Articolo metodologico

Analisi della metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchietratta con Vescicoli Extracellulari Derivati dall'Osteosarcoma

DOI:

10.3791/60705

⸱

1 febbraio 2020

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Di seguito è descritto l'uso di un metodo di amplificazione della sonda specifico per la metilazione per analizzare i livelli di metilazione degli elementi LINE-1 nelle cellule staminali mesenchymiche trattate con vescicle extracellulari derivate dall'osteosarcoma. È inoltre dimostrata l'ultracentrifuga, una procedura popolare per separare le vesciche extracellulari dal siero bovino fetale.

Abstract

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L'amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA) è una tecnica semplice e robusta che può essere utilizzata per rilevare differenze relative nei livelli di metilazione dei campioni di DNA. È pieno di risorse, richiede piccole quantità di DNA e richiede circa 4-5 h di lavoro pratico. Nella tecnica presentata, i campioni di DNA vengono prima denaturati e quindi ibridati su sonde che prendono di mira il DNA in siti metilati o di riferimento come controllo. Il DNA ibridato è separato in reazioni parallele, una sottoposta solo a legatura e l'altra sottoposta a legatura seguita dalla digestione mediata da HhaI in sequenze GCGC non metilate. I frammenti di DNA risultanti sono amplificati dalla PCR e separati dall'elettroforesi capillare. I siti GCGC metilati non vengono digeriti da HhaI e producono segnali di picco, mentre i siti GCGC non metilati vengono digeriti e non vengono generati segnali di picco. Confrontando i picchi normalizzati dal controllo delle versioni digerite e non digerite di ogni campione si fornisce il rapporto di dosaggio della metilazione di un campione di DNA. Qui, MSPA viene utilizzato per rilevare gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall'osteosarcoma (EV) sullo stato di metilazione dell'elemento nucleare a lungo intervallato-1 (LINE-1) nelle cellule staminali mesenmalmalmal. I LINE-1 sono elementi di DNA ripetitivi che in genere subiscono l'ipometilazione nel cancro e, in questa capacità, possono fungere da biomarcatore. L'ultracentrifugato è anche usato come metodo conveniente per separare le vesciche extracellulari dai fluidi biologici (cioè, durante la preparazione del siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] e l'isolamento dei vescitabi dai media condizionati dall'osteosarcoma [centrifugazione differenziale]). Per l'analisi della metilazione, le sonde LINE-1 personalizzate sono progettate per indirizzare tre siti di metilazione nella sequenza promotrice LINE-1 e sette siti di controllo. Questo protocollo dimostra l'uso di MSPA per l'analisi della metilazione LINE-1 e descrive la preparazione di FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.

Introduzione

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La metilazione del DNA è una grande modifica epigenetica che si verifica nelle cellule umane. La metilazione del DNA si riferisce al collegamento dei gruppi metilici ai residui di citosina nei dinucleotidi CpG. Tali dinucleotidi si trovano di solito negli ammassi (isole CpG) nella regione 5' dei geni1. Nelle cellule normali, la maggior parte di questi dinucleotidi esiste in uno stato non metilato, che consente la trascrizione del DNA. Per inciso, molti tumori sono associati con le isole CpG ipermetillate e il silenziamento trascrittomico2, soprattutto nei geni soppressori tumorali, che a loro volta contribuiscono a vari segni distintivi del cancro3.

D'altra parte, lunghi elementi nucleari interspersati-1 (LINE-1 o L1) sono elementi di DNA ripetitivi e trasponibili che normalmente hanno alti livelli di metilazione nelle isole CpG. La metilazione di LINE-1 previene la traslocazione e aiuta a mantenere l'integrità del genoma. In diversi tipi di cancro, LINE-1 è ipometilato, con conseguente attivazione e successiva instabilità cromosomica retrotrassima mediata4. LINE-1 rappresenta quasi il 17% del genoma umano5e il suo stato di metilazione può fungere da indicatore dei livelli di metilazione genomica globale6. Si ritiene che l'ipometilazione line-1 globale preceda la transizione delle cellule a un fenotipo tumorale7; quindi, promette come potenziale marcatore per l'insorgenza precoce del cancro.

