Robot morbido bioispirato con microelettrodi incorporati

Summary

Uno scaffold bioinspired è fabbricato con una tecnica di fotolitografia morbida utilizzando idrogel sagomati dal punto di guida ed elettricamente conduttivi. Gli idrogel micromodellati forniscono l'allineamento delle cellule cardiomiociti cardiomiociti direzionali, con conseguente direzione di azionamento su misura. I microelettrodi flessibili sono integrati anche nello scaffold per portare la controllabilità elettrica per un tessuto cardiaco auto-octuante.

Abstract

I sistemi robotici morbidi bioispirati che imitano organismi viventi utilizzando tessuti muscolari ingegnerizzati e biomateriali stanno rivoluzionando l'attuale paradigma biorobotica, specialmente nella ricerca biomedica. La ricreazione di dinamiche artificiali di attivimento realistiche è fondamentale per un sistema soft-robotico. Tuttavia, il controllo preciso e la messa a punto del comportamento di alleuazione rappresentano ancora una delle principali sfide dei moderni sistemi robotici morbidi. Questo metodo descrive una procedura a basso costo, altamente scalabile e facile da usare per fabbricare un robot morbido controllabile elettricamente con movimenti realistici che viene attivato e controllato dalla contrazione del tessuto muscolare cardiaco su una puntura micromodellata a raggi-come scaffold idrogel. L'uso di metodi di fotolitografia morbida consente di integrare con successo più componenti nel sistema robotico morbido, tra cui scaffold a base di idrogel micromodellati con nanotubi di carbonio (CNT) di gelatina emifaccoliloyl (CNT-GelMA), diacrilato poli(etilene glicole), microelettrodi in oro flessibile (Au) e tessuto muscolare cardiaco. In particolare, l'allineamento degli idrogel e il micropattern sono progettati per imitare la struttura muscolare e cartilaginea del raggio di puntura. L'idrogel CNT-GelMA conduttivo elettricamente funge da impalcatura cellulare che migliora il comportamento di maturazione e contrazione dei cardiomiociti, mentre l'idrogel PEGDA robusto meccanicamente fornisce un supporto strutturale simile alla cartilagine a tutto il robot morbido. Per superare la natura dura e fragile dei microelettrodi a base metallica, abbiamo progettato un modello serpentino che ha un'elevata flessibilità e può evitare di ostacolare la dinamica di battitura dei cardiomiociti. I microelettrodi Au flessibili incorporati forniscono stimolazione elettrica attraverso il robot morbido, rendendo più facile controllare il comportamento di contrazione del tessuto cardiaco.

Introduction

I moderni robot morbidi all'avanguardia possono imitare le strutture gerarchiche e le dinamiche muscolari di molti organismi viventi, come la medusa^1,2, il raggio di pungiglione², il polpo^3,i batteri⁴e lo sperma⁵. Imitando le dinamiche e l'architettura dei sistemi naturali offre prestazioni più elevate in termini di efficienza energetica e strutturale⁶. Questo è intrinsecamente correlato alla natura morbida del tessuto naturale (ad esempio, la pelle o il tessuto muscolare con un modulo di un giovane tra 10⁴x 10⁹ Pa) che consente livelli più elevati di libertà e deformazione e adattabilità superiori rispetto agli attuatori standard ingegnerizzati (ad esempio, un modulo di Young di solito tra 10⁹x 10^{10 Pa) 6}. Gli attuatori morbidi a base muscolare cardiaca, in particolare, mostrano una migliore efficienza energetica grazie alla loro auto-attivazione e al loro potenziale di autoriparazione e rigenerazione rispetto a un sistema robotico basato su meccanica⁷. Tuttavia, la fabbricazione di robot morbidi è difficile a causa della necessità di integrare diversi componenti con diverse proprietà fisiche, biologiche e meccaniche in un unico sistema. Ad esempio, i sistemi sintetici ingegnerizzati devono essere integrati con sistemi biologici viventi, non solo fornendo loro supporto strutturale, ma anche influenzando e modulando il loro comportamento di attuazione. Inoltre, molti metodi di microfabbricazione richiedono processi duri / citotossici e sostanze chimiche che riducono la vitalità e la funzione di qualsiasi componente vivente. Pertanto, sono necessari nuovi approcci per migliorare la funzionalità dei robot morbidi e per controllare e modulare il loro comportamento.

