Visualizzazione della morte delle cellule litiche macrofaschi durante l'infezione micobatterica negli embrioni di pesce zebra tramite la microscopia intravitale

L'infezione micobatterica è stata dimostrata per causare la morte delle cellule immunitarie^{dell'ospite 1}. Ad esempio, un ceppo attenuato attiverà l'apoptosi nei macrofagi e conterrà l'infezione. Tuttavia, un ceppo virulento attiverà la morte delle cellule littiche, causando la diffusione batterica^1,2. Considerando l'impatto che questi diversi tipi di morte cellulare hanno sulla risposta anti-micobatterica dell'ospite, è necessaria un'osservazione dettagliata della morte delle cellule macrofagage durante l'infezione micobatterica in vivo.

I metodi convenzionali per misurare la morte delle cellule sono di utilizzare macchie cellulari morte, come Annnexin V, TUNEL, o acridina arancione / propidio iodide colorazione^3,4,5. Tuttavia, questi metodi non sono in grado di far luce sul processo dinamico della morte cellulare in vivo. L'osservazione della morte cellulare in vitro è già stata facilitata dall'imaging vivo⁶. Tuttavia, se i risultati imitano accuratamente le condizioni fisiologiche rimane poco chiaro.

I pesci zebra sono stati un ottimo modello per studiare le risposte anti-mycobacterio dell'ospite. Ha un sistema immunitario altamente conservato simile a quello degli esseri umani, un genoma facilmente manipolabili, e gli embrioni precoci sono trasparenti, il che consente l'imaging dal vivo^{7 ,8,9}. Dopo l'infezione da M. marinum, il pesce zebra adulto forma strutture di granuloma mature tipiche, e il pesce zebra embrionale forma il granuloma precoce come le strutture^9,10. Il processo dinamico di interazione immuno-batteri innato è stato esplorato in precedenza nel modello di infezione da pesce zebra M. marinum ^11,12. Tuttavia, a causa dell'elevato requisito di risoluzione spaziale-temporale, i dettagli che circondano la morte delle cellule immunitarie innate rimangono in gran parte indefiniti.

Qui descriviamo come visualizzare il processo di morte delle cellule littiche dei macrofafi innescato dall'infezione micobatterica in vivo. Questo protocollo può essere applicato anche per visualizzare il comportamento cellulare in vivo durante lo sviluppo e l'infiammazione.

Il pesce zebra è stato allevato in condizioni standard in conformità con le linee guida sugli animali di laboratorio per la revisione etica del benessere degli animali (GB/T 35823-2018). Tutti gli esperimenti relativi al pesce zebra in questo studio sono stati approvati (2019-A016-01) e condotti presso lo Shanghai Public Health Clinical Center, la Fudan University.

1. m. marinum Preparazione all'inoculum a cella singola(Figura 1)

