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Articolo metodologico

Isolamento, cultura e induzione adipogenica di cellule staminali adipose originali adipose-derivate da cellule staminali periaortiche

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DOI:

10.3791/60691

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2 marzo 2020

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1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, 2Shanghai Institute of Nutrition and Health, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3Shanghai Key Laboratory of Hypertension, Shanghai Institute of Hypertension, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Department of Cardiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Department of Cardiology, Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica delle cellule staminali derivate dalla cresta neurale derivate da cellule staminali derivate da adiposo (NCADSC) dal tessuto adiposo periaortico del Wnt-1Cre Topi Rosa26RFP/z. Le NCADSC possono essere una fonte facilmente accessibile di ADSC per la modellazione dell'adipogenesi o della lipogenesi in vitro.

Abstract

Una quantità eccessiva di tessuto adiposo che circonda i vasi sanguigni (tessuto adiposo perivascolare, noto anche come PVAT) è associato ad un alto rischio di malattie cardiovascolari. Gli ADSC derivati da diversi tessuti adiposi mostrano caratteristiche distinte, e quelli del PVAT non sono stati ben caratterizzati. In un recente studio, abbiamo riferito che alcuni ADSC nel tessuto adiposo arco periaortico (PAAT) discendono dalle cellule della cresta neurale (NCC), una popolazione transitoria di cellule migratorie provenienti dall'ectoderma.

In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'isolamento delle cCI con etichettatura RFP (proteina fluorescente rossa) dal PAAT del Wnt-1Cre MiriRosa26 RFP/z e inducendo ne la differenziazione adipogenica in vitro. In breve, la frazione vascolare stromale (SVF) è enzimaticamente dissociata dal PAAT, e la RFP- ADSC derivato dalla cresta neurale (NCADSC) sono isolati dalla fluorescenza activated cell sorting (FACS). Le NCADSC si differenziano in adipociti sia marroni che bianchi, possono essere crioconservate e mantenere il loro potenziale adipogenico per passaggi da 3 a 5 dollari. Il nostro protocollo può generare ABbondanti ADSC dal PVAT per la modellazione dell'adipogenesi PVAT o della lipogenesi in vitro. Pertanto, queste NCADSC possono fornire un valido sistema per studiare gli interruttori molecolari coinvolti nella differenziazione PVAT.

Introduzione

La prevalenza dell'obesità è in aumento in tutto il mondo, il che aumenta il rischio di malattie croniche correlate, tra cui malattie cardiovascolari e diabete1. IL PVAT circonda i vasi sanguigni ed è una delle principali fonti di fattori endocrini e paracrini coinvolti nella funzione di vascolatura. Studi clinici dimostrano che l'elevato contenuto di PVAT è un fattore di rischio indipendente della malattia cardiovascolare2,3, e la sua funzione patologica dipende dal fenotipo delle cellule staminali derivate da adiposa costitutive (ADSC)4.

Anche se le linee cellulari ADSC come il murino 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sono utili modelli cellulari per studiare l'adipogenesi o la lipogenesi5, i meccanismi regolatori per l'adipogenesi differiscono tra le linee cellulari e le cellule primarie. Gli ADSC nella frazione di cellula vascolare stromale (SVF) isolati direttamente dai tessuti adiposi e indotti a differenziarsi in adipociti molto probabilmente ricapitolano in vivo adipogenesi e lipogenesi6. Tuttavia, la fragilità, la galleggiabilità e le variazioni di dimensioni e immunofenotipi degli ADSC rendono difficile il loro isolamento diretto. Inoltre, le diverse procedure di isolamento possono anche influenzare in modo significativo il fenotipo e la capacità potenziale adipogenica di queste cellule7, sottolineando così la necessità di un protocollo che mantenga l'integrità dell'ADSC.

Il tessuto adiposo è tipicamente classificato come il tessuto adiposo bianco (WAT) morfologicamente e funzionalmente distinto, o il tessuto adiposo marrone (BAT)8, che ospita ADSC distinti9. Mentre gli ADSC isolati dai WAT sottocutanei perigonadali e inguinali sono stati caratterizzati negli studi precedenti9,10,11,12, meno è noto per quanto riguarda gli ADSC da PVAT che è composto principalmente da BAT13.

