 (o 12) per un rapido trasferimento di liquidi all'array di elettrodi.

5. Preparazione di soluzioni agonistiche per l'esperimento in modalità antagonista

NOTA: Preparare la soluzione (o le soluzioni antagoniste) con la concentrazione da applicare in tutto. Il volume e la concentrazione della soluzione antagonista dipendono dalla modalità di addizione agonista (1 o 2). Esempi di esperimenti in formato 8-pozzo o 96-pozzi in modalità di addizione 2: (A) formato 8 pozzetto (V_x1 - 200 -L, V_Antagonist - 200 -L); (B) Formato 96-pozzo (V_x1 : 150 - L, V_Antagonista - 75 L).

1. Calcolare la concentrazione di ogni soluzione agonista necessaria per ogni fase del dosamento seriale come descritto nel passaggio 4.1.
2. Rendere tutte le soluzioni agoniste nello stesso mezzo senza siero utilizzato per l'equilibratione delle cellule e aggiungere l'antagonista alla stessa concentrazione finale come previsto per i rispettivi pozzi nell'esperimento.
   NOTA: In questo caso la soluzione di riserva di istamina (10 mM) viene preparata nel mezzo L-15. Quando gli agonisti sono dissolti in altri solventi (ad esempio, sulfoxid dimetilico (DMSO), deve essere incluso un controllo del solvente per tenere conto dell'aumento del carico di solvente ad ogni fase dell'addizione.

6. Esecuzione del protocollo di addizione seriale in modalità agonista

1. Avviare l'acquisizione dei dati come descritto nei passaggi da 3.1 a 3.5.
2. Preriscaldare le soluzioni agoniste prima dell'uso mettendole nell'incubatrice circa 10 – 15 min prima dell'aggiunta.
   NOTA: Quando si utilizzano sostanze termolabili, le soluzioni non devono essere mantenute a 37 gradi centigradi per troppo tempo. Se il preriscaldamento per 10 – 15 min è considerato critico, portare soluzioni a 37 gradi centigradi poco prima dell'aggiunta in un bagno d'acqua.
3. Eseguire il dosing seriale agonista a seconda della modalità di aggiunta selezionata. Seguendo la modalità 1 il volume totale nel pozzo aumenta con ogni aggiunta della dose successiva. In modalità 2 lo stesso volume che viene aggiunto con ogni passo viene rimosso di nuovo appena prima di aggiungere la dose successiva più alta.
   NOTA: il tempo necessario per l'equilibrato dello strato cellulare tra due dosi agoniste successive dipende dal tempo di risposta delle cellule. Un esperimento iniziale in modalità parallela (un pozzo – una concentrazione) rivela (i) i tempi di risposta cellulare per diverse concentrazioni agoniste e (ii) il parametro della curva più sensibile (ad esempio, impedire il massimo, impedire dopo il tempo x).

A: Formato Mode 1 / 8-well

1. Aggiungere 30 l della prima soluzione con la più bassa concentrazione di agonista alle cellule che sono state equilibrate in 200 l di mezzo senza sieri.
2. Lascia che le cellule rispondano ed equilichino per il periodo di tempo predefinito (ad es. 15 min).
3. Aggiungere 30 -L della seconda soluzione con la successiva concentrazione più alta.
4. Ripetere i passaggi 6.3.1-6.3.3 con la terza, la quarta e così via, la soluzione agonista.
   NOTA: L'utilizzo di 10 fasi di concentrazione comporterà un volume totale di 500 gradi alla fine dell'esperimento, appena al di sotto del volume massimo applicabile di questi pozze di questi pozzi di 550 dollari.

B: Mode 2 / 96-bene formato

NOTA: Sospendere l'acquisizione dei dati durante ogni fase di movimentazione del liquido (aggiunta/rimozione) tramite il software dello strumento di impedimento durante l'esecuzione di esperimenti in formato 96-well. La gestione più elaborata del liquido può interferire con l'acquisizione dei dati. Utilizzare una pipetta multicanale.

1. Sospendere l'acquisizione dei dati.
2. Aggiungere 75 l della prima soluzione con la più bassa concentrazione di agonista alle cellule che sono state equilibrate in 150 gradi di mezzo senza sieri.
3. Riprendere l'acquisizione dei dati.
4. Lascia che le cellule rispondano ed equilichino per il periodo di tempo predefinito (ad es. 15 min).
5. Circa 1 – 2 min prima del normale tempo di equilibratore, mettere in pausa la misura e rimuovere 75 l da ogni pozzo.
   NOTA: il punto temporale in cui la soluzione deve essere rimossa dipende dal numero di pozzi monitorati in parallelo e dalla velocità di tubazione. Il tempo necessario per la rimozione delle soluzioni non deve superare il tempo tra i passaggi successivi.
6. Aggiungere 75 l della seconda soluzione con la successiva concentrazione più alta e riprendere la misurazione.
7. Ripetere i passaggi 6.3.8-6.3.10 con la terza, la quarta e così via, la soluzione agonista.