1. Scongelare losterolo Cerulean-fluorescente M. marinum e inoculare una piastra di 7H10 agar con 10% (v/v) OADC, 0.25% glicemia e 50 g/mL hygromycin. Incubare la piastra a 32 gradi centigradi per circa 10 giorni.
2. Selezionare una colonia che esprima fluorescenza positiva e inoculare 3 mL di 7H9 medio con 10% OADC, 0.5% glicerolo, e 50 g/mL di igromycina.
   1. Incubare l'inoculazione a 32 gradi centigradi e 100 giri al minuto (rpm) per 4-6 giorni fino a quando la coltura raggiunge la fase logaritmica (OD₆₀₀ - 0,6–1,0).
   2. Sottocultura (1:100) in 30 mL di nuovo mezzo 7H9 con 10% OADC, 0,5% glicerolo, 0.05% Tween-80, e 50 g/mL fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge 1,0 dollari.
      NOTA: per la massima qualità della cultura, si consiglia una fase di sottocultura a questo punto. Nella nostra esperienza, l'aggiunta del clone direttamente a un grande volume di mezzo porterà alla formazione di ciuffi batterici.
3. Raccogliere le cellule M. marinum come descritto di seguito.
   1. Centrifuga a 3.000 x g per 10 min per raccogliere il M. marinum come pellet. Scartare tutto tranne 300 l del super-natante e usarlo per la rassicurante del pellet.
   2. Aggiungere 3 mL di 7H9 medio con 10% glicerolo per risospendere ulteriormente il pellet, quindi sonicare la sospensione in un bagno d'acqua a 100 W a 15 s ON, 15 s OFF per un totale di 2 min.
      NOTA: Lo scopo della sonicazione è quello di ottenere un omogeneo a singola cellula per l'inoculo, che impedirà il blocco dell'ago di microiniezione.
4. Trasferire la sospensione batterica in una siringa da 10 mL, quindi passare attraverso un filtro da 5 m per rimuovere eventuali ciuffi batterici.
5. Misurare la densità ottica (OD) delle sospensioni utilizzando uno spettrofotometro e diluirlo in OD₆₀₀ - 1,0 con supporti 7H9 contenenti il 10% di glicerolo. Dividere la sospensione in 10 gradi e conservare a -80 gradi congelatore per un uso futuro.
6. Confermare la concentrazione batterica dell'inoculo (cfu/mL) mediante diluizione seriale e placcatura del grezzo su una piastra di 7H10 agar contenente il 10% (v/v) dell'OADC, lo 0,5% di glicerolo e 50 g/mL di igrina.

2. Preparazione dell'embrione di pesce zebra

1. Un giorno prima della deposizione delle uova, allestire coppie di riproduzioni di pesci zebra nella camera di riproduzione.
   NOTA: aggiungere una sola coppia a ogni camera di riproduzione.
2. Raccogliere gli embrioni la mattina successiva entro 1 h dopo la fecondazione (hpf). Lavare con cura gli embrioni con acqua distillata e trasferire fino a 100 embrioni in una tela Petri da 100 mm contenente 30 mL di mezzo E3. Incubare a 28,5 gradi centigradi.
3. Dopo 12 h, osservare al microscopio e scartare le uova non fecondate o danneggiate.
4. A 24 hpf, cambiare il mezzo medio per fresco eterzo medio con N-phenylthiourea (PTU, 0.2 nM concentrazione finale) per prevenire lo sviluppo del pigmento. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi centigradi fino a quando gli embrioni non sono pronti per la microiniezione.