Attualmente, ci sono diversi metodi per l'analisi della metilazione, tra cui la pigzoncazione, la metilazione specifica PCR, microarray e l'immunoprecipitazioni della cromatina1. L'uso del sequenziamento di nuova generazione ha anche permesso di incorporare approcci a livello di genoma per la rilevazione della metilazione del DNA. Molti di questi metodi si basano sul DNA trattato con bisulfite, in cui le citosine non metilate vengono convertite in uracile e le citosine metilate rimangono invariate. Tuttavia, lavorare con il DNA trattato con bisulfite ha diverse insidie, come conversioni incomplete di citosine non metilate in uracili, amplificazione di biasima delle sequenze e errori di sequenza8.

Nell'amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA), le sonde composte da due oligonucleotidi prendono di mira sequenze di DNA contenenti un sito di restrizione (GCGC) per l'enzima di restrizione sensibile alla metilazione HhaI9. Dopo che le sonde si ibridano al DNA, ogni campione viene diviso in due set. Le sonde nel primo set vengono sottoposte a legatura, mentre le sonde nel secondo set vengono sottoposte a legatura seguita da una digestione mediata di HhaI in siti CGCG non metilati. Entrambi i set di campioni vengono poi amplificati dalla PCR e i prodotti sono separati da elettroforesi capillare. Le sonde nei siti non metilati vengono digerite da HhaI e non vengono amplificate durante la PCR, con conseguente assenza di segnali di picco. Al contrario, le sonde nei siti metilati sono protette dalla digestione e sono quindi amplificate durante la PCR, generando successivamente segnali di picco10.

MSPA presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi. In primo luogo, richiede una bassa quantità di DNA (50-100 ng) ed è adatto per l'analisi del DNA da campioni incorporati di paraffina fissati in formalina10. Non richiede DNA trattato con bisulfiti; infatti, non è adatto per il DNA che viene modificato in questo modo. Molti campioni possono essere analizzati contemporaneamente e le sonde MSPA possono essere progettate in modo che si rivolgono a più geni o sequenze contemporaneamente. Inoltre, le sonde sono specifiche e sensibili per il DNA metilato come il sito di restrizione HhaI corrisponde a una sequenza che è tipica delle isole CpG10.

Questo studio ha studiato gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall'osteosarcoma (OS) (EV) sulla metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchimale derivate da tessuto adiposo (AT-MSC; Figura 1). Gli EV sono su nanoscala, vesciche legate a membrana secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule. Trasportano proteine, lipidi, mRNA, microRNA e molecole aggiuntive dalle cellule dei genitori11,12. Gli EV mediano la comunicazione intercellulare e svolgono ruoli importanti in diverse condizioni patofisiologiche13,14. Uno studio recente ha dimostrato che gli EV derivati dal cancro possono trasferire line-1 attivi alle cellule ricevente15. È stato riferito in precedenza che i veicoli elettrici della linea cellulare HOS-143B possono alterare lo stato di metilazione di LINE-1 nelle MSC, oltre ad altri effetti genetici16.

Quando si coltivano cellule per l'isolamento EV, è importante utilizzare il siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] nel mezzo di crescita, poiché gli EV derivati da FBS possono interferire con i veicoli elettrici provenienti da altre fonti e ostacolare i risultati17,18. L'ultracentrifugazione è uno dei metodi più comuni per esaurire i VE da FBS. Si tratta di una procedura relativamente semplice ed economica rispetto ad alternative come l'ultrafiltrazione e l'esaurimento commerciale di FBS19. Qui, il protocollo dimostra anche come preparare FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.

In questo articolo viene presentata un protocollo dettagliato per le tecniche di cui sopra, dall'isolamento dei veicoli elettrici da una linea cellulare del sistema operativo all'analisi della metilazione di LINE-1 negli MSC trattati con OS-EV (Figura 1).

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Protocollo

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Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico di Helsinki e distretto ospedaliero Di Uusimaa (approvazione etica D. N. 217/13/03/02/2015).