7. Esecuzione del protocollo di addizione seriale in modalità antagonista

1. Avviare la misurazione come descritto nei passaggi da 3.1 a 3.5.
2. Durante l'equilibratura degli strati cellulari, preparare la soluzione antagonista (ad esempio, 200 -L di 1,5 M di cloridrato di phenhydramina nel mezzo L15).
   AVVISO: L'idrocloruro difenidrina ha potenziali effetti acuti sulla salute. È dannoso se ingerita o inalata, può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Può causare irritazione del tratto respiratorio e digestivo. Si prega di prendere in considerazione la scheda dati di sicurezza.
3. Preriscaldare le soluzioni antagoniste e agonistamettendole mettendole nell'incubatrice circa 10 – 15 min prima dell'aggiunta alle colture cellulari (cfr 6.2). Se nell'antagonista sono inclusi anche pozzi privi di antagoni, anche i mezzi preriscaldati senza siero.
4. Aggiungere la soluzione antagonista ai pozzi designati. Lasciate che le cellule eclichiamo con antagonista per 15 –20 min. Se sono inclusi pozzi senza antagoni, aggiungere lo stesso volume di mezzo senza siero a questi pozzi.
5. Secondo l'aggiunta di antagonista in modalità 2, rimuovere la soluzione dai pozzi
   (A) Formato a 8 pozzetto (200 -L)
   (B) Formato 96 pozzi (75 l)
6. Eseguire la sequenza di addizione agonista come descritto nel passaggio 6.3.

8. Esportazione e analisi dei dati

1. Esportare i dati utilizzando il software dello strumento di impeditto al fine di convertire tutti i dati registrati da proprietari in formati di dati comuni (ad esempio, csv). Questo passaggio consente la riorganizzazione dei dati e la presentazione con altri pacchetti software.
2. Caricare i dati in formato csv nel software di analisi scientifica dei dati.
3. Normalizzare i valori impediti sottraendo l'impedimento dell'ultimo punto dati prima della prima aggiunta di soluzione agonista e impostando l'ora di addizione su t - 0. Tracciare il corso temporale dell'impedimento normalizzato.
4. Tracciare i singoli corsi temporali e identificare il massimo in impedendo dopo ogni fase di addizione. Comporre un foglio dati con questi valori.
5. Tracciare i valori del massimo (o minimo, se applicabile) impedendo i cambiamenti in funzione della concentrazione agonista. Questo può essere fatto per singoli pozzi o per le medie (media - SD).
6. Utilizzare una routine di adattamento dei dati per determinare le concentrazioni effettive a metà massima (EC₅₀) e la risposta massima (E_Max) utilizzando il modello logistico a quattro parametri (equazione 2):

NOTA: c indica la concentrazione agonista, A₁ è il minimo e A₂ è l'asintote massimo della curva sigmoidaldose-risposta (A₂ e E_Max). EC₅₀ è la concentrazione nel punto di inflessione della curva, e n corrisponde al pendio collinare.

Results

Uno schema tipico per la preparazione delle varie soluzioni agonista è mostrato per un esperimento utilizzando 8-well array di elettrodi con istamina come agonista nelle tabelle 1-4. La tabella 1 e la tabella 2 presentano i volumi e le concentrazioni per un esperimento che utilizza la modalità di addizione 1 (cfr., figura 1), mentre la tabella 3 e la tabella 4 presentano volumi e concentrazi...

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per le misurazioni di impeditto senza etichetta per determinare la relazione dose-risposta dell'attivazione GPCR indotta da agonisti in assenza o presenza di antagonisti specifici per lo stesso recettore. La prova di concetto di questo metodo è stata presentata in una recente pubblicazione¹². Per quanto ne sappiamo, è il primo studio che descrive l'istituzione di una curva dose-risposta completa di attivazione GPCR mediata da agonisti utilizzando un singolo str...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bü camera di conteggio	Marienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Germania)	640210
fiasche per colture cellulari 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germania)	690175
Incubatore cellulare (Heraeus Function Line BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germania)	\
Centrifuga (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germania)	\
Difenidramina cloridrato	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania)	D3630
Eagle's Minimum Essential Medium con 4,5 g/L di D-glucosio e 2,2 g/L di NaHCO3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania)	D5671
Impedance Instrument (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\
Array di elettrodi a 8 pozzetti (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	Base in PET con elettrodo di lavoro da 0,049 mm2 e controelettrodo da ~50 mm2 (oro)
Array di elettrodi a 96 pozzetti (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	Base in PET con due elettrodi (oro) con 0,256 mm2 area totale dell'elettrodo
Siero fetale di vitello (FCS)	Biochrom (Berlino, Germania)	S0615
Istamina dicloridrato	Carl Roth (Karlsruhe, Germania)	4017.1
Cappa a flusso laminare (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Germania)	51022515	cabina di sicurezza di classe II
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Germania)	21083-027
L-glutammina	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania)	G7513
Micropipetta grande (100 - 1000 &; L)	Brandt (Wertheim, Germania)	704780
Micropipetta grande (20 - 200 &; micro; L)	Brandt (Wertheim, Germania)	704778
Microscopio (contrasto di fase, Nikon Diaphot)	Nikon (Dü sseldorf, Germania)
Penicillina/streptomicina	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania)	P0781
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania)	D8537
Pipetta, sierologica	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germania)	607 180
Pipettor (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Germania)	26300
Tripsina	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania)	T4174	in PBS con 1 mM di provetta EDTA
, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germania)	188 271
Provetta, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Germania)	210 261
cellule U-373 MG	ATCC (Rockville, MD, USA)	ATCC HTB-17
bagno d'acqua (TW21)	Julabo (Seelbach, Germania)	\