3. Infezione tramite microiniezione batterica

1. Preparare gli aghi di iniezione microcapillare di vetro borosilicato come descritto in precedenza nel riferimento¹³.
2. Embrioni di pesce zebra che montano per l'infezione
   1. Microonde 100 mL dell'1% (w/v) e 100 mL di 0,5% (w/v) di agarose a bassa fusione in un mezzo E3 autoclaved fino a quando l'agarose non è completamente fuso. Dividere in tubi aliquota 1 mL e conservare a 4 gradi centigradi per un uso futuro.
   2. Prima dell'uso, riscaldare l'agarose in un blocco di riscaldamento di 95 gradi centigradi fino a quando non è completamente sciolto. Mantenere l'agarose in forma liquida collocandola in un blocco di riscaldamento a 45 gradi centigradi (Figura 2).
   3. Montaggio per infezione intramuscolare nella regione del tronco
      1. Creare lo strato inferiore di agarose versando 0,5 mL dell'1% (w/v) agarose uniformemente su uno scivolo di vetro. Posizionare su una scatola di ghiaccio o su una superficie fredda per 3 min per solidificare.
      2. Anestesizzare gli embrioni di pesce zebra (48–72 hpf) in acqua di uovo con tricaina (200 g/mL) e PTU per 5 minuti prima del montaggio. Posizionare fino a 60 embrioni di pesce zebra sullo strato di agarose inferiore e disporli con attenzione in due file (Figura 2B).
      3. Rimuovere l'acqua rimanente sullo strato di agarose inferiore con carta velina prima di aggiungere 0,3 mL di 0,5% (w/v) agarose per creare lo strato superiore. Assicurarsi che gli embrioni siano completamente incorporati nell'agarose. Riportare lo scivolo di vetro nella scatola di ghiaccio per solidificare l'agarose e prevenire la disidratazione.
      4. Mantenere lo strato superiore di agarose umido coprendo la superficie con acqua di uovo E3 extra.
   4. Montaggio per infezione da midbrain
      1. Coprire la scanalatura di un singolo vetrino di microscopia in vetro di concavità con 1% (w/v) agarose, quindi trasferire gli embrioni 4-6 anestesizzati di tricaina nell'agarose.
      2. Posizionare la testa di ogni embrione con attenzione con un ago da 10 G (Figura 2C).
      3. Una volta che tutte le posizioni degli embrioni sono fisse, trasferire lo scivolo di vetro in una scatola di ghiaccio o superficie fredda per lasciare che l'agarose si solidifichi.
         NOTA: Evitare la diluizione di agarose a bassa fusione riducendo al minimo il volume di trasferimento di acqua di uovo con gli embrioni.
3. Preparazione batterici per l'infezione
   1. Aggiungete 1 o L di rosso fenolo sterile (10x) a un 10 - L. di brodo batterico (fatto al punto 1) e mescolate per brevi volte vortice.
      NOTA: la concentrazione finale può essere regolata utilizzando PBS sterile.
   2. Sonicare la preparazione utilizzando 100 W a 10 s ON, 10 s OFF per 1 min per rompere eventuali grumi che possono avere formato¹⁴.
4. Infezione tramite microiniezione
   1. Regolare il microiniettore e il micromanipolatore nella posizione corretta e nell'impostazione per la microiniezione come precedentemente riportato¹³.
   2. Trasferire 3 L della preparazione batterica utilizzando un micro caricatore nell'ago preparato (vedere il punto 3.1). Pipette lentamente e con attenzione per evitare di formare bolle d'aria.
   3. Per l'infezione della regione del tronco, iniettare 100 cfu nella regione del tronco (Figura 3A). Evitare di iniettare batteri nel notocordo.
      NOTA: Il cfu per l'iniezione è stimato dalla formula cfu : concentrazione di stock batterico x fattore di diluizione x volume gocciolina di iniezione. Il cfu effettivo è confermato dalla placcatura di una goccia di inoculum batterico su una piastra di 7H10 agar contenente il 10% (v/v) di OADC, lo 0,5% di glicerolo e 50 g/mL di igromycina.
   4. Per l'infezione cerebrale, iniettare circa 500 cfu nella regione midbrain (Figura 3B).
   5. Dopo la microiniezione, sciacquare con cura gli embrioni di pesce zebra in acqua dolce con una pipetta di plastica.
      NOTA: Montare gli embrioni nella teglia inferiore di vetro il più presto possibile per coprire l'osservazione della risposta delle cellule immunitarie innate molto precoce.