Per integrare con successo i componenti viventi con una buona vitalità, uno scaffold a base di idrogel è un materiale eccellente per creare il corpo di un robot morbido. Le proprietà fisiche e meccaniche di un idrogel possono essere facilmente regolate per creare microambienti per componenti viventi come i tessuti muscolari^8,9. Inoltre, può facilmente adottare varie tecniche di microfabbricazione, con conseguente creazione di strutture gerarchiche ad alta fedeltà^1,2,10. I dispositivi elettronici flessibili possono essere incorporati nel robot morbido per controllarne il comportamento con la stimolazione elettrica. Ad esempio, le tecniche optogenetiche per l'ingegneria delle cellule elettrogeniche (ad esempio, i cardiomiociti), che mostrano un'attivazione elettrofisiologica dipendente dalla luce, sono state utilizzate per sviluppare un raggio di puntura robotica morbida basato su polidimetilsiloxane (PDMS) guidato dalla luce che è stato in grado di ricreare il movimento ondulatorio della vitro del pesce in vitro^{2 .} Anche se le tecniche optogenetiche hanno dimostrato un'eccellente controllabilità, il lavoro presentato utilizza la stimolazione elettrica, un metodo di simulazione convenzionale e tradizionale. Questo perché la stimolazione elettrica tramite microelettrodi flessibili è facile e semplice rispetto alle tecniche optogenetiche, che richiedono ampi processi di sviluppo¹¹. L'uso di dispositivi elettronici flessibili può consentire la stimolazione a lungo termine e processi di fabbricazione standard/semplici, nonché la biocompatibilità regolabile e le proprietà fisiche e meccaniche^12,13.

Qui, presentiamo un metodo innovativo per fabbricare un robot morbido bioispirato, azionato dal battito del tessuto muscolare cardiaco ingegnerizzato e controllato dalla stimolazione elettrica attraverso microelettrodi Au flessibili incorporati. Il robot morbido è progettato per imitare la struttura muscolare e cartilaginea del raggio di pungiglione. Il raggio di pungiglione è un organismo con una struttura e un movimento relativamente facili da imitare rispetto ad altre specie che nuotano. I muscoli vengono ricreati in vitro seeding cardiomiociti su un micromodello di idrogel elettricamente conduttivo. Come riportato in precedenza, l'incorporazione di nanoparticelle elettricamente conduttive come il CNT nell'idrogel GelMA non solo migliora l'accoppiamento elettrico del tessuto cardiaco, ma induce anche un'eccellente architettura in vitro e disposizione^8,9. Le articolazioni della cartilagine vengono poi imitate utilizzando un modello idrogel PEGDA meccanicamente robusto che agisce come il substrato meccanicamente robusto dell'intero sistema. I microelettrodi Flessibili Au con un modello serpentino sono incorporati nel modello PEGDA per stimolare localmente e stimolare elettricamente il tessuto cardiaco.

Protocol

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Sanità. Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Brigham and Women's Hospital.

1. Sintesi GelMA

1. Sciogliere 10 g di gelatina in 100 mL di salina tamponata da fosfati (DPBS) utilizzando un agitatore magnetico a 50 gradi centigradi.
2. Aggiungere 8 mL di anidride methacrlica lentamente mescolando la soluzione di prepolimero di gelatina a 50 gradi centigradi per 2 h. Diluire la soluzione di gelatina reattiva con DPBS preriscaldata a 50 gradi centigradi.
3. Trasferire la soluzione diluita nelle membrane di dialisi (taglio del peso molecolare 12-14 kDa) e metterle in acqua deionizzata (DI). Eseguire la dialisi a 40 gradi centigradi per circa 1 settimana.
4. Filtrare la soluzione prepolimero GelMA dialfatto utilizzando un filtro sterile (dimensione del poro è 0,22 m) e trasferire 25 o 30 mL della soluzione in tubi da 50 mL e conservare a -80 gradi centigradi per 2 giorni.
5. Asciugare a secco la soluzione prepolimerale GelMA congelata utilizzando un'asciugatrice congelata per 5 giorni.

2. Preparazione della soluzione prepolimero polipolilene (etilene glicole) (PEGDA)

1. Sciogliere 200 mg (20% della soluzione totale) di PEGDA (MW - 1.000) con 5 mg (0,5% della soluzione totale) di 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone (foto-initiator, PI) in 1 mL di DPBS.
2. Incubare la soluzione prepolimera a 80 gradi centigradi per 5 min.