1. Preparazione dell'EV impoverito FBS per ultracentrifugazione

  1. Prendere FBS in (ultra)centrifugare tubi e metterli in secchi di ultracentrifuga. Per garantire che l'ultracentrifugazione funzioni senza intoppi e in modo sicuro, bilanciare i secchi entro 10 mg l'uno dall'altro.
  2. Caricare i secchi su un rotore oscillante (tipo SW28, k-factor 246). Posizionare il rotore nell'ultracentrifuga e correre a 100.000 x g per 19 h a 4 gradi centigradi.
  3. Raccogliere con attenzione lo strato superiore di colore chiaro del supernatante (circa nove decimi) e trasferirlo in un tubo da 50 mL. Non disturbare o pipette il pellet marrone scuro, in quanto contiene EV da FBS.
  4. Passare il supernatante attraverso un filtro da 0,22 m in un nuovo tubo da 50 mL.
  5. Aggiungere l'FBS con criteri sterilizzati e impoveriti agli EV ai supporti per la coltura cellulare durante la coltivazione delle cellule per l'isolamento EV.

2. Isolamento degli EV derivati dall'osteosarcoma

  1. Cellule OS a piastre (hoS-143B linea cellulare) in un pallone T-175 con flÈ 1640 medio RPMI 1640, integrato con 10% fBS normale e 1% antibiotici (100 U / mL penicillina, 0,1 mg/mL streptomicina). Collocare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2.
  2. Quando il pallone è 70%-80% confluente, lavare le cellule con salina tampone di fosfato (PBS) quindi farle crescere in supporti contenenti 10% EV-deplato FBS (in seguito indicato come supporto impoverito EV).
    NOTA: 1 x 106 cellule HOS-143B placcate in un pallone T175 raggiunge il 70% di confluenza dopo circa 60 h.
  3. Durante i successivi 48 h, raccogliere supporti condizionati dalle cellule di osteosarcoma dopo ogni 24 h e aggiungere nuovi supporti editii.
  4. Centrifugare il supporto condizionato a 2500 x g per 20 min a 4 gradi centigradi per rimuovere le cellule e i detriti cellulari. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo, lasciando circa 2 mL di supporti nella parte inferiore.
    NOTA: Se non procede direttamente con l'isolamento EV in questa fase, il supernatanto può essere conservato a -80 oC.
  5. Versare il supernatante in tubi di ultracentrifuga e bilanciarli come prima. Centrifugare i tubi a 100.000 x g per 2 h a 4 gradi centigradi.
  6. Scartare con cura il supernatante, lasciando circa 1 mL nella parte inferiore. Aggiungere delicatamente circa 20 mL di PBS (0,1 m filtrati) al tubo e alla pipetta per lavare e sospendere il pellet EV.
  7. Bilanciare i tubi ed eseguire un altro giro di ultracentrifugazione con le stesse impostazioni.
  8. Rimuovere con cura il supernatante e risospendere il pellet EV in 200 -L di PBS con un pipettaggio delicato. Conservare i VE in tubi a bassa legatura.
    NOTA: Gli EV possono essere utilizzati immediatamente, altrimenti, ma in -80 gradi centigradi fino a quando non sono necessari.

3. Caratterizzazione di OS-EV

NOTA: gli EV purificati possono essere caratterizzati da gonfiore occidentale (WB), analisi del monitoraggio delle nanoparticelle (NTA) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM)16.

  1. Eseguire WB come secondo il protocollo standard16 con i marcatori EV CD63, TSG101 e Hsp70 e con calnexin come controllo negativo per indicare la purezza del campioneEV 20.
  2. Per NTA, diluire prima il campione EV in 0,1 m filtrato il PBS di Dulbecco per ottenere (idealmente) 30–100 particelle per fotogramma.
    1. Portare circa 500 l l del campione in una siringa da 1 mL e caricarlo nella porta di ingresso dello strumento NTA. Verificare che ci siano abbastanza particelle per fotogramma, per misurazioni accurate.
    2. Aprire il software NTA e registrare cinque video della durata di 60 s, utilizzando il livello di telecamera 13 a temperatura ambiente. Durante l'analisi, utilizzare la soglia di rilevamento: 5 e ottenere 10.
  3. Analizzare i campioni EV di TEM come descritto in precedenza21.