4. Live Imaging dell'infezione

1. Montaggio dei pesci per l'imaging dal vivo
   1. Trasferire fino a 10 embrioni anestesizzati tricaini al centro di un piatto inferiore di vetro 35 mm. Eliminare il supporto E3 aggiuntivo.
   2. Coprire il piatto con un agarose agarose agarose a1% a basso punto di fusione e orientare gli embrioni di pesce zebra con attenzione utilizzando un ago da 10 G. Incubare il piatto di fondo di vetro sul ghiaccio per 10 s per solidificare l'agarose.
      NOTA: Per l'iniezione di midbrain, gli embrioni devono essere montati nell'agarose con la testa rivolta verso l'alto (Figura 4A). Per l'infezione intramuscolare della regione del tronco, gli embrioni devono essere montati lateralmente nell'agarose (Figura 4B).
   3. Una volta che si è completamente solidificato, coprire l'agarose con uno strato di acqua di uovo (più 1 x tricaina e PTU).
2. Microscopia confocale time lapse ad alta risoluzione a tre colori
   NOTA: I seguenti passaggi sono azionati su una microscopia confocale dotata di un obiettivo UV da 63,0 x 1,40 olio.
   1. Impostare la temperatura della camera ambiente a 28,5 gradi centigradi. Collocare un po' di carta velina bagnata all'interno della camera per evitare umidità e prevenire l'evaporazione dell'acqua dell'uovo (Figura supplementare 1).
   2. Posizionare il piatto di fondo in vetro da 35 mm con il pesce zebra nella camera ambientale.
   3. Aprire il software confocal e inizializzare lo stage. Passare all'obiettivo UV dell'olio 63.0 x 1,40 e individuare il pesce zebra utilizzando il canale di campo luminoso con un filtro di contrasto di interferenza differenziale (DIC).
   4. Aprire il laser 405 Diode, Argon (20% di potenza) e DPSS 561 nm. Impostare le impostazioni di potenza laser e spettro appropriate.
      NOTA: Di seguito sono riportate le impostazioni dello spettro per Cerulea (eccitazione - 405 nm; emissione - 456-499 nm), eGFP (eccitazione - 488 nm; emissioni ) 500-550 nm), DsRed2 (esordimento 561 nm; emissione) (575-645 nm)(Figura supplementare 2B).
   5. Scegliere la modalità di acquisizione "XY ""Sequential Scan" e impostare il formato delle immagini su "512 x 512 pixel" ( Figurasupplementare 2A).
   6. Passare a "Live Data Mode". Puntare la posizione del primo pesce zebra e segnare la posizione "Begin" e "End". Ripetere questo processo per ciascuno degli embrioni rimanenti. Una "Pausa" può essere aggiunta alla fine del programma (Figura supplementare 2C).
   7. Definire il ciclo e il ciclo del programma.
   8. Salvare il file.

5. L'irradiazione UV a cella singola per indurre l'apoptosi e l'imaging dal vivo

1. Montare il pesce come descritto al punto 4.1.
2. Imaging nella regione midbrain di 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) macrofaage specifico embrione transgenico Tg (mfap4-eGFP) ¹⁵
3. Selezionare la regione di interesse di un singolo macrofago fluorescente etichettato e la scansione a 400 Hz di velocità e 6% potenza laser UV per 50 s.
   NOTA: la velocità e il tempo di scansione devono essere ottimizzati in base al microscopio individuale. Il tempo di scansione dovrebbe essere ottimizzato per causare l'esita danno al DNA che successivamente causerà l'apoptosi della cellula bersaglio, ma non il fotobleach l'intera cellula.
4. Ripetere il passaggio precedente per irradiare più celle di destinazione.
5. Eseguire l'imaging time lapse della regione midbrain come descritto nella sezione 4.

6. Elaborazione delle immagini

1. Eseguire "Proiezione massima" per le immagini acquisite.
2. Trovare e contrassegnare la posizione EXY e il tempo delle celle di destinazione nella vista "Proiezione massima".
3. Tornare alla visualizzazione standard per trovare e contrassegnare la posizione z delle celle di destinazione.
4. Ritagliare l'immagine a livello singolo delle celle di destinazione.
5. Esportare il canale di sovrapposizione e il campo luminoso come video in formato AVI.
6. Ritaglia l'area di interesse del canale di sovrapposizione e del campo luminoso in ImageJ.
7. Combina i due video nell'ultimo passaggio verticalmente e salvalo come un unico video in formato AVI in ImageJ.

L'infezione da mycobacterium può innescare diverse risposte dell'ospite in base alle vie di infezione. In questo protocollo, gli embrioni di pesce zebra sono infettati da microiniezione intramuscolare di batteri etichettati fluorescentmente nel midbrain o nel tronco(Figura 3) e osservati mediante imaging dal vivo confocale. L'infezione attraverso questi due percorsi limiterà localmente l'infezione che causa il reclutamento di cellule immunitarie innate e la successiva morte cellulare.

