Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per studiare la localizzazione in vivo degli anticorpi nei modelli di xenograft tumorale dei topi.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali sono farmaci multifunzionali ad alta affinità che funzionano con meccanismi indipendenti variabili per eliminare le cellule tumorali. Negli ultimi decenni, il campo dei coniugati anticorpo-farmaco, degli anticorpi bispecifici, dei recettori degli antigeni chimerici (CAR) e dell'immunoterapia oncologica è emerso come l'area più promettente delle indagini di base e terapeutiche. Con numerosi studi umani di successo che prendono di mira i recettori del checkpoint immunitario e le cellule CAR-T nella leucemia e nel melanoma a un ritmo rivoluzionario, è un momento molto emozionante per le terapie oncologiche derivate dalle variazioni dell'ingegneria degli anticorpi. Purtroppo, un numero significativamente elevato di anticorpi e terapie a base di CAR si sono dimostrati deludenti anche negli studi sull'uomo di tumori solidi a causa della limitata disponibilità di cellule dell'effettore immunitario nel letto tumorale. È importante sottolineare che anche la distribuzione aspecifica di anticorpi terapeutici in tessuti diversi dai tumori contribuisce alla mancanza di efficacia clinica, tossicità associata e insufficienza clinica. Poiché la fedele traduzione di studi preclinici su percorsi clinici umani è altamente basata sull'efficacia dello xenograft tumorale dei topi e sugli studi di sicurezza, qui evidenziamo un metodo per testare il tumore e la distribuzione generale dei tessuti degli anticorpi terapeutici. Ciò si ottiene etichettando l'anticorpo purificato proteina-A con colorante fluorescente vicino all'infrarosso seguito da immagini dal vivo di topi portanti di tumore.

Introduzione

La FDA approvò il primo anticorpo monoclonale che prendeva di mira CD3 (OKT3, Muromonab) nel 1986^1,2. Da allora per i prossimi vent'anni, c'è stata una rapida esplosione nel campo dell'ingegneria degli anticorpi a causa del travolgente successo degli anticorpi contro gli inibitori del checkpoint^{immunitario 3}. Oltre all'attivazione indiretta del sistema immunitario, gli anticorpi sono mirati a segnalare direttamente le cellule tumorali per coinvolgere con precisione le cellule dell'effettore immunitario, innescare la citotossicità attraverso l'agonista del recettore della morte, bloccare la segnalazione di sopravvivenza delle cellule tumorali, ostruire l'angiogenesi (crescita dei vasi sanguigni), vincolare i regolatori del checkpoint immunitario, fornire radioisotopi, farmaci chemioterapici e siRNA come agenti coniugati². Inoltre, lo studio dei frammenti variabili a catena singola (scFv) di vari anticorpi sulla superficie delle cellule T derivate dal paziente e delle cellule NK (CAR-T e CAR-NK) è un'area in rapida crescita di indagini cliniche per terapie a base cellulare⁴.

L'altissima affinità dei farmaci a base di anticorpi che fornisce selettività all'antigene che esprime le cellule tumorali lo rende un agente attraente. Allo stesso modo, il parto mirato e la ritenzione tumorale di un anticorpo terapeutico (o di un farmaco chimico) è la chiave per bilanciare l'efficacia rispetto alla tossicità. Pertanto, un gran numero di strategie basate sull'ingegneria proteica che includono ma non sono limitate agli anticorpi^{bispecifici 5} e trispecifici^{6 vengono} sfruttati per migliorare significativamente la ritenzione tumorale ottimizzata dell'avidità delle terapie iniettate per via endovenosa (IV)^5,7. Qui, descriviamo un semplice metodo basato sulla fluorescenza per affrontare la distribuzione tumorale e tissutale di anticorpi anti-cancro potenzialmente efficaci.

Poiché i tessuti animali possiedono autofluorescenza quando eccitati nello spettro visibile, gli anticorpi sono stati inizialmente etichettati con colorante vicino all'infrarosso (ad esempio, IRDye 800CW). Per prove di indagini concettuali, abbiamo fatto uso di anticorpi di targeting del recettore del folato alfa-1 (FOLR1) chiamati farletuzumab e del suo derivato chiamato anticorpo Cytotoxicity di ancoraggio bispecifico (BaCa)⁷ che copresi bersagli FOLR1 e recettore della morte-5 (DR5)⁸ in un anticorpo ricombinante. FOLR1 è un recettore bersaglio sovraespresso ben definito nelle cellule tumorali ovarico e TNBC, negli xenografti tumorali e nei tumori dei^{pazienti 9}. In particolare, ci sono molteplici sforzi per sfruttare clinicamente FOLR1 utilizzando approcci basati su anticorpi per coinvolgere cellule dell'effettore immunitario e coniugati di farmaci anticorpali (ADC) per tumori ovarico e^{mammario 10,11}.

