Articolo metodologico
Questo protocollo dimostra la registrazione in tempo reale delle relazioni dose-risposta completa per l'attivazione GPCR indotta da agonisti da un singolo strato di cellule coltivato su un singolo microelettrodo utilizzando misurazioni di impeditto senza etichetta. Il nuovo schema di dosso aumenta significativamente la velocità effettiva senza perdita di risoluzione del tempo.
I saggi basati su impedimenti senza etichetta sono sempre più utilizzati per studiare in modo non invasivo l'attivazione di GPCR indotta dal ligando negli esperimenti di coltura cellulare. L'approccio fornisce il monitoraggio delle celle in tempo reale con una risoluzione temporale dipendente dal dispositivo fino a diverse decine di millisecondi ed è altamente automatizzato. Tuttavia, quando i numeri di esempio diventano elevati (ad esempio, studi di risposta alla dose per vari ligandi diversi), il costo per gli array di elettrodi usa e getta e la risoluzione del tempo disponibile per le registrazioni sequenziali bene-bene possono diventare limitanti. Pertanto, noi qui presentiamo un protocollo di addizione agonista seriale che ha il potenziale per aumentare significativamente la produzione di saggi GPCR senza etichette. Utilizzando il protocollo di aggiunta agonista seriale, un agonista GPCR viene aggiunto in sequenza nell'aumentare le concentrazioni a un singolo strato di cellule, monitorando continuamente l'impedimento del campione (modalità agonista). Con questo approccio seriale, è ora possibile stabilire una curva completa dose-risposta per un agonista GPCR da un solo strato di cella singola. Il protocollo di addizione agonista seriale è applicabile a diversi tipi di accoppiamento GPCR, Gq Gi/0 o Gs ed è compatibile con i livelli di espressione ricombinanti ed endogeni del recettore in fase di studio. Anche il blocco del recettore da parte degli antagonisti del GPCR è valutabile (modalità antagonista).
Questo rapporto presenta una descrizione dettagliata di un protocollo di addizione seriale sviluppato per la quantificazione dell'attivazione del recettore accoppiato con proteina G (GPCR) indotta dal ligando (GPCR) nelle cellule coltivate con aderenza mediante misurazioni di impedimento senza etichette. I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono coinvolti in una moltitudine di funzioni fisiologiche e malattie umane1. A causa di questo e della loro buona accessibilità sulla superficie cellulare, i GPCR sono uno dei più importanti bersagli farmacologici. Questa valutazione si riflette in un numero stimato di 700 dollari di farmaci approvati....
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1. Semina cellulare su array di elettrodi
NOTA: La selezione del layout degli elettrodi è un compromesso tra sensibilità e numero di cellule in studio. Più piccolo è l'elettrodo, più sensibile è la misura, ma minore è il numero di cellule in fase di studio. Per le cellule che mostrano forti fluttuazioni di impeditto nel tempo in condizioni di base, sono preferibili elettrodi più grandi o interdigitati.
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Uno schema tipico per la preparazione delle varie soluzioni agonista è mostrato per un esperimento utilizzando 8-well array di elettrodi con istamina come agonista nelle tabelle 1-4. La tabella 1 e la tabella 2 presentano i volumi e le concentrazioni per un esperimento che utilizza la modalità di addizione 1 (cfr., figura 1), mentre la tabella 3 e la tabella 4 presentano volumi e concentrazi.......
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Questo protocollo descrive un metodo per le misurazioni di impeditto senza etichetta per determinare la relazione dose-risposta dell'attivazione GPCR indotta da agonisti in assenza o presenza di antagonisti specifici per lo stesso recettore. La prova di concetto di questo metodo è stata presentata in una recente pubblicazione12. Per quanto ne sappiamo, è il primo studio che descrive l'istituzione di una curva dose-risposta completa di attivazione GPCR mediata da agonisti utilizzando un singolo str.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamo Barbara Goricnick e Nadja Hinterreiter per il loro aiuto nella coltura cellulare e nella preparazione di soluzioni sperimentali. Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario del Gruppo di formazione della ricerca 1910 "Chimica medicinale dei ligandi SElettivi di GPCR" finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) con il numero di sovvenzione 222125149. JAS è particolarmente grato per una borsa di studio concessa dal Programma bavarese per l'uguaglianza di genere.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bü camera di conteggio | Marienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Germania) | 640210 | |
| fiasche per colture cellulari 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germania) | 690175 | |
| Incubatore cellulare (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germania) | \ | |
| Centrifuga (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germania) | \ | |
| Difenidramina cloridrato | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium con 4,5 g/L di D-glucosio e 2,2 g/L di NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| Array di elettrodi a 8 pozzetti (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | Base in PET con elettrodo di lavoro da 0,049 mm2 e controelettrodo da ~50 mm2 (oro) |
| Array di elettrodi a 96 pozzetti (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | Base in PET con due elettrodi (oro) con 0,256 mm2 area totale dell'elettrodo |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Biochrom (Berlino, Germania) | S0615 | |
| Istamina dicloridrato | Carl Roth (Karlsruhe, Germania) | 4017.1 | |
| Cappa a flusso laminare (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germania) | 51022515 | cabina di sicurezza di classe II |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germania) | 21083-027 | |
| L-glutammina | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania) | G7513 | |
| Micropipetta grande (100 - 1000 &; L) | Brandt (Wertheim, Germania) | 704780 | |
| Micropipetta grande (20 - 200 &; micro; L) | Brandt (Wertheim, Germania) | 704778 | |
| Microscopio (contrasto di fase, Nikon Diaphot) | Nikon (Dü sseldorf, Germania) | ||
| Penicillina/streptomicina | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania) | P0781 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania) | D8537 | |
| Pipetta, sierologica | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germania) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germania) | 26300 | |
| Tripsina | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germania) | T4174 | in PBS con 1 mM di provetta EDTA |
| , 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germania) | 188 271 | |
| Provetta, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germania) | 210 261 | |
| cellule U-373 MG | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| bagno d'acqua (TW21) | Julabo (Seelbach, Germania) | \ |
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