La prenilazione è una modifica importante sulle proteine che legano la membrana periferica. Le cellule degli insetti possono essere manipolate per produrre farnesylated e carboxymethylated KRAS4b in quantità che consentono misurazioni biofisiche delle interazioni proteina-proteina e proteina-lipidi
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Articolo metodologico
KRAS4b ricombinante completamente elaborato: isolamento e caratterizzazione delle proteine di Farnesylated e Metylated
In questo articolo
Sommario
Abstract
La prenilazione delle proteine è una modifica chiave che è responsabile del targeting delle proteine alle membrane intracellulari. KRAS4b, che è mutato nel 22% dei tumori umani, viene elaborato da farnesilazione e carboxymetilation a causa della presenza di un motivo scatola 'CAAX' al capolinea C. Un sistema di baculovirus ingegnerizzato è stato utilizzato per esprimere kraS4b farnesylated e carboxymethylated nelle cellule degli insetti ed è stato descritto in precedenza. Qui descriviamo la purificazione dettagliata e pratica e la caratterizzazione biochimica della proteina. In particolare, l'affinità e la cromatografia di scambio ioleomatico sono stati utilizzati per purificare la proteina per l'omogeneità. La spettrometria di massa intatta e nativa è stata utilizzata per convalidare la corretta modifica di KRAS4b e per verificare l'associazione dei nucleotidi. Infine, l'associazione della membrana di farnesylated e carboxymethylaed KRAS4b ai liposomi è stata misurata utilizzando la spettroscopia della risonanza del plasonanza del plasonco superficiale.
Introduzione
Le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo chiave nella definizione dell'attività funzionale delle proteine. Modifiche come il fosfororylazione e la glicosilazione sono ben consolidate. Le modifiche dei lipidi sono tuttavia meno ben caratterizzate. Si stima che per quanto 0.5% di tutte le proteine cellulari possono essere prenylated1. La presilazione è il trasferimento di un farnesyl di 15 carbonio o di una catena di lipidi geranilgeranyl a 20 carbonio a una proteina accettante contenente il motivo CAAX2. Proteine prenylated sono stati implicati nella progressione di diverse malattie umane tra cui l'invecchiamento ....
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Protocollo
1. Purificazione delle proteine
- Preparare i buffer A–H, come illustrato nella tabella 1.
| Soluzione buffer | Agente di buffering (tutti i 20 mM) | pH | NaCl (mM) | imidazolo (mM) | MgCl2 | TCEP |
| Un | HEPES | 7.3 | 300 | - | 5 |
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Risultati
Una delle variabili più grandi nel protocollo è la quantità di proteina bersaglio espressa (His6-MBP-tev-KRAS4b). Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando un isolare da una linea cellulare Trichoplusia ni, Tni-FNL17, adattato per la crescita delle sospensioni e svezzato dal siero. Data l'ampia gamma di risultati riportati attraverso le varie linee di cellule di insetti con il sistema di espressione del baculovirus, è consigliabile che Tni-FNL venga utilizzato, almeno inizialmente,.......
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Discussione
Come indicato nella sezione Risultati rappresentativi, la fase più critica durante la purificazione è la gestione del campione durante il periodo in cui si trova nel sale inferiore. Limitare il tempo di esposizione del campione a meno di 200 mM NaCl contribuirà a ridurre le precipitazioni e ad aumentare la resa del campione. L'interpretazione dei risultati del CEX può essere difficile se il profilo non corrisponde alle aspettative (vedere figura 2). Fino a quando il protocollo non è diventat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo il supporto della clonazione e dell'espressione di Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew nel Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, sotto contratto n. HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, né menziona nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implicano l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette Safe-Lock da 1,8 mL, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| Fiale per autocampionatore con inserto interbloccato Cl SS da 11 mm | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | acquistare come stock liquidi in cloroformio | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS) | AVANTI LIPIDI POLARI | 840034 | acquistare come stock liquidi in cloroformio |
| 5427R Centrifuga | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, grado HPLC Fisher Chemical | A998-1 1L | ||
| Acetato di ammonio | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Gas | argon Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Strumento | GE Healthcare | ||
| Guarnizioni a scatto blu, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Bagno a ultrasuoni Branson | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Colonna per cromatografia a scambio cationico (CEX) | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose CHAPS Sigma |
| ad alte prestazioniC3023 | |||
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Spettrometro di massa | Thermo Scientific | ||
| Acido formico | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Utilizzare Reagenti Grado di reagente o superiore |
| Gilson Tubi 7x14 mm GE | Healthcare | BR-1002-12 | |
| Fiale in vetro con filettatura a vite con rivestimenti in | schiuma PTFESpecialità scientifiche | B69302 | |
| Centrifuga ad alta velocità/da banco | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | in grado di erogare fino a 4.000 xg di |
| proteasi His6-Tobacco Etch Virus (TEV) | Addgene | 92414 | Purificato secondo Raran-Kurussi et al. (2017) Rimozione dei tag di affinità con proteasi TEV. In: Burgess-Brown N. (a cura di) Espressione genica eterologa in E.coli. Metodi di biologia molecolare, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Colonna per cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC) | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| Approvvigionamento idrico interno, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistività di 18 MΩ | |
| Set di estrusori lipidici | AVANTI POLAR LIPIDS | ||
| Azoto liquido | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizzatore | Colonna Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC, 4 um, 3,0 x 50 mm | Colonna Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1, 5 um, 300 Å, 2,1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| Software MagTran | Metanolo Termoscientifico | ||
| , HPLC Grado VWR | Sostanze chimiche | BDH20864.400 | |
| NGC Sistema cromatografico | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Cocktail |
| inibitori della proteasi senza EDTA o altri chelanti | Millipore Sigma | P8849 | |
| Tappi in gomma tipo 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Serie S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | ||
| Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace a 280nm | |
| Ultra-15 Unità filtranti centrifughe, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES |
| Filtri per centrifughe Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Amicon | UFC501024 | ||
| Ultracentrifuga | Beckman Coulter | Optima - L80K | in grado di erogare 100.000 xg |
| Vanquish UHPLC (pompa, cuore a colonna e sistema LC) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Acqua, grado HPLC | Sigma-Aldrich | 270733-1L | Può utilizzare una fonte d'acqua interna (vedi sotto) |
| Siringa Whatman GD/XP PES da 0,45 mm filtro | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | software di proteomica |
Riferimenti
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.
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Ristampe e permessi