In uno studio recente, abbiamo scoperto che una parte degli ADSC residenti nel tessuto adiposo dell'arco periaortico (PAAT) è derivata da cellule della cresta neurale (NCC), una popolazione transitoria di cellule progenitrici migratorie che provengono dall'ectoderma14,15. I topi transgenici Wnt1-Cre sono stati utilizzati per tracciare lo sviluppo delle cellule della cresta neurale16,17. Abbiamo attraversatoi topi Wnt1-Cre con i topi Rosa26RFP/ s per generare Wnt-1Cre. I topi Rosa26RFP/z, in cui gli NCC e i loro discendenti sono etichettati con proteine fluorescenti rosse (RFP) e sono facilmente rintracciabili in vivo e in vitro15. In questo articolo viene descritto un metodo per isolare gli ADSC derivati dalla cresta neurale (ADSC derivati da NC o NCADSC) dal PAAT del topo e induriamo gli NCADSC a differenziarsi in adipociti bianchi o adipociti bruni.

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Protocollo

Il protocollo sugli animali è stato rivisto e approvato dal Comitato per la cura degli animali della Shanghai Jiao Tong University.

1. Generazione di Wnt-1Cre Rosa26RfP/ Topi

  1. Cross Wnt-1 Cre1 - Topi16 con rosa26RFP / mouse18 per generare Wnt-1 Cre. Topi Rosa26RFP/z. I topi della casa in un ciclo di luce/buio di 12 h in una struttura priva di agenti patogeni a 25 gradi centigradi e il 45% di umidità fino a 4-8 settimane.

2. Dissezione del PAAT

NOTA: vedere la figura 1.

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (ad es. forbici chirurgiche, pinze standard e forbici microchirurgiche e pinze) autoclando a 121 gradi centigradi per 30 min.
  2. Preparare il mezzo di digestione (High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium [HDMEM] contenente 2 mg/mL di tipo I). Preparare il mezzo di coltura (HDMEM contenente 10% siero bovino fetale [FBS] e 1% v/v penicillina-streptomycin [PS]). Sterilizzare utilizzando un filtro di siringa da 0,22 m prima dell'uso.
  3. Sterilizzare i reagenti di coltura cellulare utilizzando UV, etanolo, filtrazione o vapore, a seconda dei casi.
  4. Preparare un piatto Petri con Hanks' Balanced Saline Solution (HBSS) e un tubo conico da 15 mL con 10 mL di HBSS integrato con 1% v/v di soluzione PS. Tienili entrambi sul ghiaccio.
  5. Anestesizzare i topi15 con isoflurane e sacrificio per lussazione cervicale. Immergere i corpi in un bicchiere riempito con 75% alcol (200 mL) per 5 min per sterilizzare la superficie della pelle.
  6. Tagliare e separare la pelle sull'addome e tagliare lungo la linea mediana ventrale dal bacino al collo. Aprire l'addome e spostare il fegato per esporre il diaframma19.
  7. Tagliare il diaframma e le costole su entrambi i lati della linea mediana ed esporre il cuore e i polmoni sbucciando le costole.
  8. Rimuovere il polmone e il timo ed estrarre il PAAT insieme all'aorta e al cuore.
  9. Tagliare l'aorta alla radice aortica per rimuovere il cuore. Fai un taglio tra l'arco aortico e l'aorta discendente e separa con cura il tessuto adiposo che circonda entrambe le strutture e le arterie carotidecomuni sinistra e destra dalla parete toracica posteriore. Trasferire il tessuto nel tampone HBSS ghiacciato nella parabola Petri.
  10. Utilizzando pinze sterili, rimuovere la maggior parte della vascolatura (ad esempio, aorta, arterie carotide comuni e altre piccole vascolarizzazioni) e fasciatura possibile, e trasferire il tessuto adiposo nei tubi Eppendorf 2 mL contengono 0,5 mL di ghiaccio-freddo GNS buffer sul ghiaccio.

3. Isolamento dell'SVF

Raccogliere il PAAT di 5-6 topi in un tubo di microcentrifuga da 2 mL contenente 1 mL di digestione appena preparato medio e tritare il tessuto utilizzando forbici chirurgiche in un tubo Eppendorf a temperatura ambiente (RT).