In questo documento sui metodi, abbiamo clonato, espresso e purificato l'anti-FOLR1 clinico (farletuzumab) insieme ad altri anticorpi di controllo utilizzando il sistema di espressione CHO. L'isotipo IgG1 e un anticorpo clinico anti-idiotipo mucina-16 chiamato abagovomab^{12 sono} stati utilizzati come controlli negativi. A seguito della purificazione proteina-A, gli anticorpi indicati sono stati etichettati con IRDye 800CW e sono stati somministrati nella vena di coda di topi nudi con xenografti tumorali ovarico o FOLR1 umano stabilmente trasfetto che esprime xenografti di cancro del colon murino. La localizzazione degli anticorpi è stata monitorata mediante imaging dal vivo utilizzando spettro di imaging in vivo in più punti di tempo^{diversi 7}. Questo metodo non richiede alcuna modifica genetica o iniezione del substrato per consentire l'emissione luminosa ed è significativamente più veloce, conveniente ed efficiente. Il protocollo generale di clonazione, espressione, purificazione ed etichettatura descritto di seguito può essere applicato a qualsiasi anticorpo clinico e non clinico se sono disponibili sequenze di catene pesanti e leggere.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono la manipolazione degli animali e gli studi sugli xenografti tumorali sono state riviste e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) qui all'Università della Virginia e conformi ai pertinenti standard normativi

1. Espressione e purificazione degli anticorpi

1. Mantenimento delle celle CHO
   1. Far crescere le cellule CHO in FreeStyle CHO Media integrato con integratore di glutammina 1x disponibile in commercio a 37 °C tremando a 130 giri/min con 5% di CO₂ utilizzando flaconi delong Erlenmeyer in vetro o monouso.
      NOTA: Si consiglia vivamente di utilizzare un pallone sconcertato con tappo ventilato per una maggiore agitazione e per migliorare il trasferimento di gas durante le condizioni di scuotimento. Significativamente ridotta la resa degli anticorpi è stata ottenuta con fiasche regolari (non sconcertate) a causa della limitata agitazione della coltura di sospensione.
   2. Mantenere il numero di cella compreso tra 1-5 x 10⁶ celle/mL con >95% di vitalità cellulare. Se il numero di celle aumenta di oltre 5 x 10⁶ celle/mL, dividere le celle. Non consente mai alle celle CHO di raggiungere meno di 0,2 x 10⁶ celle/mL.
2. Trasfezione di cellule CHO
   1. Far crescere le cellule CHO in 200 mL di supporti (2 x 10⁶ celle/mL) in fiasche sconcertate delong Erlenmeyer.
      NOTA: Le colture di sospensione coltivate in fiasche sconcertate hanno sempre prodotto rese proteiche più elevate rispetto a quando coltivate in fiasche non sconcertate.
   2. In un tubo da 15 mL, prendi 5 ml di supporti CHO FreeStyle e aggiungi 50 μg di DNA clone VH e 75 μg di DNA clone VL. Vortice da mescolare bene.
   3. Incubare la miscela di DNA a temperatura ambiente per 5 minuti.
      NOTA: Un'incubazione più lunga riduce le rese proteiche.
   4. Aggiungere 750 μL di 1 mg/mL di polietileneimina (PEI) alla soluzione di DNA e vortice aggressivo la miscela per 30 s. Incubare a temperatura ambiente per ulteriori 5 minuti.
      NOTA: Il PEI deve essere reso fresco. Il ciclo di disgelo multiplo di PEI riduce significativamente la resa complessiva.
   5. Aggiungere l'intera miscela di DNA e PEI sulle cellule mentre si scuote manualmente il pallone. Incubare immediatamente i flaconi sconcertati delong Erlenmeyer con cellule a 37 °C che tremano a 130 giri/min.
3. Espressione
   NOTA: L'anticorpo ha un peptide del segnale secretorio progettato fino all'estremità N-terminale, che aiuta gli anticorpi a essere secreti nel supporto.
   1. Far crescere le cellule trasfette a 37 °C, tremando a 130 giri/min il giorno 1.
   2. Il giorno 2, aggiungere 2 mL di 100x agente anti-grumo e 2 mL di soluzione antibatterica-antimicotica 100x. Spostare il pallone a temperatura più bassa (32-34 °C), con scuotimento a 130 giri/min.
   3. Ogni quinto giorno, aggiungere 10 mL di mangime Tryptone N1 e 2 mL di integratore di glutammina 100x.
   4. Continuare a contare le cellule ogni tre giorni usando l'emocitometro dopo aver macchiato un'aliquota di cellule con macchia blu tripano. Assicurarsi che la vitalità della cella rimanga al di sopra dell'80%.
   5. Il giorno 10 o 11, raccogliere il mezzo per la purificazione degli anticorpi. Ruotare la coltura a 3000 x g,4 °C per 40-60 min e quindi filtrare il supporto chiaro utilizzando filtri di bottiglia da 0,22 μM.
4. Purificazione
   NOTA: La purificazione degli anticorpi viene eseguita utilizzando la colonna Protein-A disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), utilizzando una pompa peristaltica.
   1. Equilibrare la colonna con due colonne di tampone di legame (20 mM di fosfato di sodio a pH 7.4).
   2. Passare il supporto filtrato contenente anticorpi (ottenuto nel passaggio 1.3.5) attraverso la colonna alla portata di 1 mL/min.
   3. Lavare la colonna con un volume di due colonne di buffer di associazione.
   4. Eludere l'anticorpo in frazioni di 500 μL utilizzando un tampone di eluizione di 5 mL (acetato di sodio da 30 mM a pH 3,4).
   5. Neutralizzare il pH dell'anticorpo eluitato aggiungendo 10 μL di tampone di neutralizzazione (3 M acetato di sodio a pH 9) per frazione.
      NOTA: La frazione numero 3-6 contiene la maggior parte dell'anticorpo. Si consiglia di mantenere tutte le frazioni nel caso in cui l'anticorpo sia eluitato in una frazione successiva al previsto.
   6. Misurare la concentrazione di anticorpi purificati utilizzando uno spettrofotometro selezionando il protocollo predefinito per IgG. La concentrazione finale dell'anticorpo si ottiene in mg/mL considerando il peso molecolare e il coefficiente di assorbimento.