4. Cultura AT-MSC

NOTA: Il tessuto adiposo umano per l'isolamento mesenchymal delle cellule staminali è stato fornito come liposuzione aspirato (Department of Plastic Surgery, Laser Tilkka Ltd., Finlandia). Il consenso informato scritto è stato preso dai donatori di lipoaspira, che erano sottoposti a procedure di liposuzione elettiva.

  1. Isolare gli AT-MSC dagli aspirazioni di liposuzione utilizzando metodi di isolamento meccanici ed enzimatici standard22.
    NOTA: possono essere utilizzati anche MSC provenienti da altre fonti (comprese le linee cellulari commerciali).
  2. Cellule di coltura nei media DMEM/F-12 integrate con 10% FBS e 1% antibiotici.

5. Trattamento di MSC con OS-EV

  1. Piastra 15.000 AT-MSC per pozzo in una piastra 24 pozzo.
  2. Dopo 24 h, rimuovere il vecchio supporto, lavare le celle con PBS e passare al supporto esaurito EV.
  3. Trattare le cellule con OS-EV (a una concentrazione di particelle di 1 x 106 EV per cella) il Giorno 1 (24 h dopo l'adesione cellulare), Giorno 3 (48 h dopo il Giorno 1) e Giorno 5 (96 h dopo il Giorno 1).
    1. Interrompere il trattamento OS-EV per i campioni di timepoint (TP) 0 il giorno 1, 3 campioni di TP sui campioni del giorno 3 e 7 il giorno 7 (48 h dopo il giorno 5).
      NOTA: possono essere seguiti anche altri programmi di timepoint in base ai piani sperimentali.
  4. Estrarre il DNA dagli MSC utilizzando un metodo appropriato. Includere campioni di controllo positivi e negativi per l'analisi dei dati.

6. Saggio di metilazione LINE-1

  1. Progettare i primer della sonda LINE-1 personalizzati, come fatto in precedenza da Pavicic et al.23. Per le sonde di metilazione, selezionare tre sequenze contenenti il sito di restrizione HhaI all'interno della regione promotrice di LINE-1. Per le sonde di controllo, selezionare sette sequenze prive del sito di restrizione HhaI dal resto della sequenza LINE-1.
    NOTA: la sequenza LINE-1 è disponibile presso il database GenBank24 (L1.2, candidatialazione n. AH005269.2). Utilizzare le istruzioni del produttore MSPA per la progettazione delle sonde25.
  2. Diluire 70 ng di campione di DNA nel buffer TE fino a un volume di 5.L.
  3. Eseguire le successive fasi di termociclista e PCR come indicato nella tabella 1. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 98 gradi centigradi, quindi raffreddare a 25 gradi centigradi.
  4. Aggiungere 3 l di miscela di ibridazione della sonda ad ogni campione ed eseguire il termociclore per consentire alle sonde di ibridarsi al DNA.
  5. A temperatura ambiente (RT), aggiungere 13 - L di miscela post-ibridazione ad ogni campione. Trasferire 10 o l in un secondo tubo.
  6. Collocare entrambi i set di tubi nel termociclore e incubare a 48 gradi per almeno 1 min.
    1. Mentre i campioni sono a 48 gradi centigradi, aggiungere 10 l del mix di legatura al primo set di tubi (serie non digerita) e 10 l del mix legatura-digestione al secondo set di tubi (serie digerita). Eseguire il successivo programma termociclista.
  7. Abbassare i tubi e contemporaneamente impostare il termociclore a 72 .
  8. Aggiungere 5 - L di miscela di polimerasi ad ogni tubo e posizionare i tubi nel termociclore. Eseguire il programma PCR.
  9. Mentre il programma PCR è in esecuzione, preparare una soluzione di 1 mL formamide contenente 2,5 l'l di dimensioni standard. Pipetta 10 -L di questa soluzione per ogni pozzo di una piastra ottica 96 po ' (con codice a barre).
  10. Dopo la PCR, diluire i campioni non digeriti e digeriti rispettivamente a 1:100 e 1:200 in acqua ultrapura. Aggiungere 2 - L di prodotto PCR diluito alla piastra 96. Centrifugare la piastra a 200 x g per 15-20 s per rimuovere le bolle d'aria.
  11. Eseguire l'analisi dei frammenti di campioni mediante elettroforesi capillare.
    NOTA: La piastra deve essere conservata a 4 gradi centigradi al buio fino all'analisi.

