Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.
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Articolo metodologico
Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La valutazione del profilo globale delle topologie a catena di ubiquitina all'interno di un proteoma è interessante per rispondere a un'ampia gamma di domande biologiche. Il protocollo qui delineato sfrutta la modifica della diglicina (-GG) lasciata dopo la digestione triptica dell'ubiquitina incorporata in una catena. Quantificando questi peptidi caratteristici della topologia si può determinare l'abbondanza relativa di ogni topologia a catena di ubiquitina. Le misure necessarie per quantificare questi peptidi mediante un esperimento parallelo di monitoraggio della reazione sono riportate tenendo conto della stabilizzazione delle catene di ubiquitina. La preparazione di controlli pesanti, lisi cellulare e digestione sono descritti insieme all'appropriata configurazione dello spettrometro di massa e al flusso di lavoro di analisi dei dati. Viene presentato un set di dati di esempio con perturbazioni nella topologia ubiquitina, accompagnato da esempi di come l'ottimizzazione del protocollo può influire sui risultati. Seguendo i passaggi descritti, un utente sarà in grado di eseguire una valutazione globale del paesaggio della topologia dell'ubiquitina all'interno del proprio contesto biologico.
Introduzione
La stretta regolazione della funzione e della stabilità proteica è di fondamentale importanza, in quanto sono i principali motori del controllo fenotipico della biologia. La funzione di una proteina è costruita da due componenti: la sua sequenza intrinseca di polipeptidi e qualsiasi modificazione posttraslazionale (PTM). Sono state identificate varie PTM chimiche tra cui glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione1. Nel 1975, Goldstein etal. L'ubiquitina è stata trovata importante nella degradazione delle proteine3. Tuttavia, da allora è stato stabilito che la funzione dell'ubiquiti....
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Protocollo
1. Preparazione di uno standard peptidico pesante
- A seconda del fornitore e della qualità dei peptidi pesanti acquistati, i peptidi pesanti dovranno essere diluiti. Questo protocollo utilizzava le sequenze peptidiche riportate nella tabella 1, con l'amminoacido C-terminale modificato in lisina(13C615N2-lisina) o arginina (13C615N4-arginina).
- Mescolare i peptidi pesanti, diluire il mix con acetonitrile al 50% (ACN) per creare un mix peptidico con ogni peptide a 10 μM.
- Creare aliquote del mix peptidico e conservare a -80 °C.
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Risultati
Per dimostrare l'uso di un'analisi della catena di ubiquitina da parte del PRM, sono state selezionate tre linee cellulari: una linea cellulare di melanoma del topo B16 e le due comuni linee cellulari umane A549 (cellule epiteliali basali alveolari adenocarcinomiche) e HeLa (cellule tumorali cervicali). Queste colture sono cresciute fino alla fase semiesonziale in mezzi appropriati prima di essere trattate con 0, 10 o 100 mM MG-132 per 4 ore prima della raccolta. MG-132 è un inibitore del proteasome che impedisce la degr.......
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Discussione
L'analisi dello stato di ubiquitina all'interno di un proteoma è sempre più importante per un'ampia varietà di questioni biologiche. La descrizione dello stato di ubiquitinazione di un campione deve concentrarsi non solo sul profilo delle proteine ubiquitinate, ma anche sulla topologia di tale ubiquitinazione. La valutazione di questa topologia da parte degli Stati membri mirati, come descritto in questa sede, ha un ruolo in un'ampia gamma di indagini biologiche.
Va capito che il protocollo qu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Céline Jeanty per la sua assistenza nella creazione di pellet cellulari con trattamento di MG-132 come descritto nei risultati rappresentativi e Elise Mommaerts per la sua fornitura di pellet E. coli utilizzati nel protocollo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Bicarbonato di ammonio (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuga | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Cloroacetammide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Acido formico (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Peptidi pesanti | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Colonna | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Spettrometro di massa | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-etilmaleimmide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Catena di controllo positivo K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Catena di controllo positivo K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Catena di controllo positivo M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonificatore | Sonificatore Branson | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Acido trifluoroacetico (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Tripsina | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Acque μ Elution C18 placche | Acque | 186002318 |
Riferimenti
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
- Goldstein, G., et al.
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Ristampe e permessi