Visualizzare i dettagli della morte innata delle cellule immunitarie è una sfida. La morte delle cellule littiche si verifica in una finestra temporale molto breve e richiede microscopia ad alta risoluzione per osservare. Inoltre, l'elevata motilità delle cellule immunitarie innate permette loro di migrare fuori dall'area di osservazione. In questo protocollo, risolviamo questo problema osservando più embrioni in parallelo. Una serie di embrioni di pesce zebra può essere montata su un singolo vetrino di vetro per l'infezione e fino a 10 embrioni possono essere montati sullo stesso piatto inferiore in vetro da 35 mm per l'imaging dal vivo (Figura 4). Sfruttando un modello di dati in tempo reale di microscopia confocale, è possibile osservare più di un embrione contemporaneamente. Questo migliora l'efficienza dell'imaging dal vivo e aumenta notevolmente la probabilità di catturare l'intero processo di morte delle cellule litiniche.

Il sistema immunitario innato è la prima linea di difesa contro l'infezione micobatterica, e due componenti chiave sono il macrofago e il neutrofilo. Qui utilizziamo Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) e Tg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP) per distinguere i macrofagi e i neutrofili in vivo16,17,18. Un macrofago fortemente inghiottito da batteri è diventato rotondo e ha mostrato una motilità ridotta, con eventuale gonfiore citoplasmico, rottura della membrana cellulare e rapida diffusione del contenuto citoplasmaico. Questi eventi sono tipici cambiamenti morfologici della morte delle cellule littiche come precedentemente riportato (Figura 5A)16. L'irradiazione UV è stata utilizzata per innescare le cellule per sottoporsi all'apoptosi nel pesce zebra20,21. Coerenti con questa nozione, i macrofagi irradiati dai UV hanno mostrato tipici fenotipi cellulari apoptotici, come il restringimento cellulare, la frammentazione nucleare e la condensazione della cromatina (Figura 5B)22,23. In combinazione con l'uso di Cerulean-fluorescente M. marinum19, tre colori imaging dal vivo dell'interazione tra macrofago, neutrofilo, e M. marinum è stato raggiunto in vivo. Abbiamo anche osservato che i macrofagi possono attivamente fagocitosi e diffondere M. marinum (Figura supplementare 3A). Tuttavia, i neutrofili avevano capacità fagocitiche limitate e subivano rapidamente la morte delle cellule littiche senza evidente ingorgo batterico (Figura supplementare 3B). Neutrofili potrebbero essere innescati dalla fagocitosi di pochi M. marinum morti che non esprimono ceruleo-fluorescenza, o semplicemente dalla fagocitosi di detriti cellulari morti limitati.