  1. Trasferire la miscela in tubi da 50 mL contenenti 9 mL del mezzo di digestione. Omogeneizzare i tessuti pipetting su e giù con una pipetta da 1 mL 10x.
  2. Incubare i tubi a 37 gradi centigradi con agitazione costante a 100 giri/mm per 30-45 min e controllare ogni 5-10 min per evitare disgestione eccessiva. Questo è fondamentale per migliorare la vitalità e la resa delle cellule.
    NOTA: Una buona digestione dei tessuti si tradurrà in un tessuto omologioso, giallo chiaro, visibile ad occhio nudo dopo aver vorticoso delicatamente il tubo.
  3. Interrompere la digestione aggiungendo 5 mL di HDMEM contenente 10% FBS e 1% v/v PS a RT e mescolare bene con il pipettaggio.
  4. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min a RT. L'SVF sarà visibile come pellet bruna. Aspirare con attenzione gli adipociti galleggianti e decantare il rimanente super-natante senza disturbare la SVF. Sciogliere il pellet SVF in 10 mL di mezzo di coltura e filtrare attraverso un colino cellulare di 70 m.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 5 mL di tampone di lisi eritrocite in un tubo conico da 15 mL per 10 min a RT.
  6. Interrompere la reazione aggiungendo 10 mL di 1x PBS contenente 1% FBS. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in 10 mL di 1x PBS contenente 1% FBS.
  7. Centrifugare nuovamente le cellule a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di mezzo di coltura in un tubo conico da 15 mL a 4 gradi centigradi.
  8. Dopo un ultimo round di centrifugazione (500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi), risospendere le cellule sventate in 5 mL di buffer FACS (PBS contenente 10% FBS, 100 unità/mL DNA I e 1% v/v PS) sul ghiaccio e contare le cellule con un emocitometro.

4. Isolamento degli NCADSC da parte di FACS

  1. Impostare e ottimizzare la selezione delle celle seguendo il manuale di istruzioni. Selezionare l'ugello di 100 m, sterilizzare i tubi di raccolta, installare il dispositivo di raccolta richiesto e impostare i flussi laterali20.
  2. Per l'ordinamento dellecelle RFP sono consigliati un filtro laser e ottico 579/verde 561 nm 579/16. Eseguire la compensazione utilizzando il controllo negativo e i controlli positivi a macchia singola. Vedere Figura 2A per lo schema di gating.
  3. Filtrare le cellule attraverso un colino da 40 m, centrifugare a 500 x g per 5 min e sospendere nuovamente le cellule in 2 mL di buffer FACS ad una densità di 0,5–1 x 107/mL. Trasferire le celle in tubi di polistirolo inferiore rotondi da 5 mL e caricare nella selezionatrice.
  4. Eseguire il tubo campione sperimentale a 4 gradi centigradi, accendere le piastre di deflessione e ordinare in un tubo conico da 15 mL prestrato con RPMI contenente 1% FBS e 1% v/v PS.
    NOTA: Proteggere i campioni dalla luce forte per ridurre al minimo lo spegnimento RFP.

5. Cultura degli NCADSC

  1. Placcare le cellule smistati ad una densità di 5.000 cellule/cm2 in una piastra di coltura di 12 pozzi in mezzo di coltura completa e incubare a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umida con 5% di CO2 per 20-24 h.
  2. Rimuovere il mezzo di coltura, lavare le cellule con PBS preriscaldato (37 gradi centigradi) per rimuovere i detriti delle cellule e aggiungere un nuovo mezzo di coltura.
  3. Una volta che le cellule sono confluenti dell'80-90%, digerire il monostrato utilizzando una soluzione EDTA di prova dello 0,25% a 37 gradi centigradi in un'incubatrice per 3-5 min e neutralizzare con 2 mL di mezzo di coltura.
  4. Centrifugare le cellule raccolte per 15 min a 250 x g a RT, rimuovere il supernatante, e rimettere in sospensione le cellule in 1 mL di mezzo di coltura. Conta le celle con un emocitometro.
  5. Semina le cellule in una piastra di 12 pozzi alla densità di 5.000 cellule/cm2.
  6. Risospendere le cellule rimanenti nel mezzo di coltura contenente 10% DMSO, congelare e conservare in azoto liquido.