3. Preparazione della soluzione di stock disperso Rivestita in GelMA con CNT

1. Sciogliere 80 mg di GelMA (utilizzato come biosurfactant) in 4 mL di DPBS e quindi aggiungere 20 mg di COOH multidimensionale nanotubi di carbonio multiwalled (MWCNT) nella soluzione prepolimerica GelMA.
2. Sonicare la soluzione prepolimeri GelMA carica da MWCNT per 1 h (0,66Hz, 100 Watt).
   NOTA: Durante il processo di sonicazione, la soluzione deve essere immersa in un bagno d'acqua a 15 gradi centigradi per evitare l'evaporazione del solvente a causa dell'aumento della temperatura.

4. Preparazione di 1 mg/mL CNT contenente 5% soluzione prepolimerica GelMA

1. Sciogliere 50 mg di GelMA e 5 mg (0.5% della soluzione totale) di PI in 0.8 mL di DPBS a 80 gradi centigradi per 10 min.
2. Aggiungere 0,2 mL della soluzione di stock CNT preparata (passaggio 3). Vorticare e incubare la soluzione a 80 gradi centigradi per 10 min.

5. Preparazione di uno scivolo di vetro rivestito a 3 (trimethoxysilyl)propyl (TMSPMA)

1. Lavare i vetrini di vetro (spessore 1 mm, dimensioni 5,08 cm x 7,62 cm) con etanolo puro.
2. Impilare i vetrini puliti verticalmente in un becher da 250 mL e diffondere 3 mL di TMSPMA su di loro utilizzando una siringa. Coprire il becher con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione di TMSPMA.
3. Incubare gli scivoli in un forno a 80 gradi centigradi per 1 giorno.
4. Lavare i vetrini di vetro rivestiti immergendoli in etanolo puro, quindi asciugare.
5. Conservare i vetrini in vetro rivestito avvolti in un foglio di alluminio a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Cercare di ridurre al minimo il tocco delle superfici dei vetrini in vetro rivestiti tè TMSPMA.

6. Fabbricazione dei microelettrodi Au flessibili

1. Progettare una maschera shadow utilizzando la progettazione assistita dal computer (Supplementary File 3).
2. Fabbricare e acquistare una maschera d'ombra.
3. Lavare lo scivolo di vetro (spessore 1 mm, dimensioni x 3 cm x 4 cm) con acetone e asciugare con una pistola ad aria compressa.
4. Fissare la maschera d'ombra ai substrati di vetro utilizzando nastro adesivo a doppio lato, quindi metterli in un evaporatore a fascio esistito e attendere che la pressione della camera raggiunga almeno 10^-6 Torr.
   NOTA: I due pezzi di nastro sono stati posizionati manualmente sul supporto ad una distanza sufficientemente breve da ospitare il vetro e abbastanza grande da adattarsi all'intero modello. Questo passo richiede circa 45-60 min.
5. Depositare uno strato Au spesso 200 nm mediante evaporatore di e-beam (ad esempio, con Denton EE-4, il vuoto - 10^-6 Torr, potenza del 2,6%, velocità : 2 s) e tagliare i microelettrodi fabbricati utilizzando una macchina di sega da dicing (dimensione degli elettrodi - 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).

7. Fabbricazione di un scaffold idrogel multistrato multistrato integrato con micromagnete Au micromagnete

NOTA: Il risultato di questa procedura è una membrana in cui un idrogel PEGDA micromodellato si trova nello strato inferiore, un idrogel CNT-GelMA micromodello è in cima e i microelettrodi Au sono tra i due strati. Questa configurazione garantisce una maggiore flessibilità all'elettrodo e limita il rischio di rottura.

1. Progettare e fabbricare due fotomaschere per creare il PEGDA micromodellato (1^smask) e gli strati di idrogel CNT-GelMA (2^nd photomask). Vedere File supplementare 2–3. Il progetto può essere fatto utilizzando il software CAD.
   NOTA: vedere la figura 2B, E.
2. Posizionare 50 distanziali realizzati impilando uno strato di nastro invisibile commerciale (Thickness: 50 m) su un vetro rivestito TMSPMA. Versare la soluzione prepolimerizza PEGDA del 20% del 20% sopra il vetro rivestito TMSPMA, quindi coprire con microelettrodo in oro. Posizionare la prima fotomaschera per la vetrina di vetro (PEGDA micromodellata) sopra il microelettrodo dorato ed esporre l'intero costrutto alla luce UV (200 W vapore di mercurio lampada ad arco corto con filtro 320-390 nm) a 800 mW di intensità e 8 cm di distanza per 110 s.
   NOTA: vedere la figura 1A.
3. Aggiungere DPBS per circondare lo scivolo di vetro e staccare l'idrogel PEGDA micromodellato insieme ai microelettrodi Au dal substrato di vetro non rivestito con attenzione dopo 5-10 min per ottenere il vetrino di vetro che ha l'idrogel PEGDA micromodellato con l'Au microelettrodi.
   NOTA: vedere la figura 1B. A causa del rivestimento TMSPMA, il costrutto viene trasferito dal substrato di vetro non rivestito a quello rivestito tè TMSPMA. Staccarsi con attenzione perché i microelettrodi Au possono rompersi facilmente durante questo passaggio (Figura 3).
4. Posizionare sul fondo di una piastra Petri due strati di nastro trasparente commerciale (spessore e 50 m). Depositare una goccia di 20 CNT-GelMA soluzione prepolimerica tra i distanziali e poi capovolgere il vetrino di vetro ottenuto in 7.3 e fissarlo sul piatto con nastro adesivo.
5. Ruotare il dispositivo a testa in giù e posizionare la 2^nd photomask sopra la diapositiva di vetro. Esporre sotto la luce UV a 800 mW di intensità e 8 cm di distanza per 200 s.
   NOTA: vedere la figura 1C. L'allineamento della seconda maschera è importante.
6. Lavare l'impalcatura ottenuta con DPBS e con un mezzo di coltura cellulare che include il 10% del siero bovino fetale (FBS).
7. Lasciarli per una notte nell'incubatrice di 37 gradi centigradi prima di seminare le cellule.

8. Isolamento e cultura dei ratti neoatali

1. Isolare i cuori dai ratti Sprague-Dawley di 2 giorni seguendo i protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Istituto⁸.
2. Mettere i pezzi di cuore sullo shaker durante la notte (circa 16 h) in 0.05% trypsin senza EDTA in HBSS in una stanza fredda.
3. Raccogliere i pezzi di cuore con una pistola pipetta e ridurre al minimo la quantità di trypsin, quindi metterli in un tubo da 50 mL con 10 mL di mezzi cardiaci caldi (10% FBS, 1% P/S, 1% L-glutamine).
4. Swirl lentamente (60 giri/) in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 7 min. Rimuovere il supporto con attenzione dal tubo con una pipetta da 10 mL e lasciare i pezzi di cuore nel tubo.
5. Aggiungere 7 mL di 0,1% di collagenasi di tipo 2 in HBSS e girare in un bagno d'acqua 37 C per 10 min.
6. Mescolare con una pipetta da 10 mL 10 volte delicatamente per disturbare i pezzi di cuore. Rimuovere il supporto dal tubo con una pipetta da 1 mL.
7. Aggiungete 10 mL di 0,1% di collagenasi di tipo 2 in HBSS e girare rapidamente (120-180 rpm) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 10 min, quindi controllare se i pezzi cardiaci si stanno sciogliendo.
8. Mescolare con una pipetta da 10 mL, quindi ripetere con una pipetta da 1 mL per rompere gli ultimi pezzi di cuore.
9. Una volta che la soluzione appare omogenea, posizionare un colino a celle da 70 m su un nuovo tubo da 50 mL e pipettare la soluzione 1 mL alla volta sul colino.
10. Centrifugare la soluzione delle cellule cardiache a 180 x g per 5 min a 37 gradi centigradi.
    NOTA: Se ci sono ancora alcuni pezzi di cuore o muco che non si sono sciolti, ripetere nuovamente i passaggi da 8,7–8,9.
11. Rimuovere con attenzione tutto il liquido sopra il pellet cellulare e risospeso le cellule in 2 mL di supporto cardiaco.
12. Aggiungere 2 mL di supporto cardiaco dalla parete del tubo con attenzione per risospendere le cellule ed evitare di romperle.
13. Aggiungere le cellule sospese in un pallone T175 con caldo cardiaco media goccia dopo goccia. Mettere il flacone in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 1 h per consentire ai fibroblasti cardiaci di attaccarsi sul fondo.
    NOTA: A questa fase di prepsiatura, i fibroblasti cardiaci si attaccheranno al pallone mentre i cardiomiociti rimarranno nel mezzo di sospensione.
14. Raccogliere il supporto dal flacone che contiene i cardiomiociti e metterlo in un tubo da 50 mL.
15. Contare le cellule, quindi centrifugare a 260 x g per 5 min a 37 gradi centigradi.
16. Risospendere e seleggere le cellule sulla parte superiore del robot morbido fabbricato nel passaggio 7. Versare un volume specifico di supporti cardiaci con i cardiomiociti ad una concentrazione di 1,95 x 10⁶ celle/mL goccia per goccia su tutta la superficie del dispositivo.
17. Incubare i campioni a 37 gradi centigradi e cambiare i media con supporti di coltura cellulare da 5 mL con il 2% di FBS e l'1% L-glutamine il primo e il secondo giorno dopo la semina. Modificare il supporto ogni volta che il colore del supporto cambia.

9. Colorazione delle celle per l'analisi dell'allineamento

1. Rimuovere il supporto e lavare con DPBS per 5 min a RT.
2. Fissare le cellule utilizzando 4% paraformaldeide (PFA) per 20 min a RT. Quindi lavare con DPBS per 5 min a RT.
3. Incubare le cellule con 0,1% tritonte in DPBS a RT per 1 h. Lavare 3x con PBS per 5 min a RT.
4. Incubare le cellule con 10% siero di capra in DPBS a RT per 1 h.
5. Incubare le cellule con un anticorpo primario (sarcomeric z-actinina e connexin-43) nel 10% del siero di capra nel DPBS a 4 gradi centigradi per 14–16 h.
6. Lavare 3x con DPBS per 5 min a RT. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario nel 10% del siero di capra in DPBS a RT per 1 h.
7. Lavare 3x con DPBS per 5 min a RT, quindi contrastare le cellule con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in acqua DI (1:1,000) per 10 min a RT. Lavare 3x con DPBS per 5 min a RT.
8. Scatta immagini a fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione laser invertita.

10. Test degli attuatori e valutazione del comportamento

1. Battito spontaneo dei cardiomiociti sul robot morbido
   1. Incubare attuatori bioispirati a 37 gradi centigradi per 5 giorni e aggiornare i media il giorno 1 e 2 e quando necessario (cioè quando i media diventano gialli). Utilizzare un microscopio ottico invertito per scattare immagini ogni giorno (5x e/o 10x). Registra i movimenti delle celle utilizzando il software di acquisizione video sulla finestra live del microscopio per 30 s a 20 fotogrammi al secondo (5x e/o 10x) quando inizia l'attività contrattile (generalmente intorno al giorno 3).
   2. Al giorno 5, staccare le membrane sollevando delicatamente dal bordo con uno scivolo di copertura.
      NOTA: Se le cellule mostrano un forte comportamento di battitura, le membrane si staccano da sole a causa dell'azione meccanica delle contrazioni.
2. Stimolazione del segnale elettrico sfuso
   1. Utilizzando un PDMS distanziato di 3 cm come supporto, apporre due elettrodi di asta di carbonio con filo di platino (Pt) in una parabola Petri di 6 cm piena di supporti cardiaci. Quindi trasferire con attenzione il robot morbido nel piatto Petri.
   2. Applicare una forma d'onda quadra con 50 ms larghezza impulso, valore di offset DC 0 V, e l'ampiezza di tensione di picco tra 0,5 e 6 V. La frequenza varia tra 0,5, 1,0 e 2,0 Hz con un ciclo di lavoro compreso rispettivamente tra 2,5%, 5% e 10%. Registra le contrazioni su macroscala utilizzando una fotocamera disponibile in commercio.
3. Stimolazione elettrica con i microelettrodi Au
   1. Dopo la fabbricazione di scaffold idrogel multistrato integrati con microelettrodo Au, collegare due fili di rame agli elettrodi Au attraverso una porta quadrata esterna con pasta d'argento.
   2. Coprire la pasta d'argento con un sottile strato di PDMS precurato a 80 gradi centigradi per 5 min. Quindi mettere i campioni su una piastra calda a 45 gradi centigradi per 5 h per incrociare completamente il PDMS.
   3. Dopo la semina cardiomiocito, applicare uno stimolo elettrico a onda quadra sui fili di rame con il valore di offset DC 1 V, l'ampiezza della tensione di picco tra 1,5 e 5 V e le frequenze di 0,5, 1,0 e 2,0 Hz rispettivamente.

Results

Diagramma di flusso dei passaggi per lo sviluppo del robot morbido bioispirato incorporato con microelettrodo Au
L'obiettivo del design soft robot era quello di costruire una membrana in grado di azionare un movimento di nuoto con una complessità minima. La struttura deve essere in grado di sostenere forti flessioni ripetutamente nel tempo (circa 1 Hz) ed essere in grado di mantenere la sua forma, ottenendo un forte battito. Foto che attraversano selettivamente il polimero utilizzando fotomaschere, ab...

Discussion

Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di fabbricare con successo un robot morbido bioispirato simile al pesce batoid e con un tessuto cardiaco auto-azionante integrato su uno scaffold strutturato multistrato che è controllato da microelettrodi Au incorporati. A causa di due distinti strati di idrogel micromodellati fatti di idrogel PEGDA e CNT-GelMA, lo scaffold bioinspire d'ispirazione ha mostrato una buona stabilità meccanica e l'allineamento e la maturazione delle cellule ideali. Lo strato di pattern PEGDA, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL Becher	PYREX	1000-250CNEa
2-idrossi-4'-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone	Sigma-Aldrich	410896
3-(Trimetossisilil)metacrilato di propile	Milipore	M6514
37° Bagno d'acqua	VWR	W6M
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
50mL Provette da centrifuga coniche	Falcon	14-959-49A
70 &; m Cell Strainer	Falcon	352350
80° incubatore	VWR	1370GM
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H+L)	Invitrogen	A11037
Alexa Fluor 488 Falloidina	Invitrogen	A12379
Antibiotico/Antimicotico soluzione	ThermoFisher Scientific	15240062
Anticorpo Anti-Connexin 43/GJAI	Abcam	ab11370	Policlonale di coniglio
Anti-Sarcomerico &alfa;-actinina	Abcam	ab9465	da banco monoclonali di topo
	Labconco	77500-00 K
Cabina di biosicurezza	Sterilgard	A/B3
Elettrodi a barra di carbonio	SGL Carbon Group	6971105
Centrifuga	Eppendorf	5804
CO2 incubatore	Forma Scientific	3110
Collagenasi, Tipo II, Polvere	Gibco	17-101-015
Microscopio confocale	Zeiss	LSM 880
COOH Nanotubi di carbonio funzionalizzati	NanoLab	PD30L5-20-COOH
Sega a cubetti	Giorgio Technology	DAD-321
DMEM, Gibco ad alto contenuto di glucosio		11-965-118
DPBS senza calcio e magnesio	Gibco	14-190-144
Evaporatore E-beam	CHA	57367
Siero fetale bovino	Gibco	10-437-028
Gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	Tipo B, 300 fioritura da pelle suina
Vetrino	VWR	48382-180
HBSS senza calcio, magnesio o fenolo rosso	Gibco	14-175-079
Microscopio ottico invertito	Olympus	CK40
Piastra riscaldante magnetica	Corning	PC-420
anidride metacrilico	Sigma-Aldrich	276695	Contiene 2.000 ppm di topanolo A come inibitore
Nunc EasYFlask 175cm2	ThermoFisher Scientific	159910
Olicscope	Siglent	SDS1052DL+
Paraformaldeide Soluzione acquosa -16%	Microscopia elettronica Scienze	15710
PDMS SYLGARD 184	Sigma-Aldrich	761036
Fotomaschera	Mini micro stencil inc
Filo di platino	Alfa Aesar	AA43014BU
Polietilenglicole dimetcrilato	Polysciences Inc.	15178-100
Tubo per dialisi in cellulosa rigenerata	Fisherbrand	21-152-14
Adesivo epossidico argento	MG Chemicals	8330S
Stericup Sistema di filtrazione sottovuoto sterile a rilascio rapido-GP	Millipore	S2GPU02RE
Ultra sonicatore	Qsonica	Q500
Sistema di polimerizzazione UV	OmniCure	S2000
Miscelatore a vortice	Scientific Industry	SI-0246A
Generatore di forme d'onda	Agilent	33500B
Wrap Foglio di alluminio	Reynolds	N/A