Figura 1: Schematico della preparazione di batteri a singola cellula. Gli stock ceruleo-fluorescente a cella singola sono stati generati seguendo il processo descritto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagramma del montaggio degli embrioni di pesce zebra per la microiniezione. (A) Diagramma schematico del processo di montaggio. (B) Gli embrioni di pesce zebra sono stati montati lateralmente per l'infezione della regione del tronco. (C) Gli embrioni di pesce zebra sono stati montati con la testa rivolta verso l'alto per l'infezione del midbrain. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Posizionamento per microiniezione. (A) La freccia rossa indica il sito di iniezione per l'infezione della regione del tronco. (B) La freccia rossa indica il sito di iniezione per l'infezione da midbrain. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Montaggio di embrioni di pesce zebra per l'imaging dal vivo. (A) Per l'infezione da midbrain, gli embrioni di pesce zebra sono stati montati con la testa diretta verso il basso. (B) Per l'infezione della regione del tronco, gli embrioni di pesce zebra sono stati montati lateralmente con il sito di iniezione vicino al fondo del piatto inferiore di vetro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: I tipici cambiamenti morfologici nell'infezione da M. marinum hanno indotto la morte delle cellule litilidi dei macrofaci dei macrofaci e l'apoptosi dei macrofaci indotta dai raggi UV. (A) L'imaging time lapse di un macrofago (Mac) sottoposto a morte di cellula littica una volta che è pesantemente ingozzato con M. marinum. Il midbrain dell'embrione di pesce zebra 3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) è infettato da M. marinum (500 cfu) tramite microiniezione. Vengono fornite immagini sia per il canale di sovrapposizione (pannello superiore) che per il canale DIC (pannello inferiore). T 00:00 è 5 h 20 min post infezione. Linee tratteggiate bianche: contorno della membrana cellulare; linee tratteggiate nere - citoplasma gonfio; frecce nere - membrana cellulare rotta; linee tratteggiate rosse: rapidamente perso il contenuto citoplasmico. ((B)L'imaging time lapse del macrofago irradiato UV. Una cellula di GFP nella regione midbrain di 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) è irradiata dai raggi UV e seguita dall'imaging time lapse. Linee tratteggiate bianche: contorno della membrana cellulare; frecce nere: frammentazione nucleare e condensazione della cromatina. Barra della scala: 15 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare Figura 1: Camera ambientale impostata per l'imaging dal vivo. (A) Impostare il controller digitale in modo che mantenga la temperatura a 28,5 gradi centigradi. (B) Impostare le salviette umide all'interno della camera per garantire umidità ed evitare l'evaporazione dell'acqua delle uova. (C) Chiudere il coperchio della camera e attendere almeno 30 min per la stabilizzazione della temperatura prima di iniziare l'imaging dal vivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 2: Impostazione del pannello Confocal per l'imaging dal vivo. (A) Rappresentazione dell'impostazione del pannello di acquisizione. (B) Rappresentazione della potenza laser e delle impostazioni dello spettro. (C) Rappresentazione di più lavori e impostazione del ciclo in modalità dati dinamici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplemento Figura 3: I macrofagi diffondono l'infezione e i neutrofili subiscono la morte delle cellule littiche dopo l'infezione da M. marinum. (A) Macrofago che diffonde M. marinum nel bagagliaio di un embrione di pesce zebra 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) infettato da Cerulean-fluorescente M. marinum (100 cfu). ((B) Neutrophil (Neu) sottoposto a morte di cellule littiche senza evidente M. marinum carico nella regione del tronco di 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) embrionale di pesce zebra infettato da Cerulean-fluorescente M. marinum (100 cfu) tramite microiniezione. Il colore verde viene assegnato a LRLG e il colore rosso viene assegnato a eGFP per una migliore visualizzazione del processo di morte delle cellule littiche. Le frecce nel ciano indicano le cellule bersaglio. Le frecce in rosso puntano alle celle che stanno per rilasciare il contenuto del citoplasma nel fotogramma successivo. Frecce in verde puntano alle cellule morte che hanno appena perso il loro contenuto di citoplasma. Barra della scala: 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Un macrofago pesantemente carico di M. marinum subisce la morte delle cellule littiche, relative alla figura 5A. L'imaging time-lapse (obiettivo 63x) per 9 min e 18 s a 3 fotogrammi al secondo (fps) della regione midbrain di un 3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) embrione di pesce zebra infettato da M. marinumceruleo-fluorescente. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Video 2: Un macrofago subisce apoptosi dopo l'irradiazione UV, relativa alla figura 5B. Time-lapse imaging (63x obiettivo) di 74 min a 6 fps della regione midbrain di un embrione di pesce zebra 3 dpf Tg(mfap4:eGFP). Una cellula del GFP nella regione del cervello centrale degli embrioni viene irradiata dai raggi UV e seguita dall'imaging time lapse. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Video 3: Un macrophage diffonde M. marinum, relativo alla figura supplementare 3A. Time-lapse imaging (63x obiettivo) di 24 min a 3 fps della regione tronco di 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) embrione di pesce zebra infetto da Ceruleo-fluorescente M. marinum. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Video 4: Un neutrofilo subisce la morte delle cellule littiche senza evidente ingorgo di M. marinum, relativo alla figura supplementare 3B. Time-lapse imaging (63x obiettivo) di 7 min 30 s a 3 fps della regione tronco di 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) embrione di pesce zebra infettato da Cerulea-fluorescente M. marinum. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.