7. Analisi dei dati dei frammenti

  1. Aprire l'elettroforesi capillare in un software di analisi dell'elettroferografia.
    1. Nella colonna Pannello, per uno degli esempi, scegliere MLPA dal menu. Fare clic sull'intestazione del pannello e premere Ctrl -D per applicare MLPA a tutti i campioni.
    2. Allo stesso modo, impostare il metodo di analisi su Microsatellite di default per tutti i campioni.
    3. Selezionare tutti i campioni e fare clic sul pulsante Riproduzione verde per analizzare i campioni in base alle impostazioni scelte.
    4. Selezionare tutti i campioni e fare clic sul pulsante Grafico per visualizzare i picchi della sonda.
    5. Ingrandire la regione di picco per una risoluzione più elevata dei singoli picchi di sonda. Assicurarsi che tutti i 10 picchi corrispondenti alle sonde della sonda LINE-1 siano etichettati. Eliminare i picchi aggiuntivi (<95 bp e >160 bp).
    6. Nella scheda Genotipi esportare i risultati nel formato CSV (Comma-Separated-Values).
  2. Aprire il file CSV in un software di analisi dei dati e ordinare i dati in colonne.
    1. Etichettare i tre picchi del sito di metilazione in base alle loro dimensioni approssimative (L1-1m a 153 bp, L1-2m a 119 bp, L1-3m a 133 bp). I restanti sette picchi corrispondono alle sonde di controllo.
      NOTA: Qui vengono utilizzati i valori dei picchi di sonda L1-2m, che hanno una dimensione di 117 bp, dal momento che tale regione è stata utilizzata nella maggior parte dei saggi di metilazione LINE-123.
    2. Per ogni campione (non digerito e digerito), calcolare l'area di picco della somma di tutti e sette i picchi di controllo. Dividere l'area di picco di ogni sonda LINE-1 per questa somma.
    3. Per ogni campione di DNA, dividere il valore del campione digerito per quello del campione non digerito per ottenere il rapporto di dosaggio di metilazione (DM)utilizzando la seguente equazione:
      figure-protocol-1
      Dove: DM è il rapporto di dosaggio di metilazione, Ax è l'area sotto il picco x (ad esempio, l1-2m picco), e Actrl è l'area di picco di somma di tutte e sette le sonde di controllo.

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Risultati

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L'obiettivo principale di questo studio era valutare gli effetti epigenetici degli OS-EV sulle MSC. OS-EV sono stati isolati dalle cellule HOS-143B utilizzando il metodo di centrifugazione differenziale standard. L'espressione dei tipici marcatori EV CD63, Hsp70 e TSG101 da oscillazioni occidentali ha confermato la presenza di OS-EV. (Figura 2A). L'assenza di segnale di calnexina indicava la purezza dell'isolamento OS-EV. Ulteriori indicazioni di purezza sono state osservate...

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Discussione

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Questo studio illustra come mspA può essere utilizzato per rilevare e quantificare lo stato di metilazione di uno specifico elemento genetico. LINE-1 è stato il focus qui, ma le sonde possono essere progettate per indirizzare una serie di geni e sequenze. Inoltre, c'è un elenco crescente di miscele di sonde disponibili per diverse applicazioni. MSPA è una tecnica semplice e robusta per l'analisi della metilazione del DNA che non richiede la conversione bisulfita10. La procedura completa dalla prep...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dal finanziamento del progetto dell'Università di Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Finanziamento dello Stato ospedaliero universitario di Helsinki per la ricerca sanitaria a livello universitario (Y1014SUL05, TYH2016130), Finnish-Norwegian Medical Foundation, e la Selma e Maja-Lisa Selander Fund (Fondazione Minerva). Ringraziamo Walter Pavicic per aver fornito il protocollo MSPA modificato e per il relativo supporto tecnico. Siamo grati a Teemu Masalin (Università di Helsinki) per averci aiutato con la produzione video.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mLTerumoSS+01T1per piastra NTA
a 24 pozzettiCorning3524MSC coltura cellulare
3730xl Analizzatore di DNAApplied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
Provetta da centrifuga da 50 mLCorning430829
Beckman Optima LE-80K UltracentrifugaBeckman
BlueStar Prestained Protein MarkerNippon GeneticsMWP03WB: marcatore proteico
Calnexin (clone C5C9)Cell Signaling Technology2679WB, diluizione 1:800
CD63 (clone H5C6)BD Biosciences556019WB, diluizione 1:1000
Centrifuga 5702 REppendorf5703000010Per terreni e cellule condizionati
Centrifuga 5810Eppendorf5810000010Per la centrifugazione di piastre a 96 pozzetti
Provetta da centrifuga (poliallomero, 14x95 mm)Beckman331374 Ultracentrifugazione
DMEM/F-12 + GlutaMAX mediumGibco, Life Technologies31331-028Per colture AT-MSC
Siero fetale bovinoGibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ standard di dimensioniApplicato Biosystems, Life Technologies4322682per elettroforesi capillare
GenomePlex Kit completo di amplificazione dell'intero genoma (WGA)SigmaWGA2-10RXNper controllo negativo MSPA
Hi-Di formamideApplied Biosystems, Life Technologies4311320per elettroforesi capillare
Linea cellulare HOS-143BATCCCRL-8303
Hsp70 (clone 5G10)BD Biosciences554243WB, diluizione 1:1000
IRDye 800CW Capra anti-topoLi-Cor926-32210WB: secondario
IRDye 800CW Capra anti-coniglioLi-Cor926-32211WB:
secondario LINE-1 probe-mix primerIDTSequenze nella Tabella 1
MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti con codice a barreApplied Biosystems, Life Technologies4306737richiede anche una pellicola sigillante
Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCAThermoFisher Scientific23235misura la concentrazione proteica
MiniProtean TGX 10% gelBio-Rad456-1034WB: elettroforesi su gel
NanoSight LM14CMalvern Strumentiper
NTA Membrana in nitrocellulosa 0,2 e micro; mBio-Rad1620112WB: trasferimento di proteine
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50per l'estrazione del DNA
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000WB: bloccante, anticorpi
PBS, 1XCorning21-040-CVR
Penicillina-streptomicinaGibco, Life TechnologiesDE17-602EAntibiotici per terreno di coltura
Protein LoBind provetta, 0,5 mLEppendorf22431064Per la conservazione di Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution KitLi-Cor926-11015WB: colorazione delle proteine totali
Linea cellulare RKOATCCCRL-2577per il controllo positivo MSPA
Terreno RPMI 1640 + GlutaMAXGibco, Life Technologies61870-010Per colture cellulari HOS-143B
SALSA MLPA HhaI enzimaMRC-HollandSMR50
Kit di reagenti SALSA MLPAMRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 probe-mixMRC-HollandP300-100R
Rotore oscillante SW-28Beckman Coulter342207Ultracentrifugazione
Filtro per siringa, 0,22 &; mJet BiofilFPE-204-030filtrante sterile FBS
Tecnai 12FEI Companyequipaggiato con Gatan Orius SC
1000B CCD-camera
(Gatan Inc., USA); per TEM
TBS, 1X compresseMedicago09-7500-100WB: tampone
Trans-Blot TurboBio-RadWB: trasferimento
TermociclatoreThermoFisher Scientific
TrypLE ExpressGibco12604-021per la tripsinizzazione di cellule
TSG101 (clone 4A10)SigmaSAB2702167WB, diluizione 1:500
TCA0096

Riferimenti

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