Method Article

KRAS4b ricombinante completamente elaborato: isolamento e caratterizzazione delle proteine di Farnesylated e Metylated

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prenilazione è una modifica importante sulle proteine che legano la membrana periferica. Le cellule degli insetti possono essere manipolate per produrre farnesylated e carboxymethylated KRAS4b in quantità che consentono misurazioni biofisiche delle interazioni proteina-proteina e proteina-lipidi

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prenilazione delle proteine è una modifica chiave che è responsabile del targeting delle proteine alle membrane intracellulari. KRAS4b, che è mutato nel 22% dei tumori umani, viene elaborato da farnesilazione e carboxymetilation a causa della presenza di un motivo scatola 'CAAX' al capolinea C. Un sistema di baculovirus ingegnerizzato è stato utilizzato per esprimere kraS4b farnesylated e carboxymethylated nelle cellule degli insetti ed è stato descritto in precedenza. Qui descriviamo la purificazione dettagliata e pratica e la caratterizzazione biochimica della proteina. In particolare, l'affinità e la cromatografia di scambio ioleomatico sono stati utilizzati per purificare la proteina per l'omogeneità. La spettrometria di massa intatta e nativa è stata utilizzata per convalidare la corretta modifica di KRAS4b e per verificare l'associazione dei nucleotidi. Infine, l'associazione della membrana di farnesylated e carboxymethylaed KRAS4b ai liposomi è stata misurata utilizzando la spettroscopia della risonanza del plasonanza del plasonco superficiale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo chiave nella definizione dell'attività funzionale delle proteine. Modifiche come il fosfororylazione e la glicosilazione sono ben consolidate. Le modifiche dei lipidi sono tuttavia meno ben caratterizzate. Si stima che per quanto 0.5% di tutte le proteine cellulari possono essere prenylated1. La presilazione è il trasferimento di un farnesyl di 15 carbonio o di una catena di lipidi geranilgeranyl a 20 carbonio a una proteina accettante contenente il motivo CAAX2. Proteine prenylated sono stati implicati nella progressione di diverse malattie umane tra cui l'invecchiamento ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Purificazione delle proteine

  1. Preparare i buffer A–H, come illustrato nella tabella 1.
Soluzione bufferAgente di buffering (tutti i 20 mM) pH NaCl (mM)imidazolo (mM)MgCl2 TCEP
UnHEPES7.3300-5
....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una delle variabili più grandi nel protocollo è la quantità di proteina bersaglio espressa (His6-MBP-tev-KRAS4b). Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando un isolare da una linea cellulare Trichoplusia ni, Tni-FNL17, adattato per la crescita delle sospensioni e svezzato dal siero. Data l'ampia gamma di risultati riportati attraverso le varie linee di cellule di insetti con il sistema di espressione del baculovirus, è consigliabile che Tni-FNL venga utilizzato, almeno inizialmente,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come indicato nella sezione Risultati rappresentativi, la fase più critica durante la purificazione è la gestione del campione durante il periodo in cui si trova nel sale inferiore. Limitare il tempo di esposizione del campione a meno di 200 mM NaCl contribuirà a ridurre le precipitazioni e ad aumentare la resa del campione. L'interpretazione dei risultati del CEX può essere difficile se il profilo non corrisponde alle aspettative (vedere figura 2). Fino a quando il protocollo non è diventat.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo il supporto della clonazione e dell'espressione di Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew nel Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, sotto contratto n. HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, né menziona nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implicano l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette Safe-Lock da 1,8 mL, NaturalEppendorf22363204
Fiale per autocampionatore con inserto interbloccato Cl SS da 11 mmThermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC)AVANTI POLAR LIPIDSacquistare come stock liquidi in cloroformio
1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS)AVANTI LIPIDI POLARI840034acquistare come stock liquidi in cloroformio
5427R CentrifugaEppendorf
Acetonitrile, grado HPLC Fisher ChemicalA998-1 1L
Acetato di ammonioSigma-Aldrich09689-250g
Gasargon AirgasARUP
Assay Plate 384CORNING3544
Biacore T200 StrumentoGE Healthcare
Guarnizioni a scatto blu, T/SThermo ScientificC4011-54B
Bagno a ultrasuoni BransonThermo Fisher15-336-1000
Colonna per cromatografia a scambio cationico (CEX)GE Healthcare Life Sciences29018183HiPrep SP Sepharose CHAPS Sigma
ad alte prestazioniC3023
Dyna Pro Plate ReaderWyatt Technologies
Exactive Plus EMR Spettrometro di massaThermo Scientific
Acido formicoSigma-AldrichF0507-500MlUtilizzare Reagenti Grado di reagente o superiore
Gilson Tubi 7x14 mm GEHealthcareBR-1002-12
Fiale in vetro con filettatura a vite con rivestimenti inschiuma PTFESpecialità scientificheB69302
Centrifuga ad alta velocità/da bancoThermo Fischer Scientific05-112-114Din grado di erogare fino a 4.000 xg di
proteasi His6-Tobacco Etch Virus (TEV)Addgene92414Purificato secondo Raran-Kurussi et al. (2017) Rimozione dei tag di affinità con proteasi TEV. In: Burgess-Brown N. (a cura di) Espressione genica eterologa in E.coli. Metodi di biologia molecolare, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Colonna per cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC)GE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Approvvigionamento idrico interno, Arium AdvanceSartorius StedimResistività di 18 MΩ
Set di estrusori lipidiciAVANTI POLAR LIPIDS
Azoto liquidoAirgasNI-DEWAR
M110-EH microfluidizzatoreColonna Microfluidics
MabPac RP UHPLC, 4 um, 3,0 x 50 mmColonna Thermo Scientific088645
MabPac SEC-1, 5 um, 300 Å, 2,1 x 150 mmThermo Scientific088790
Software MagTranMetanolo Termoscientifico
, HPLC Grado VWRSostanze chimicheBDH20864.400
NGC Sistema cromatograficoBioRad78880002NGC QuestTM 100 Cocktail
inibitori della proteasi senza EDTA o altri chelantiMillipore SigmaP8849
Tappi in gomma tipo 3GE HealthcareBR-1005-02
Serie S Sensor Chip L1GE Healthcare
Thermo Fischer Scientific13-400-519Absorbace a 280nm
Ultra-15 Unità filtranti centrifughe, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES
Filtri per centrifughe Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL AmiconUFC501024
UltracentrifugaBeckman CoulterOptima - L80Kin grado di erogare 100.000 xg
Vanquish UHPLC (pompa, cuore a colonna e sistema LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Acqua, grado HPLCSigma-Aldrich270733-1LPuò utilizzare una fonte d'acqua interna (vedi sotto)
Siringa Whatman GD/XP PES da 0,45 mm filtroGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificsoftware di proteomica
850457 da 0 cm con supporto 610023 di Spettrofotometro 29104993

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles