Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Sommario

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Abstract

L'attività spontanea del calcio intracellulare può essere osservata in una varietà di tipi di cellule e si propone di svolgere ruoli critici in una varietà di processi fisiologici. In particolare, un'adeguata regolazione dei modelli di attività del calcio durante l'embriogenesi è necessaria per molti aspetti dello sviluppo neurale dei vertebrati, tra cui una corretta chiusura del tubo neurale, sinaptogenesi e specifica del fenotipo del neurotrasmettitore. Mentre l'osservazione che i modelli di attività del calcio possono differire sia in frequenza che in ampiezza suggerisce un meccanismo interessante mediante il quale questi flussi potrebbero trasmettere segnali codificati agli effetti a valle e regolare l'espressione genica, gli approcci a livello di popolazione non hanno avuto la precisione necessaria per esplorare ulteriormente questa possibilità. Inoltre, questi approcci limitano gli studi sul ruolo delle interazioni cellula-cellula precludendo la capacità di valutare lo stato della determinazione neuronale in assenza del contatto tra cellule. Pertanto, abbiamo stabilito un flusso di lavoro sperimentale che associa l'imaging di calcio time-lapse di esplants neuronali dissociati con un analisi di ibridazione di situ a fluorescenza, consentendo l'inequivocabile correlazione del modello di attività del calcio con fenotipo a livello di cella singola. Siamo riusciti a utilizzare questo approccio per distinguere e caratterizzare specifici modelli di attività del calcio associati rispettivamente alla differenziazione delle cellule neurali e delle cellule progenitrici neurali; al di là di questo, tuttavia, il quadro sperimentale descritto in questo articolo potrebbe essere facilmente adattato per studiare le correlazioni tra qualsiasi profilo di attività di serie temporali e l'espressione di un gene o geni di interesse.

Introduzione

Calcio citosolico libero è fondamentale per una varietà di processi biologici, che vanno dalla proliferazione cellulare e la migrazione all'apoptosi e autofagia^1,2,3. All'interno di queste vie, il calcio può esercitare effetti a valle sull'espressione genica interagendo con i domini che legano il calcio per indurre cambiamenti conformazionali che modulano l'attività e le interazioni delle proteine. Ad esempio, un sensore di calcio neuronale noto come downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) è tenuto in una conformazione intermedia spiegata quando legato dal calcio, impedendogli di interagire con la sua proteina e DNA bersagli^{4 .} Oltre a fungere da semplice molecola di segnalazione, tuttavia, la natura dinamica dei transitori intracellulari del calcio consente a questi modelli di attività di codificare segnali più complessi basati sull'ampiezza o sulla frequenza^5,6. La traslocazione nucleare del fattore di trascrizione del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) è potenziata da oscillazioni di calcio ad alta frequenza, ma inibita da oscillazioni a bassa frequenza⁷. Convincente, recenti lavori hanno suggerito che NFAT potrebbe effettivamente rispondere all'esposizione cumulativa al calcio⁸. Anche la calcineurina e^laproteina cinziana iI (CaMKII) mostrano risposte distinte ai transitori di calcio di una frequenza, durata o ampiezza^{specifica 9}. Per aggiungere un ulteriore livello di complessità normativa, i modelli computazionali suggeriscono che molte proteine leganti il calcio a valle diventano più o meno dipendenti dalla frequenza in risposta alla presenza o all'assenza di concorrenti vincolanti^10,11.

All'interno del sistema nervoso in via di sviluppo, due classi principali di comportamenti di attività del calcio sono state definite e associate a processi biologici specifici. L'afflusso di calcio è classificato come "spikes" se si verificano all'interno di singole cellule, raggiungono un'intensità di picco di -400% della linea di base entro cinque secondi e presentano un doppio decadimento esponenziale¹². Questo tipo di segnale è associato principalmente con neurotrasmettitore fenotipo specifica¹³. Al contrario, le "onde" sono definite come transitori di calcio più lento e meno estremo in cui la concentrazione di calcio intracellulare di una cellula sale al 200% della linea di base per un periodo di trenta secondi o più, poi decade per diversi minuti¹². Questi segnali spesso si propagano tra più cellule vicine, e la loro presenza è stata associata con escrescenza neurite e proliferazione cellulare^14,15. Tuttavia, anche se queste due classi sono state definite sulla base di profili cinetici caratteristici, non è chiaro esattamente quali caratteristiche di questi modelli vengono effettivamente rilevate dalle cellule e tradotte dagli effetti a valle.

Comprendere la relazione tra oscillazioni intracellulari del calcio ed espressione genica fornirebbe una visione cruciale di uno dei meccanismi regolatori che garantisce uno sviluppo e un modello appropriati del sistema nervoso. A tal fine, studi del midollo spinale embrionale hanno dimostrato che l'aumento dell'attività del picco di calcio durante lo sviluppo è associato a livelli più elevati di neuroni inibitori, mentre la diminuzione dell'attività del picco di calcio è associata a livelli più elevati di neuroni eccitatori¹³. Tuttavia, questi saggi a livello di popolazione non sono stati utilizzati per associare l'attività del calcio all'espressione genica a livello di singola cellula.

L'approccio a queste domande a livello della singola cella offre diversi vantaggi distinti rispetto al lavoro precedente. Per uno, la capacità di valutare l'attività del calcio e l'espressione genica in molte cellule individualmente consente di osservare il repertorio completo di modelli di attività distinti senza essere offuscato da una misurazione a livello di massa. Inoltre, lo studio di queste relazioni nella coltura primaria a cella singola significa mantenere i collegamenti cellulare-autonomi tra l'attività del calcio e l'espressione genica, mentre le interazioni che richiedono la comunicazione cellulare-cellula saranno abrogate. Pertanto, questo approccio consente di studiare questi meccanismi autonomi delle cellule in isolamento. Tuttavia, permette anche di chiarire e interrogare il ruolo dell'attività del calcio non cellulare-autonoma. Ad esempio, le cellule possono essere sezionate da un embrione nella fase della piastra neurale, coltivate fino a raggiungere lo stadio del tubo neurale e quindi confrontate con le cellule che sono state appena sezionate da un embrione di tubo neurale. Ciò consente il confronto diretto delle cellule che mantengono la comunicazione cellulare-cellula attraverso un periodo di sviluppo chiave a quelli in cui la comunicazione cellulare-cellula è stata abolita.

Nel tentativo di affrontare i limiti di precedenti approcci sperimentali, abbiamo sviluppato un protocollo che consentirebbe la valutazione dell'attività del calcio e dell'espressione genica nelle singole cellule progenitrici neurali, facilitando la correlazione di modelli di attività specifici con i successivi programmi di differenziazione. Il tessuto neurale è stato sezionato da Xenopus laevis in varie fasi dello sviluppo neurale, dissociato in singole cellule e immaginato tramite microscopia confocale in presenza di un indicatore di calcio fluorescente. Dopo l'imaging a cellule vive, i campioni sono stati fissati e analizzati tramite l'ibridazione in situ (FISH) di fluorescenza in situ per rilevare l'espressione di un gene o di un'isoforma di interesse. È importante sottolineare che le singole cellule possono essere monitorate attraverso entrambi gli esperimenti di imaging, il che significa che il profilo di attività del calcio di una cellula e il suo livello di espressione genica possono essere associati tra loro (Figura 1). Il protocollo qui riportato è destinato a sondare le relazioni tra i modelli di attività del calcio e l'espressione genica attraverso il neurosviluppo embrionale in Xenopus laevis. Tuttavia, il quadro sperimentale più ampio (imaging a percorso temporale a cella singola seguito da FISH e coregistrazione dell'immagine) può essere modificato e applicato praticamente a qualsiasi tipo di cellula, reporter fluorescente e gene di interesse.

Protocollo

Tutto il lavoro che coinvolgeva animali è stato svolto secondo i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il College of William and Mary.

1. Cura degli animali e manipolazione dell'embrione

1. Indurre l'accoppiamento naturale somministrando un'iniezione sottocutanea di gonadotropina cirionica umana (HCG) nel sacco della linfa dorsale di Xenopus lavis adulto a una dose di 600 U per le femmine e 400 U per i maschi.
2. Dopo l'iniezione, mettere almeno un maschio e una rana femmina in un serbatoio di tenuta a temperatura ambiente durante la notte. La deposizione delle uova inizia in genere 9-12 h dopo la somministrazione di HCG.
3. Raccogliere gli embrioni. Dejelly lavando delicatamente con 2% cisteina (pH 8.0) per 2-4 min.
4. Risciacquare gli embrioni 3x nella soluzione di 0,1x Margono modificato di Mark (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH regolato a 7.4–7.6).
5. Trasferire gli embrioni a piatti Petri in vetro da 100 mm contenenti 0,1x MMR e 50 g/mL di genticina. È appropriata una densità di 50-100 embrioni per piastra.
6. Incubare i piatti a 14 –22 gradi centigradi e lasciare che gli embrioni si sviluppino fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato. Rimuovere periodicamente le cellule non fecondate e gli embrioni necrotici o in via di sviluppo anomalo con una pipetta di trasferimento di plastica.
   NOTA: Per garantire la coerenza, la messa in scena dello sviluppo viene eseguita secondo i criteri morfologici definiti da Nieuwkoop e Faber¹⁶. Le fasi di interesse varieranno in base all'attenzione sperimentale. Ad esempio, i punti di riferimento chiave del neurosviluppo sono associati allo stadio 14 (insorgenza della neuriulazione), allo stadio 18 (insorgenza della chiusura del tubo neurale) e allo stadio 22 (insorgenza dell'allungamento del tailbud).

2. Dissezione dell'embrione e preparazione del campione

1. Preparazione della soluzione
   1. Preparare la soluzione 2 mM Ca² con 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl₂2H_{2H 2,}1.31 mM MgSO₄e 4.6 mM Tris. Per ogni soluzione da 100 mL, aggiungere 1 mL di penicillina/streptomicina (10.000 U/mL penicillina; 10.000 streptomici). Regolare pH a 7.8 e filtrare-sterilizzare.
   2. Prepara la soluzione senza calcio e magnesio (CMF) combinando 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris e EDTA di 0,4 mM. Regolare pH a 7.8 e autoclave per sterilizzare. Per ogni soluzione da 100 mL, aggiungere 1 mL di penicillina/streptomicina (10.000 U/mL penicillina; 10.000 streptomici). Regolare pH a 7.8 e filtrare-sterilizzare.
2. Preparazione di piastre per dissezione e imaging
   1. UV-sterilizzare due piatti Petri in plastica da 35 mm e un piatto di coltura cellulare da 35 mm (vedere Tabella dei materiali).
   2. Mentre si lavora in un cofano a flusso laminare, preparare due tubi conici in plastica da 50 mL contenenti 10 mL di soluzione Ca^{2 x} da 2 mM ciascuno.
   3. Continuate a lavorare nella cappa a flusso laminare e aggiungete 2 mL di 2 mM Ca² a una piastra Petri in plastica da 35 mm, 2 mL di 2 mM Ca² a una cell Culture Dish da 35 mm e 2 mL di soluzione CMF a una parabola Petri in plastica da 35 mm.
   4. Al di fuori del cofano a flusso laminare, riempire due piatti Petri in plastica da 100 mm e un piatto Petri in plastica da 35 mm con 0,1x MMR con gentamycina (50 g/mL). Riempire un piatto Petri in plastica da 60 mm con il 70% di etanolo.
   5. Immediatamente prima della dissezione, aggiungere 0,01 g di Collagenase B a uno dei tubi da 50 mL contenenti la soluzione Ca^2. Mescolare bene e trasferire la soluzione in un piatto Petri di plastica fresca da 60 mm.
3. Con l'aiuto di un microscopio sezionato, identificare gli embrioni dello stadio di sviluppo desiderato. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferire almeno sei embrioni appropriati in una delle piastre da 100 mm contenenti 0,1 x MMR - gentnemica preparata al punto 2.2.4. Questo servirà come piastra di contenimento.
4. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferire un embrione alla seconda piastra da 100 mm contenente 0,1x MMR e gentamicina. Questo servirà come piastra di dissezione.
   1. Se si sezionano embrioni abbastanza vecchi da muoversi (circa lo stadio 23 o più vecchio), anantichezzano ogni embrione prima della dissezione trasferendolo in un piatto contenente lo 0,1% 3-aminobenzoico ester etilico diluito in 0,1x MMR con gentamicina (50 g/mL). Una volta immobilizzato l'embrione, trasferirlo nuovamente nel piatto contenente 0,1 x MMR con gentamicina (50 g/mL) e continuare con la dissezione.
5. Rimuovere con attenzione la membrana vitelline che circonda l'embrione. Questo può essere fatto più facilmente utilizzando un paio di pinze smussate per stabilizzare l'embrione durante l'utilizzo di un paio di pinze sottili per afferrare la membrana. Tirare con cura con le pinze sottili per sbucciare la membrana villine a parte.
6. Utilizzare pinze sottili per separare le regioni dorsali e ventrali dell'embrione. Questo può essere fatto utilizzando le pinze per 'pizzicare' l'embrione lungo l'asse anteriore-posteriore, tagliandolo a metà. Con una pipetta di trasferimento sterile, trasferire la porzione dorsale alla piastra da 60 mm con soluzione di collagenae preparata al passaggio 2.2.5. Eliminare la parte ventrale.
7. Lasciare che l'espianto dorsale incuba nella soluzione di collagenae per 1–2 min a temperatura ambiente. Trasferirlo delicatamente sulla piastra di dissezione.
8. Completare la dissezione rimuovendo con attenzione tutte le contaminazioni endodermiche e mesodermiche residue dal tessuto neurale presuntivo dell'ectoderma. Per gli embrioni allo stadio 22 o più anziani, anche il tubo neurale deve essere rimosso e scartato.
   NOTA: Se necessario durante la dissezione, il piatto del 70% di etanolo preparato al punto 2.2.4 può essere utilizzato per cancellare o ri-sterilizzare le pinze.
9. Una volta completata la dissezione, trasferire delicatamente l'espiantato alla piastra da 35 mm della soluzione Ca² o preparato nel passaggio 2.2.3.
10. Ripetere i passaggi da 2,4 a 2,9 fino a quando non sono stati raccolti quattro espianti.
11. Utilizzare una micropipetta P1000 per trasferire tutti e quattro gli espianti alla piastra da 35 mm contenente la soluzione CMF, avendo cura di evitare qualsiasi contatto tra gli espianti e l'interfaccia aria-acqua. Ruotare delicatamente il piatto in modo che tutti gli espianti si amgruppino al centro del piatto.
12. Incubare 1 h a temperatura ambiente per consentire agli espianti di dissociare.
    NOTA: per facilitare la dissociazione, è possibile aggiungere alla soluzione CMF 0,025%–0,01% trypsin. Ciò può essere necessario per una dissociazione efficiente degli embrioni più vecchi (stadio 22 e più anziani).
13. A questo punto, almeno due embrioni opportunamente messi in scena devono rimanere sulla piastra di contenimento. Trasferire questi embrioni in un piatto fresco riempito con 0,1x MMR con gentamicina preparata al punto 2.2.4 e consentire loro di svilupparsi indisturbati con il piatto coperto per abbinare il piatto espiante. Questi embrioni serviranno come controlli di fratello.
14. Utilizzare la supercolla per attaccare un coperchio micro-regolato (vedi Tabella dei materiali) alla parte inferiore del piatto di coltura cellulare da 35 mm preparato nel passaggio 2.2.3.
    NOTA: Posizionare piccoli tocchi di supercolla intorno ai bordi della vetritta, quindi premere saldamente contro la parte inferiore del Cell Culture Dish. Le marcature di posizione saranno oscurate ovunque la colla contatti la griglia, quindi è importante mantenere la parte centrale a griglia del coperchio libera dall'adesivo.
15. Dopo che gli espianti si sono dissociati per 1 h, utilizzare una micropipetta P100 per trasferirli al Cell Culture Dish. Al fine di placcare il maggior numero possibile di celle sulla porzione grigliata del piatto, tenere la pipetta ad un angolo poco profondo vicino alla superficie del piatto, posizionare la punta della pipetta nell'angolo della griglia rivolto verso l'interno ed espellere saldamente la sospensione cellulare attraverso l'ar grigliato Idealmente, le cellule si depositano in un ammasso denso stretto.
16. Incubare per 1 h a temperatura ambiente per consentire alle cellule di aderire alla piastra. Determinare e registrare lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratello quando inizia questa incubazione.
17. Unire 5 1 mM Fluo-4 AM (vedi Tabella dei materiali)con 2 - L di 10% di acido Pluronico F-127.
    NOTA: Fluo-4 AM è sensibile alla luce e deve essere sempre conservato in un tubo sicuro per la luce o coperto di lamina.
18. Una volta completata l'incubazione, spostare il piatto campione in una camera oscura o in un altro luogo protetto dalla luce. Utilizzare una micropipetta per rimuovere 100 l di soluzione dal bordo del piatto. Aggiungere questa soluzione all'aliquota dell'acido F-127 Fluo-4 AM/Pluronic, pipetta su e giù per mescolare, e restituire l'intero volume al piatto campione. Swirl delicatamente per mescolare.
19. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e lasciare incubare per 1 h a temperatura ambiente. Determinare e registrare lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratello quando inizia questa incubazione.
20. Alla fine dell'incubazione, utilizzare il restante tubo conico di 2 mM Ca² per eseguire tre fughe multimediali nel modo seguente: 1) rimuovere 1 mL di soluzione dal piatto, aggiungere 3 mL di soluzione fresca, 2) rimuovere 3 mL di soluzione dal piatto, aggiungere 3 mL di soluzione fresca, 3) rimuovere 3 mL di soluzione dal piatto, aggiungere 3 mL di soluzione fresca.

3. Imaging di calcio

NOTA: l'imaging del calcio è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale invertito (Tabella dei materiali).

1. Posizionare la piastra di campionamento sullo stadio del microscopio, avendo cura di proteggerla dall'esposizione alla luce ambiente. Una volta fissata la piastra, utilizzare un marcatore per etichettare il punto anteriore della piastra in modo che lo stesso campo visivo possa essere trovato nelle immagini successive.
2. Individuare il campione al microscopio , prima a 10X e poi all'ingrandimento 20X, e selezionare un campo visivo appropriato per l'imaging. Un campo visivo ideale è ad alta densità di cellule, ma non così denso che le cellule sono raggruppate o difficili da distinguere singolarmente.
3. Regolare la messa a fuoco del microscopio in modo che il coperchio a griglia sia visibile. I numeri contrassegnati sulla coverslip fungono da identificatori univoci per un particolare locus della griglia e possono essere utilizzati per individuare lo stesso campo visivo per ulteriori immagini. Se il campo visivo selezionato in origine non si sovrappone ad alcun numero, regolare nuovamente fino a quando non viene in quadrata un numero identificabile.
4. Porta a fuoco un'immagine a campo luminoso del campo visivo selezionato con la copertina a griglia a fuoco.
5. Regolare le impostazioni di messa a fuoco e scattare un'immagine di campo luminoso del campo visivo selezionato con le celle a fuoco.
6. Con lo strato di cella a fuoco, illuminare i campioni con un laser da 488 nm. I valori HV e Offset possono essere ottimizzati per ogni esperimento per garantire che un intervallo dinamico di fluorescenza venga rilevato sul canale FITC.
7. Per un'immagine di due ore, modificare la configurazione di imaging per registrare 901 fotogrammi con un tempo di scansione di 3,93 s e un intervallo di 8 s. Eseguire la configurazione per acquisire l'immagine.
8. Una volta completata l'imaging, rimuovere la piastra dallo stadio del microscopio. Rimuovere 1 mL di soluzione dalla piastra e sostituirlo con 1 mL di 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA, e 2 mM MgSO₄ in 7.4% formaldeide).
9. Incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente o peruna notte a 4 gradi centigradi. Determinare e registrare lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratello quando inizia questa incubazione.
10. Al termine della fissazione, rimuovere tutta la soluzione dalla piastra e sostituirla con 2 mL di 1x PBS. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi per un'ulteriore lavorazione.

4. Analisi dell'espressione genica: sintesi della sonda

1. Come descritto di seguito, generare una sonda RNA antisenso per l'ibridazione in situ. Inoltre, generare una sonda di rilevamento per lo stesso gene da utilizzare come controllo negativo.
2. Al fine di purificare il DNA plasmide contenente la sequenza del modello di sonda, inoculate 150 mL di brodo LB con scorte di glicerolo batterico contenenti il plasmide modello. Incubare a 37 gradi centigradi con agitazione durante la notte o fino a quando la cultura è torbida.
3. Purificare il DNA plasmide dalla coltura batterica utilizzando il vostro metodo di scelta.
   NOTA: Usiamo il kit McNary-Nagel midi-prep per ottenere alte rese di DNA plasmide.
4. Per confermare che il plasmide contiene l'inserto previsto, eseguire un digest di restrizione e analizzare i prodotti su un gel di agarose. Il plasmide non tagliato può anche essere analizzato su un gel di agarose per verificare la contaminazione genomica del DNA.
5. Per linearizzare il DNA del modello, impostare una reazione di digerimento di restrizione di 100 -l contenente 20 g di DNA plasmide, 2 l dell'enzima di restrizione appropriato e 1 tampone appropriato. Incubare a 37 gradi centigradi per almeno 2 h.
6. Estrarre il DNA linearizzato eseguendo un'estrazione fenolo/cloroformato seguita da un'estrazione cloroformato.
7. DNA precipitato con etanolo al 100%. Questo può essere fatto rapidamente aggiungendo due volumi di etanolo freddo al campione e incubandolo a -80 gradi centigradi fino a quando non si solidifica (15-30 min).
8. Utilizzare una centrifuga refrigerata per pelletre il DNA filando per 20 min a 12.000 x g/4 gradi centigradi.
9. Togliere il supernatante e lavare il pellet con 200 o L del 70% di etanolo. Girare per 5 min a 12.000 x g/4 gradi centigradi.
10. Togliere il supernatante e il pellet asciutto all'aria per circa 5 min. Resuspend in 20 .
11. Per sintetizzare e purificare la sonda antisenso RNA, creare un mix di 2,5 m rNTP combinando 15 unità di 10 mM rCTP, 15 l di 10 mM rGTP, 15 l di 10 mM rATP, 9,75 unità da 10 mM rUTP e 5,25 L di 10 mM dig-11 UTP (Vedi tabella dei materiali).
12. Impostare una reazione di trascrizione di 50 L in vitro contenente 4 g di DNA modello linearizzato dal punto 4.2-4.10, 15 ll di 2,5 mM di miscela rNTP dal passo 4,11, 10 L di 5x buffer di trascrizione, 5 -L di 0,1 M DTT, 0,5 L di inibitore di RNAse (20 U /L) e 1,5 l di polimerasi RNA appropriata (T3, T7 o SP6). Incubare 1 h a 37 .
13. Aggiungere alla reazione altri 1,5 di RNA polimerasi e tornare a 37 gradi centigradi per un'ora aggiuntiva.
14. Aggiungete 1 L di RQ1 DNAse per reagire e incubate a 37 gradi centigradi per 10 min per degradare il modello di DNA.
15. Aggiungere da un po' di tempo una soluzione liCl da 7,5 M da campionare. Pipetta per mescolare e incubare a -20 gradi centigradi per almeno 1 h.
16. Utilizzando una centrifuga refrigerata, far girare il campione 25 min a 14.000 x g/4 gradi centigradi.
17. Rimuovere il supernatante e sciacquare il pellet con 500 luna del 70% di etanolo. Girare per 5 min a 14.000 x g/4 gradi centigradi.
18. Rimuovere il prevero supernatante e l'aria secca per circa 5 min. Resuspend in 20 gradi di acqua priva di nuclenon.
19. Creare a 10x scorta di sonda diluindo il campione a una concentrazione di 10 ng/ 5x SSC (citrato saline-sodio; 750 mM NaCl, 75 mM citrato di sodio, pH 7.0), 1 mg/mL di RNA torula, 0,1 % Tween-20, 1x Soluzione di Denhardt, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA e 100g/mL heparin). Conservare a -20 gradi centigradi fino a nuovo utilizzo.

5. Analisi dell'espressione genica: fluorescenza nell'ibridazione situ

NOTA: Tutti gli involucri devono essere eseguiti con circa 1 mL di soluzione utilizzando una pipetta di trasferimento sterile e avvolta individualmente. La pipetta deve essere posizionata sul bordo della piastra durante la rimozione o l'aggiunta della soluzione, e i lavamenti devono essere eseguiti nel modo più dolce possibile per garantire che le cellule non siano scostate dalla superficie della piastra e perse.

1. Rimuovere 1x PBS dalla piastra (dal passaggio 3.10). Sostituire con 1x PBS fresco e incubare 5 min a temperatura ambiente.
2. Unire 25 mL di trietanolamina da 0,1 M (pH 8,0) con 62,5 . Mescolare bene. Lavare la piastra con questa soluzione per 10 min.
3. Lavare la piastra con 1x SSC per 5 min.
4. Lavare la piastra con 0,02 M HCl per 10 min per permeabilizzare le cellule.
5. Lavare 2x con 1x PBS per 5 min ciascuno.
6. Rimuovere la soluzione e aggiungere 1 mL di Hybridization Buffer (50% formamide, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM di citrato di sodio, pH 7.0), 1 mg/mL di RNA torula, 0,1% Tween-20, 1x Soluzione di Denhardt, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA e 100 g/mL di eparina) a piastra. Incubare agitando per almeno 6 h a 60 gradi centigradi.
7. Rimuovere il buffer di ibridazione e sostituire con 750 l una soluzione di 1x RNA Probe (forma diluita il brodo 10x realizzato al passaggio 4.19. Le sonde Sense RNA possono essere utilizzate come controllo negativo.
8. Incubare agitando per 8-14 h a 60 gradi centigradi.
9. Rimuovere la sonda e conservarla a -20 gradi centigradi.
   NOTA: 1x la diluizione della sonda può essere riutilizzata fino a tre volte prima di essere scartata.
10. Sciacquare la piastra con 0,2x SSC.
11. Lavare con s.p.a. fresco per 1 h a 60 gradi centigradi.
12. Spostare le piastre a temperatura ambiente ed eseguire l'acquisillo per 5 min.
13. Lavare la piastra con 0,2x SSC per 5 min.
14. Lavare la piastra con 1x PBT per 15 min.
15. Lavare la piastra con 2% H₂O₂ in 1x PBT (0.1% Triton-x-100) per 1 h.
    NOTA: Questa soluzione è sensibile alla luce, quindi dovrebbe essere resa fresca per ogni esperimento e schermata dalla luce. Le piastre devono anche essere schermate dalla luce o sventate durante questa incubazione.
16. Lavare la piastra con 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) per 15 min.
17. Diluire il Reagente di blocco al 2% nel buffer dell'acido maleico (100 mm di acido maschile, 150 mM NaCl, pH 7.5). Bloccare le cellule in questa miscela per almeno 1 h a temperatura ambiente.
18. Sostituire la soluzione di blocco con anticorpo anti-digoxygenin-POD diluito 1:1,000 in 2% Blocking Reagent in Maleic Acid Buffer. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
19. Sciacquare la piastra 3x con 1x TBST.
20. Lavare 4x con 2 mL di 1 TBST per almeno 15 min per lavaggio con dondolo continuo.
21. Lavare 2x con 1x PBT per almeno 10 min per lavaggio con dondolo continuo.
22. Diluire la tyramide coniugata Cy3 1:25 in 1x PBT. Lavare la piastra con 750 l di questa diluizione per 5 min.
    NOTA: Questa soluzione è estremamente sensibile alla luce e le piastre devono essere tenute screpolate o schermate dalla luce per il resto dell'esperimento per evitare il deterioramento del segnale.
23. Aggiungere a questa soluzione 2,5 lrate di 0,3% H₂O₂ e incubare con dondolo continuo per ulteriori 40 min a temperatura ambiente.
24. Lavare 4x con 1x TBST per almeno 15 min per lavaggio con dondolo continuo.
25. Risciacquare con 1x PBT.
26. Fissare le cellule incubando per 1 h a temperatura ambiente in 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA, e 1 mM MgSO₄ in 3.7% formaldeide).
27. Rimuovere la soluzione e sostituirla con 1x PBS. Conservare le piastre in un contenitore sventato a 4 gradi centigradi fino a un'ulteriore lavorazione.

6. Celle di imaging

NOTA: l'imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale invertito.

1. Posizionare la piastra campione sullo stadio del microscopio, allineando il marchio realizzato al punto 3.1 alla parte anteriore dello stage.
2. Mettere a fuoco l'immagine in modo che sia visibile lo sguardo della griglia scattata nel passaggio 3.4 come riferimento, regolare il campo visivo in modo che corrisponda al campo visivo acquisito nell'immagine di calcio (Sezione 3).
3. Acquisire immagini a campo luminoso sia della griglia che delle celle.
4. Illuminare i campioni con un laser TRITC da 595 nm. Regolare i valori di guadagno per distinguere in modo appropriato il segnale dallo sfondo utilizzando le immagini dalle celle di controllo negative e acquisire un'immagine fissa.
   NOTA: Idealmente, i livelli di fluorescenza di fondo sono determinati in base a una piastra di controllo negativa elaborata in parallelo con una sonda di RNA a senso non targeting. Le impostazioni di guadagno vengono regolate in modo che questa piastra sembri completamente nera (corrispondente ai livelli di sfondo), quindi mantenuta costante per le altre piastre immagini da quel lotto sperimentale.

7. Trattamento dei dati

NOTA: l'elaborazione dei dati è stata eseguita utilizzando il software Nikon Elements.

1. Aprire l'immagine di 2 h di calcio dal punto 3.7. Identificare i pixel corrispondenti a ogni singola cella selezionando Binario > Rilevamento macchie > Macchie luminose. Assicurarsi che il canale FITC sia selezionato.
2. I cerchi colorati appariranno sulle singole celle dopo la generazione di questo livello. Regolare i parametri di dimensione e distribuzione delle celle in modo che il maggior numero possibile di celle venga riconosciuto e associato a un identificatore univoco.
3. Tenere traccia delle celle in tutti i fotogrammi dell'immagine passando a Visualizza > Controlli analisi > Opzioni di rilevamento. Impostate 5 fotogrammi come spazio massimo tra le tracce, eliminate gli oggetti associati a meno di 600 fotogrammi e selezionate l'opzione Chiudi spazi. Selezionare Traccia binari per applicare il tracciamento delle celle all'immagine.
4. Dopo che le celle sono state tracciate, eliminare manualmente qualsiasi oggetto che non corrisponde a una singola cella (ad esempio un gruppo di celle). Tuttavia, i punti dati non dovrebbero essere esclusi da ulteriori analisi basate sulla morfologia della traccia di attività del calcio.
5. Nel riquadro Immagine, selezionare Visualizza sovrapposizione > Mostra ID oggetto binario. Scorrere fino alla fine dell'immagine (fotogramma 901) e selezionare Modifica > Crea istantanea vista (8bit RGB)> Fotogramma corrente > OK. Verrà creata un'istantanea dell'ultimo fotogramma dell'immagine con l'ID binario associato di ogni cella visibile. Salvare questa immagine.
6. Esportare i dati di serie temporali selezionando tutti gli oggetti seguiti da Esporta datiin Excel . Salvare l'output come file CSV.
7. Aprire l'immagine FISH. Ottimizzare il rilevamento spot come nei passaggi 7.1–7.2, utilizzando il canale TRITC anziché il canale FITC. Eliminare manualmente i file binari assegnati in modo non corretto, quindi selezionare Risultati misurazione automatica > Aggiorna misurazione per calcolare l'intensità del segnale di ogni cella. Esportare uno snapshot dell'immagine e una tabella dati ripetendo i passaggi 7.5 e 7.6.
8. Creare un foglio di calcolo in cui la colonna A è etichettata FISH Binary ID e la colonna B è etichettata ID binario di calcolo. Aprire le immagini esportate nei passaggi 7.5 e 7.7. Per ogni oggetto identificato nell'immagine FISH (passaggio 7.7), registrare l'ID binario nella colonna A. Quindi, individuare la cella corrispondente nell'immagine di calcio (passaggio 7.5) e registrare l'ID binario nella colonna B. Le celle che non possono essere identificate con sicurezza in entrambe le immagini non devono essere aggiunte al foglio di calcolo.
   NOTA: può essere utile utilizzare un programma di fotoritocco come Adobe Photoshop o l'editor di immagini GIMP per aprire entrambe le immagini, crearne una semitrasparente e sovrapporla all'immagine partner per identificare e collegare più facilmente i due ID binari associati a ogni cella.
9. Per ogni cella identificata, fascicolare (manualmente o con uno script) i dati relativi al calcio della serie temporale (associati all'ID binario del calcio ed esportati nel passaggio 7.6) e i dati dell'espressione genica (associati all'ID binario FISH ed esportati nel passaggio 7.7).
   NOTA: l'elaborazione e l'analisi dei dati a valle possono comportare la raccolta di questi dati in un'unica tabella di dati e l'applicazione di una serie di tecniche analitiche, tra cui il conteggio dei picchi, l'analisi frattale e l'entropia markoviaria che consentono allo sperimentatore di discernere nuovi modelli di attività del calcio ^17,18.

Risultati

Un esempio di successo di cellule dissociate preparate per l'imaging del calcio può essere visto nella Figura 2A. Le cellule sono densamente placcate, consentendo la massima quantità di informazioni da raccogliere da ogni immagine, ma non così densamente placcate che le singole cellule non possono essere distinte con sicurezza l'una dall'altra. La fluorescenza viene rilevata per ogni cella definita nel periodo di imaging di 2 h. La visualizzazione di un grafico composito contenente le tracce per tutte le celle registrate in un esperimento rivela il grado in cui le misurazioni sfuse o della popolazione possono oscurare modelli più sfumati di comportamento di chiodare (Figura 2B). Quando i profili registrati delle singole cellule sono isolati, è possibile identificare chiaramente esempi dell'attività irregolare di chiodare caratteristica delle cellule progenitrici neurali. A differenza dei neuroni maturi, le cellule neuronali embrionali presentano natura irregolare, altamente variabile e complessa dell'attività del calcio (Figura 2B). Per quantificare questa complessità, è stata applicata l'applicazione di diversi metodi di analisi dei dati^17,18, inclusi diversi parametri per definire un picco (Figura 2C).

La fluorescenza di successo nell'ibridazione situ, compresa laprogettazionee la sintesi di successo di una sonda antisenso mRNA, può essere valutata confrontando la piastra sperimentale con un controllo dello sfondo incubato con un controllo RNA senso non vincolante ( Figura 3A,B). Un controllo positivo della sonda può essere eseguito anche elaborando un tipo di cellula noto per esprimere l'mRNA bersaglio a livelli rilevabili.

L'identificazione della stessa cellula nell'imaging di calcio e FISH richiede che le cellule mantengano all'incirca la stessa posizione durante l'ibridazione e l'elaborazione della sonda. Se le piastre vengono maneggiate grossolanamente o i fusi vengono eseguiti con troppa forza, le celle possono essere spostate dalla superficie della piastra e perse quando la soluzione viene scartata o depositata in una posizione diversa sulla piastra, rendendo impossibile la corrispondenza tra le immagini(Figura 4A). Se questa interruzione interessa solo alcune delle celle nel campo visivo, potrebbe essere comunque possibile rilevare e assegnare alcune celle all'interno dell'immagine (Figura 4B). Tuttavia, la quantità massima di dati viene ottenuta da un esperimento in cui FISH viene eseguita con attenzione e poche celle vengono perse o riposizionate tra le immagini (Figura 4C).

Una volta raccolti i dati per descrivere sia l'attività del calcio che l'espressione genica di un numero ragionevole di cellule nelle fasi di sviluppo di interesse, è possibile eseguire ulteriori analisi per valutare le correlazioni tra queste due caratteristiche (Figura 1). Una serie di metriche sono state applicate per quantificare i modelli di attività del calcio, tra cui il conteggio dei picchi/frequenza, la potenza media, la stima dell'esponente Hurst e la misurazione dell'entropia markoviana^17,18. L'espressione genica può essere definita quantitativamente in base al livello di fluorescenza assoluta o classificata su una scala binaria (sì/no), a seconda delle domande sperimentali affrontate.

I risultati degli esperimenti che hanno raccolto l'attività del calcio con l'espressione dei geni marcatori progenitrici neurali hanno rivelato numerose associazioni tra modelli specifici di attività del calcio e fenotipi del neurotrasmettitore. Nella fase della piastra neurale (stadio 14), le cellule GABAergic che esprimono il marcatore del neurone inibitorio gad1.1 presentano un'attività di calcio più regolare e più alta di quella delle cellule che mancano di espressione gad1.1 (Figura 5A). Inoltre, mentre queste cellule che esprimono gad1.1sono associate a livelli più elevati di chiodare ad alta ampiezza, l'agguato a bassa ampiezza è più frequente nelle cellule glutamategiche che esprimono il marcatore del neurone eccitatorio slc17a7.

Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale. Barra della scala: 100 m. Le immagini nei pannelli 3-5 sono state scattate da Paudel et al. (2019)¹⁷. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: immagini di calcio e profili di attività di esempio. (A) Attività del calcio intracellulare come riportato da Fluo4-AM. Ogni immagine da 2 h è composta da 901 fotogrammi, con una cornice rappresentativa qui. (B) Trama composita dell'intensità della fluorescenza nel tempo in tutte le celle all'interno del campo visivo immagine. Le tracce indicano chiaramente il fotosbiancamento del tintura indicatore (Fluo4) straordinario. La trama raster in alto a sinistra mostra tracce rappresentative dell'attività del calcio dopo l'applicazione di un algoritmo di de-trending sviluppato da Eilers e Boelen¹⁹, dove le cellule mostrate qui mostrano diversi modelli di comportamento chiodare. (C) Applicazione di diverse soglie (150% e 200% della linea di base, dove la linea di base è la media dell'intensità fluorescente di tendenza) per definire un picco (frecce verdi e blu). Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Imaging FISH. (A) FISH eseguita con una sonda RNA senso non vincolante come controllo negativo. Le impostazioni di imaging sono state regolate in modo che nessuna cella appaia fluorescente. Alcuni campi visivi possono includere detriti non cellulari con una certa fluorescenza, come si vede negli angoli in alto a destra e in basso a destra di (A); questi possono essere ignorati ai fini dell'impostazione di sfondo. (B) Le stesse impostazioni di imaging vengono quindi utilizzate per l'immagine di una piastra sperimentale (sonda rna antisense). La fluorescenza in queste condizioni corrisponde all'espressione genica sopra lo sfondo. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: sovrapposizione dell'immagine e coregistrazione. Rappresentazioni schematiche di un campione di immagine per l'attività del calcio (cellule rappresentate da cerchi verdi pieni) e dopo FISH (cellule rappresentate da cerchi rossi ombreggiati). (A) Le celle che si sono spostate in modo significativo durante la gestione e l'elaborazione del campione non possono essere identificate in modo affidabile tra le due immagini. (B) L'interruzione delle celle può interessare solo alcune celle nel campo visivo. Alcune celle possono essere chiaramente identificate in entrambe le immagini, mentre altre non possono essere abbinate con sicurezza. (C) Se i campioni vengono trattati con attenzione, la maggior parte delle cellule rimarrà indisturbata e può essere identificata in entrambe le immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Un esempio di applicazione di questo metodo, boxplot che mostrano associazioni tra l'attività del calcio e l'espressione genica (GABA e Glut per i geni gad1.1 e slc17a7 rispettivamente) nella fase della piastra Xenopus neural laevis. Allo sta1,1-postive cellule (GABA) mostrano maggiore ampiezza e più regolare attività di calcio come definito da (A) entropia markoviaria18 e(B)picco conta utilizzando soglie 125%, 150%, 200% e 300% della media della media di intensità fluorescente fluorescente (linea di base)¹⁷ rispetto alle cellule positive slc177a . Le stelle indicano differenze statisticamente significative in base sia al test Kolmogorov-Smirnov a due campioni corretto da Bonferroni (p < 0,05) che alle statistiche d di Cohen per le dimensioni dell'effetto (n : 5 colture e >100 celle; La cifra è stata ridisegnata e adattata dal set di dati ottenuto da Paudel et al.¹⁷. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Sono stati osservati modelli caratteristici di attività del calcio nelle cellule che compongono il sistema nervoso in via di sviluppo, con tipi specifici di attività associati a processi di neurosviluppo distinti. Tuttavia, un'ulteriore comprensione dei meccanismi con cui questi modelli di attività ad alta densità di informazioni sono tradotti in risposte trascrizionali richiede che le informazioni sull'attività del calcio e sull'espressione genica vengano raccolte con la risoluzione di una singola cellula. Mentre i sistemi che presentano un'attività di calcio più stereotipata, come i neuroni maturi, possono essere ragionevolmente saggiati a livello di massa, i modelli irregolari che caratterizzano il sistema nervoso embrionale sono facilmente mascherati da registrazioni meno precise.

Il quadro sperimentale stabilito in questo protocollo è facilmente adattabile a un'ampia varietà di tipi di cellule e reporter fluorescenti. I tessuti contenenti praticamente qualsiasi tipo di cellula o combinazione di tipi di cellule possono essere sezionati da un organismo modello di interesse e placcati per l'imaging a singola cellula. Oltre a consentire l'identificazione delle cellule e l'isolamento dell'effetto dei processi cell-autonomi, un approccio primario di coltura cellulare consente allo sperimentatore di definire i componenti multimediali come desiderato. Ad esempio, sono stati effettuati esperimenti che confrontano l'attività dei precursori neuronali nella soluzione 2 mM Ca² per studiare se le relazioni tra la frequenza dei picchi e il fenotipo del neurotrasmettitore nel midollo spinale embrionale possano essere riassunte senza l'influenza delle interazioni cellula-cellula^13,20.

Mentre questo protocollo sfrutta il marcatore fluorescente Fluo4-AM per rilevare l'attività del calcio intracellulare, a seconda dei criteri di selezione, gli utenti possono selezionare altri marcatori disponibili in commercio²¹, compresi gli indicatori di calcio codificati geneticamente. Allo stesso modo, i marcatori alternativi potrebbero essere utilizzati per monitorare i cambiamenti dinamici alla concentrazione di uno ione di interesse (tra cui K^,Na, e n²) , potenziale di membrana, o pH cellulare. Le impostazioni di imaging e la durata dell'immagine possono essere modificate in base alle esigenze.

Anche se abbiamo correlato l'attività del calcio e il fenotipo neuronale come applicazione specifica, questo metodo è applicabile anche per una varietà di altre proprietà cellulari. Ad esempio, la fluorescenza nell'ibridazione situ può essere eseguita con sonde contro qualsiasi gene di interesse, incluso il marcatore neuronale ChAT o il fattore di trascrizione Engrailed, consentendo il rilevamento sensibile di un pannello personalizzabile di specie di mRNA. Queste sonde possono essere progettate per essere specifiche dell'isoformazione, supportando ulteriori specificità di destinazione, se lo si desidera. Double FISH può essere eseguito utilizzando sonde coniugate a diversi due fluorofori diversi, consentendo la valutazione simultanea dell'espressione di più geni. Tuttavia, i fusti aggiuntivi richiesti da questo tipo di esperimento sono associati a una maggiore probabilità di perdita o movimento cellulare e richiedono esperienza e delicatezza per essere eseguite con successo.

Indipendentemente dalle modifiche specifiche dell'esperimento apportate a questo protocollo, esistono diversi passaggi chiave che richiedono un'attenta attenzione. Le dissezioni devono essere eseguite con cura per rimuovere tutti i tessuti contaminanti o le popolazioni cellulari; poiché il patterning spaziale viene perso quando gli espianti sono dissociati, tutte le cellule rimanenti dai tessuti vicini saranno intervallate e indistinguibili dalle cellule di interesse. Dopo che le cellule sono placcate, i campioni devono essere maneggiati nel modo più delicatamente possibile per evitare che le cellule vengano slostate. Ancora più importante, questo significa che tutte le modifiche alla soluzione devono essere eseguite lentamente e con attenzione, con la pipetta posizionata sul bordo della piastra quando la soluzione viene rimossa e aggiunta. Ciò garantirà che le cellule possano essere identificate con sicurezza sia nelle immagini di calcio che in immagini FISH. Se le celle vengono interrotte durante l'elaborazione, potrebbe essere impossibile identificare alcune o tutte le celle corrispondenti tra le due immagini. Consigliamo di escidare sul lato della cautela con queste assegnazioni, in modo che solo le cellule corrispondenti inequivocabilmente vengono utilizzate per ulteriori analisi.

A seconda della questione biologica affrontata, può essere appropriata una varietà di approcci di analisi. L'attività del calcio di serie temporali può essere elaborata e quantificata in diversi modi, con flessibilità di sperimentazione nella scelta dei parametri di de-trending, metriche di analisi e parametri di analisi (ad esempio, la percentuale della soglia di base utilizzata per definire un picco di calcio). Le correlazioni tra l'attività del calcio e il livello di espressione genica possono essere tratte analizzando l'espressione genica come valore di fluorescenza assoluta o relativa estratta dall'immagine FISH. In alternativa, è possibile tracciare correlazioni tra l'attività del calcio e l'espressione genica (presenza/assenza) definendo una soglia di fluorescenza per il segnale positivo di espressione genica e assegnando identificatori "sì" o "no" alle singole cellule. Nel complesso, questo schema sperimentale fornisce una pipeline incredibilmente flessibile per la raccolta e l'analisi preliminare dei dati delle serie temporali in combinazione con i dati dell'espressione genica con corrispondenza cellulare. Tali esperimenti saranno fondamentali per comprendere meglio le complesse relazioni tra la dinamica cellulare e i cambiamenti trascrizionali, come esemplificato dall'identificazione di modelli di attività del calcio caratteristici dei precursori neuronali inibitori ed eccitatori nei precursori neuronali embrionali Xenopus laevis.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Per la zootecnia e la Coltura cellulare
CHORULON (gonodotropina corionica)	Merck Animal Health
Sale di gentamicina solfato	Millipore Sigma	G1264
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Piastre di Petri Pyrex, 100 mm x 20 mm	Millipore Sigma	CLS3160102
Piastre per colture tissutali Corning Falcon Easy-Grip, 35 mm	Fisher Scientific	08-772A
Piastre per colture tissutali Corning Falcon Easy-Grip, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Piastre per colture tissutali standard Falcon	Fisher Scientific	08-772E
Thermo Scientifc Nunc Piastre per colture cellulari / Petri, piastra 35x10 mm, Nunclon Delta	Fisher Scientific	12-565-90
Fisherbrand Pipette di trasferimento monouso standard, non graduate; Lunghezza: 5,875 pollici; Capacità: 7,7 mL	Fisher Scientific	13-711-7M
Etile 3-amminobenzoato metansolfonato	Millipore Sigma	E10521
Collagenasi B	Millipore Sigma	11088807001
Dumont #55 Pincipe, Dumostar	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 Pincipe, Dumostar	Fine Science Tools	11295-00
Superficie per colture cellulari micro-rigate in Cellattice	Nexcelom Bioscience	CLS5-25D-050
Per imaging del calcio
Fluo-4, AM, cellulare permeans	Thermo Fisher Scientific	F14201
Pluronic F-127, 0,2 e micro; m filtrato (10% di soluzione in acqua)	Thermo Fisher Scientific	P6866<
strong>Per RNA Generazione di sonda
PureYield Plasmidi Miniprep System	Promega	A1222
rATP	Promega	P1132
rCTP	Promega	P1142
rGTP	Promega	P1152
rUTP	Promega	P1162
Digoxigenina-11-UTP	Millipore Sigma	3359247910
Inibitore della RNAsi	Thermo Fisher Scientific	N8080119
T3 RNA polimerasi	Promega	P2083
T7 RNA polimerasi	Promega	P2075
SP6 RNA polimerasi	Promega	P1085
RQ1 Soluzione di precipitazione LiCl Dnase Promega		M6101
(7,5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9480
Per fluorescenza Ibridazione in situ
Anidride acetica	Thermo Fisher Scientific	320102
Reagente bloccante	Millipore Sigma
Anti-Digoxigenina-POD, Fab frammenti	Millipore Sigma	11207733910
Cy3 Estere NHS mono-reattivo	Millipore Sigma	GEPA13105
Solution Componenti
Cloruro di calcio, 96% extra puro, polvere, anidro, ACROS Organixs	Fisher Scientific	AC349610
Cloruro di calcio diidrato	Millipore Sigma	C3306
CHAPS idrato	Millipore Sigma	C3023
Soluzione di Denhardt (50X)	Thermo Fisher Scientific	750018
DTT, grado molecolare (DL-ditiotreitolo)	Promega	P1171
Acido etilendiamminotetraacetico, sale disodico diidrato	Fisher Scientific	S311
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico	Millipore Sigma	E3889
Formamide (deionizzata)	Thermo Fisher Scientific	AM9342
Herparin sale sodico dalla mucosa intestinale suina	Millipore Sigma	H3393
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher Scientific	11344041
Soluzione di perossido di idrogeno	Millipore Sigma	H1109
L-Cisteina	Millipore Sigma	168149
Cloruro di magnesio, puro, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC223211000
Solfato di magnesio, puro al 97%, ACROS Organixs, anidro	Fisher Scientific	AC413480050
Acido maleico, 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	ACS125231000
MOPS (Cristalli bianchi fini/Biologia molecolare), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP308
Cloruro di potassio	Millipore Sigma	P9541
Acido ribonucleico da lievito torula, Tipo IX	Millipore Sigma	R3629
Cloruro di sodio	Millipore Sigma	S7653
Trietanolammina	Millipore Sigma	90279
Tris	Millipore Sigma	GE17-1321-01
TWEEN 20	Millipore Sigma	P9416
Equipment
Laminar Flow Hood	modello di scelta
Microscopio da dissezione	modello di scelta
Microscopio a fluorescenza invertita	Nikon	TE200
incubatore a scuotimento	Nikon
Modello di centrifuga refrigerata	scelta
Varie
Sistema di filtraggio sottovuoto per flaconi Corning, 0,22 &; m pore, capacità bottiglia 500 ml	Millipore Sigma	CLS430769
Falcon 50mL Provette da centrifuga coniche	Fisher Scientific	14-432-22