6. Induzione adipogenica delle NCADSC

  1. Indurre la differenziazione adipogenica delle NCADSC all'80-90% di confluenza e condizioni di coltura standard21.
  2. Per l'induzione adipogenetica marrone, prima di tutto trattare le cellule coltivate con un mezzo di induzione adipogenico marrone (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 m/L IBMX, 0,1 M/L dexamethasone, 1M /L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine e 1 insulina di g/mL per 2 giorni. Lavare le cellule con PBS 2x e sostituirle con un nuovo mezzo (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 rosiglitazone M/L, 10 nmol/L triiodothyronine e 1 insulina g/mL). Modificare questo supporto ogni 2 giorni per un totale di 3-5x.
  3. Per l'induzione adipogenetica bianca, prima trattare le cellule con un mezzo di induzione adipogenico bianco (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 M/L dexamethasone e 1 g/mL di insulina) per 2 giorni. Lavare le cellule con PBS 2x e sostituirle con un nuovo mezzo (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS e 1 omb/mL di insulina). Cambia questo mezzo ogni 2 giorni per un totale di 3-5x.
  4. Analizzare le cellule adipogeniche in base alle esigenze.
    NOTA: Essere gentile quando si pulsano le cellule con PBS. Gli adipociti differenziati possono facilmente lavarsi via.

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Risultati

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, abbiamo ottenuto 0,5–1,0 x 106 ADSC da 5-6 Wnt-1Cre Rosa26topi RFP/z (48 settimane, maschi o femmine).

Il diagramma di flusso della raccolta di PAAT da topi è presentato nella Figura 1. La morfologia delle NCADSC era simile all'ADSC da altri tessuti adiposi dei topi. I NCADSC coltivati hanno raggiunto l'80-90% di confluenza dopo 7-8 giorni di cultura, e gli NCADSC hanno avuto una m...

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Discussione

In questo studio, presentiamo un metodo affidabile per l'isolamento, la cultura e l'induzione adipogenica degli NCADSC estratti dal PVAT di Wnt-1 Cre. Topi transgenici Rosa26RFP/z progettati per la produzione di RFPe ADSC. Le relazioni precedenti mostrano che non vi è alcuna differenza significativa nell'espressione dei marcatori di cellule staminali mesenchymale (MSC) multipotenti in NCADSC e non NCADSC22e che gli NCADSC hanno un forte potenziale per differenziars...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), e la Commissione scienza e tecnologia del comune di Shanghai (174111971000, 17140902402) ha fornito i fondi per questo studio .

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% PFABBI scienze della vitaE672002-0500Lotto #: EC11FA0001
AgarosioABCONE (Cina)A479021% concentrazione di lavoro
Anti-cebp/&alfa;ABclonaleA09041:1000 concentrazione di lavoro
Anti-mouse IgG, HRP-linkedCST70761:5000 concentrazione di lavoro
Anti-perilipinaAbcamAB616821 μ g/mL di concentrazione di lavoro; lotto #: GR66486-54
Anti-PPARySANTA CRUZsc-72730.2 μ g/mL concentrazione di lavoro
Anti-coniglio IgG, HRP-linkedCST70741:5000 concentrazione di lavoro
Anti-β-TubulinaCST21461:1000 concentrazione di lavoro
BSAVWR scienze della vita0332-100G50 mg/mL concentrazione di lavoro; lotto #: 0536C008
Collagenasi, Tipo IGibco17018029
DesametasoneSigma-AldrichD49020.1 µ M concentrazione di lavoro
Tampone di lisi eritrocitariaInvitrogen00-4333
FBSCorningR35-076-CV50 mg/mL concentrazione di lavoro; lotto #: R2040212FBS
HBSSGibco14025092
HDMEMGelifesciencesSH30243.01Lotto #: AD20813268
IBMXSigma-AldrichI70180.5 mM di lavoro
concentrazione InsulinaSigma-AldrichI35361 μ g/mL concentrazione di lavoro
Pinze microchirurgicheSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Cina)MR-F201A-1
Forbice microchirurgicaSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Cina)MR-H121A
Olio Rosso O soluzioneSigma-AldrichO15160,3% concentrazione di lavoro
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)ABCONE (Cina)P41970
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122
Kit di reagenti PrimeScript RTTAKARARR047ALotto #: AK4802
RNeasy kitTAKARA9767Lotto #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ topiJAXNo.007909C57BL/6 backgroud; maschio e femmina
RosiglitazoneSigma-AldrichR24081 μ M concentrazione di lavoro
Pinze standardSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Cina)MR-F424
Forbice chirurgicaSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Cina)MR-S231
SYBR Premix Ex TaqTAKARARR420ALotto #: AK9003
TriiodotironinaSigma-AldrichT287710 nM concentrazione
di lavoroWnt1-Cre+; PPARγ flox/flox topiJAXNo.009107C57BL/6 backgroud; maschio e femmina

Riferimenti

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