Gastrectomia a maniche nei topi con clip chirurgiche

Sommario

La prevalenza del diabete e dell'obesità è in continuo aumento in tutto il mondo. I meccanismi tra diabete, obesità e mortalità e co-morbidità associati devono essere ulteriormente studiati. Qui, presentiamo un protocollo per la gastrectomia manica (SG) negli animali come modello preclinico semplice di chirurgia bariatrica.

Abstract

Il numero di persone in sovrappeso e obese è in continuo aumento sia nella popolazione adulta che adolescenziale. Ciò coincide con l'aumento del fenomeno universale del diabete di tipo 2 (T2D) e di altri problemi metabolici. La chirurgia bariatrica, come la SG, è attualmente uno dei trattamenti a lungo termine più efficaci e comunemente usati per l'obesità e il T2D, ma l'associazione tra di loro non è ancora completamente esplorata. I meccanismi alla base dei risultati osservati dopo la chirurgia bariatrica nell'uomo possono essere studiati sulla base di studi preclinici sugli animali. La SG riduce il peso corporeo, livelli di glucosio e molti parametri metabolici, ed è facile da eseguire con una bassa incidenza di complicazioni. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un metodo semplice e un modello preclinico semplice di chirurgia bariatrica negli animali per i ricercatori.

Introduzione

La prevalenza dell'obesità è quasi triplicata in tutto il mondo dal 1975. Nel 2016, più di 1,9 miliardi di adulti di età superiore ai 18 anni erano in sovrappeso e oltre 650 milioni di adulti erano obesi. Anche la prevalenza del T2D nella popolazione adulta è raddoppiata dal 4,7% all'8,5%, con un numero che è aumentato da 108 milioni a 422 milioni di adulti tra il 1980 e il 2014 a livello^{globale 1}. La maggior parte degli interventi chirurgici bariatrici si tras danno luogo a una significativa perdita di peso, una riduzione del grasso corporeo e un miglioramento della tolleranza al glucosio, dell'insulino-resistenza e del controllo del^{diabete 2}. Oltre alla perdita di peso e alla remissione di T2D, la chirurgia bariatrica produce ulteriori vantaggi per la salute come il controllo dell'ipertensione e una minore incidenza di alcuni tipi di sviluppo e progressione del cancro correlati^{all'obesità 3}. La chirurgia bariatrica induce anche una remissione completa durevole e parziale di T2D e riduce il rischio di malattia coronarica maggiore di dieci anni (CHD) e un certo grado di rischio cerebrovascolare. Tuttavia, i meccanismi sottostanti non sono completamente compresi⁴.

Ci sono diverse procedure per la chirurgia bariatrica/metabolica. Entrambi gli interventi di bypass restrittivo e gastrointestinale forniscono effetti positivi sul^{metabolismo 5}. Dei modelli chirurgici bariatrici, SG e bypass gastrico Roux-en-Y modificato hanno un successo maggiore e tassi di mortalità più bassi e dimostrano modelli affidabili di chirurgia di bypass restrittivo e gastrointestinale nei^{topi 6}. Anche se la chirurgia di bypass gastrointestinale fornisce più perdita di peso e un miglioramento significativo della tolleranza al glucosio e steatosi del fegato rispetto alla procedura restrittiva a lungo termine, il SG produce ancora un buon controllo del peso corporeo e livelli di glucosio ed è facile da eseguire con una bassa incidenza di complicazioni⁶. La percentuale di SG è aumentata dal 30% al 54% e la chirurgia di bypass gastrico Roux-en-Y è diminuita dal 52% al 32% dal 2008 al 2014⁷. Attualmente, laparoscopica SG è la procedura bariatrica più comunemente eseguita a livello nazionale all'interno dei centri accademici negli Stati Uniti⁸. Anche se ci sono stati molti rapporti pubblicati riguardanti i processi patofsiologici tra chirurgia bariatrica, diabete e obesità, abbiamo bisogno di più esperimenti sugli animali per esplorare ulteriormente meccanismi sconosciuti.

Questo protocollo mira a produrre un metodo animale per studiare i meccanismi alla base dei risultati visti dopo la chirurgia bariatrica nell'uomo. L'attuale studio traslazione può fornire informazioni sul meccanismo dell'obesità e del trattamento T2D da parte della SG.

Protocollo

Tutte le procedure per l'uso degli animali sono state approvate dal Comitato Nazionale Yang-Ming University Institutional Animal Care and Use e rispettate la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. 8^th edition, 2011". La procedura anestetica è stata eseguita secondo le linee guida per il controllo del dolore, l'anestesia, la cura preoperatoria e postoperatoria per gli animali sperimentali della National Yang Ming University, ICAUC-016, 2015, 1^st edizione.

1. Preparazione degli animali

1. Ottenere 20 topi maschi di tipo selvaggio C57BL/6 di 8 settimane dal National Laboratory Animal Center (NLAC) che pesano circa 16-18 grammi. Assegnare casualmente questi topi nel SG o nel gruppo di operazioni finte con 10 topi ciascuno.
2. Avviare i topi su chow o una dieta ad alto contenuto di grassi (vedi Supplemental File) prima degli interventi chirurgici bariatrici o finti⁹. Produrre obesità indotta dalla dieta con almeno 2 settimane preoperatorie dell'HFD.
3. Ospita i topi nel National Yang-Ming University Laboratory Animal Center sotto un ciclo chiaro-scuro di 12:12 con esordio leggero alle 07:00 A.M. e consentire l'alimentazione gratuita al chow e all'acqua dei roditori standard.
4. Limitare tutti gli animali dal cibo, ma consentire l'accesso gratuito all'acqua la notte prima dell'intervento chirurgico.

2. Preparazione preoperatoria generale

1. Veloci i topi per almeno 6 ore prima dell'intervento chirurgico. Indurre l'anestesia in una camera di induzione con 5% isoflurane e ossigeno (entrambi 3-4 L/min).
   1. Controllare la profondità dell'anestesia assicurando che la stimolazione del pizzico (micro-pinne lisce seghettate curve smussate) della zampa posteriore, della zampa anteriore e dell'orecchio non evochi alcun riflesso motorio. Somministrare antibiotici (25 mg/kg cefazolina) tramite iniezioni sottocutanee prima dell'operazione.
2. Assegnare una particolare area di lavoro per le procedure chirurgiche. Pulire l'area chirurgica e spruzzare il tavolo chirurgico con la soluzione alcolica 75% prima di un'operazione.
3. Posizionare il topo nel cono naso e mantenere l'anestesia con 2% isoflurane (2 L/min) e ossigeno (4 L/min).
4. Per la gastrectomia della manica e il funzionamento farsa, dopo aver confermato l'adeguata profondità dell'anestesia mediante stimolazione delle dita dei piedi, applicare il gel 0,2% carbomero sugli occhi del topo per evitare occhi asciutti.
5. Utilizzare un rasoio elettrico per radere i capelli dall'addome allo sterno. Rimuovere e pulire i capelli rimanenti con una crema depilatoria. Posizionare e fissare il mouse sul tavolo chirurgico in posizione supina.
6. Disinfettare la parete addominale del topo con soluzioni povidone-iodio alternate al 75% di alcol per 3 applicazioni.

3. Gastrectomia a maniche e procedure fittizie

1. Laparotomia mediana
   1. Utilizzare una micro-forbice per fare un'incisione midline di 1-1,5 cm di lunghezza nell'addome superiore.
2. Esternazione dello stomaco e dell'intestino
   1. Eseguire la procedura SG con l'aiuto di un microscopio di sertizio o una lente di ingrandimento, se necessario, per prevenire l'imprevedibile sanguinamento e lo shock ipovolemico.
   2. Utilizzare due micro-force seghettate lisce curve per spostare delicatamente lo stomaco e completarlo esternare.
   3. Dividere con attenzione il legamento gastrosplenico che collega lo stomaco sinistro alla milza utilizzando una sonda con punta di cotone ed elettrocautera secondo necessità, sezionando così il fundus gastrico dalla milza circostante e da altri organi interni.

4. Isolamento dello stomaco e clip

NOTA: L'SG per i mouse è stato eseguito utilizzando la nuova tecnica di applier clip come precedentemente pubblicato¹⁰.

1. Allungare il fondo e il pylorus dello stomaco delicatamente e lateralmente con le forcelle, identificare la linea mediana (Figura 1 e Figura 2), e applicare con attenzione le clip chirurgiche a metà del lato mediale della linea mediana dello stomaco dalla giunzione gastroesofagea in modo inferiore e il polo inferiore in modo superiore. Bloccare ed escludere circa il 75-80% dello stomaco, creando così l'intera manica laterale dello stomaco(Figura 1 e Figura 2).
2. Spostare l'intestino sulla pelle nuda sul lato e coprirlo con una garza idratante caldo-salina ed eseguire l'idratazione intraperitoneale come necessario per prevenire la disidratazione e l'ipotermia.
3. Resect lo stomaco tagliato laterale, rimuovere la manica esclusa dello stomaco con microscissori e quindi sterilizzare il bordo tagliato dello stomaco con soluzione povidone-iodio.
4. Esonda la linea di clip con una sutura non assorbibile monofilamento 5-0 per non garantire perdite. Nodo le estremità della sutura e ancorare alle clip su entrambe le estremità.
5. Riportare lo stomaco e l'intestino nella posizione corretta nella cavità addominale e chiudere l'addome con una sutura continua e discontinua in esecuzione 5-0 monofilamento non assorbibile alla fascia e alla parete addominale.
6. Somministrare analgesici con chetoprofene (2-5 mg/kg) e antibiotici con cefazolina (25 mg/kg) intraperitonealmente dopo l'intera procedura.

5. Procedura Sham di SG

1. Eseguire una procedura simile a quanto descritto in precedenza con una laparotomia della linea mediana ed esternare l'intestino e lo stomaco utilizzando una copertura di garza salina calda a 37 gradi centigradi per 5 minuti.
2. Riportare lo stomaco e l'intestino ai siti appropriati di questi organi interni.
3. Chiudere la parete addominale con attenzione come descritto in precedenza con 2 strati di chiusura continua e discontinua alla fascia e alla pelle utilizzando suture monofilament lente o non assorbibili. Somministrare analgesici con chetoprofene (2-5 mg/kg) e antibiotici con cefazolina (25 mg/kg) intraperitonealmente dopo l'intera procedura.

6. Cura postoperativa generale

1. Fermare isoflurane e continuare con un flusso d'aria stanza di 3-5 L/min fino a quando il mouse è completamente sveglio.
2. Continua a guardare il mouse mentre riacquista mobilità e inizia a camminare intorno alla gabbia.
3. Posizionare il mouse in un'incubatrice indipendente di 30 gradi per 5 giorni. Assicurarsi che ci sia un solo topo per gabbia per evitare che i topi si feriso a vicenda.
4. Restituire l'accesso gratuito a un alimento di dieta gel (dieta gel ad alto contenuto di grassi: 10% strutto, 10% zucchero liquido, 57% acqua) per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico e reintrodurre la precedente dieta assegnata 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
5. Iniettare sottocutaneamente o intraperitonealmente chetoprofene (2-5 mg/kg) e cefazolina (25 mg/kg) per 1 giorno dopo l'operazione.
6. Valutare il peso corporeo del topo settimanalmente per tutto il periodo di studio. Fornire chetoprofene (2-5 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale per il controllo del dolore una volta al giorno se necessario se l'animale è in difficoltà dopo l'operazione.
   NOTA: Qui, il tasso di sopravvivenza di SG era del 90% dopo il periodo di apprendimento.

7. Valutazione dei parametri metabolici

1. Topi veloci per 6 h, e prendere campioni di sangue di base (0 min). Ottenere tutti i campioni di sangue dalla punta della vena della coda di topi in movimento^{libero 11,12}.
2. Consegnare 1 mg/g di 50% dextrose per iniezione intraperitoneale per il test di tolleranza al glucosio.
3. Misurare la glicemia dalle punte delle vene della coda dei topi in movimento liberamente a 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min dopo la somministrazione del glucosio su campioni duplicati utilizzando glucometri e strisce di prova.
4. Conservare l'intero campione di sangue (n - 10 per ogni gruppo) a temperatura ambiente con coagulazione per 30 minuti.
5. Centrifugare il campione di sangue a 3.000 x g per 10 minuti a 4 gradi centigradi.
6. Trasferire il plasma in tubi separati senza disturbare i coaguli di sangue e conservare a -80 gradi centigradi.
7. Studiare i campioni di plasma alla fine dello studio utilizzando mouse commerciali KIT ELISA per emoglobina A1c (HBA1c), glucosio, colesterolo, e livelli di insulina secondo le linee guida del produttore.

Risultati

I risultati dell'operazione sono illustrati nelle figure 3 e nella figura 4. Il tasso di sopravvivenza dello studio era del 90%. Un topo è morto nel gruppo finto a causa di debolezza e un altro topo è morto nel gruppo SG il terzo giorno dopo l'operazione per motivi sconosciuti. I risultati ottenuti sulla perdita di peso (Figura 3A) dopo l'operazione (alla settimana 3) sui topi alimentati con HFD erano abbastanza simili a quelli osse...

Discussione

La maggior parte dei potenziali studi di coorte hanno confermato che l'aumento dell'indice di massa corporea è legato all'aumento della mortalità. L'obesità è associata a un rischio maggiore di diabete, malattie cardiovascolari (CVD) e morte in entrambi i sessi. I processi patologici specifici hanno stabilito un legame tra diabete, obesità e mortalità¹⁴. Le revisioni sistematiche indicano i benefici della chirurgia bariatrica nella riduzione dei fattori di rischio per la CVD con prove per la regre...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,9% soluzione salina normale	Cina Chemical & Fornitore verificato - Pharmaceutical Co., Ltd.
Sutura monofilamento 5-0	Shineteh Inc. Taiwan		Ethicon
Alm	Shineteh Inc. Taiwan	ST-A072PK	UNIK
Anestesia animale	Tecnologia a gradini	0712VAP11076	Matrx
Barraqer-Troutman pinza	Shineteh Inc. Taiwan	ST-N309 (H-4410)	UNIK
cefazolina	Taiwan veteran pharmacy company
Chow diet	Ricerca Diete
Strisce di glucosio e glucometro	BeneCheck	BKM13-1	BeneCheck
HbA1c Kit	Livello	OKEH00661
Sistema ematologico	Fuji	FUJI DRI-CHEM 4000i	Europe
Dieta ricca di grassi	Ricerca Diete	1810724	LabDiet
Pinze per iride	Shineteh Inc. Taiwan	ST-1210	UNIK
Forbici dell'iride	Shineteh Inc. Taiwan	ST-S011	UNIK
Isoflurano	Panion & BF biotech INC	8547	Panion & BF
Ketoprofene	Sigma	22071154	Sigma-Aldrich
Stereomicroscopio	MicroTech	SZ-5T	MicroTech
Clip chirurgica (M)	Echicon Inc., Somerville, NJ		Taglia M,
5mm Vidisic gel	Dr. Gerhard Mann Chem.-pharm. Fabrik GmbH