2. Etichettatura fluorescente

NOTA: Gli anticorpi sono etichettati con il colorante infrarosso che contiene un gruppo reattivo estere NHS, che si accoppia alle proteine e forma un coniugato stabile. Questa reazione è sensibile al pH e funziona meglio a pH 8.5. I coniugati fluorescenti etichettati con il colorante mostrano un assorbimento massimo di 774 nm e un'emissione massima di 789 nm. pH 8.5 è fondamentale per una coniugazione efficace.

1. Dializzare 0,5 mL dell'anticorpo utilizzando una cassetta di dialisi (0,1-0,5 mL) in 1 L di tampone di coniugazione (tampone fosfato da 50 mM a pH 8,5). Dopo 4 ore trasferire la cassetta di dialisi in tampone fresco e dializzare durante la notte.
2. Impostare una reazione di coniugazione aggiungendo 0,03 mg di IRDye 800CW per 1 mg di anticorpo in un volume di reazione di 500 μL.
   NOTA: IRDye 800CW viene sciolto in DMSO ad una concentrazione di 10 mg/mL.
3. Effettuare reazioni di etichettatura per 2 ore a 20 °C.
   NOTA: Aumentare il tempo oltre le 2 ore non migliora l'etichettatura.
4. Purificare i coniugati etichettati per ampia dialisi contro 1x PBS.
5. Stimare il grado di etichettatura misurando l'assorbanza del colorante a 780 nm e l'assorbanza della proteina a 280 nm. Il contributo colorante al segnale a 280 nm è del 3%.
6. Calcola il rapporto colorante/proteina usando questa formula:
   
   dove 0,03 è un fattore di correzione per l'assorbanza del colorante utilizzato a 280 nm (pari al 3,0 % della sua assorbanza a 780 nm), ε_Dye e ε_{Protein sono} coefficienti di estinzione molare rispettivamente per il colorante e la proteina (anticorpo).
   NOTA: ε_{Dye è} 270.000 M^-1 cm^-1 e ε_{Protein è} 203.000 M^-1 cm^-1 (per un tipico IgG) in miscela 1:1 di PBS: metanolo. Proteine diverse dall'IgG possono avere coefficienti di estinzione molare molto diversi. L'uso di un corretto coefficiente di estinzione per la proteina di interesse è essenziale per una determinazione accurata del rapporto D/P.
7. Calcola la concentrazione finale di proteine usando questa formula:
   
   NOTA: Confermare sempre l'efficacia legante l'antigene di anticorpi etichettati e non etichettati utilizzando ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) o citometria del flusso prima di procedere a studi in vivo.

3. Studi di xenograft di topo

1. Preparazione di cellule tumorali per iniezione
   1. Far crescere le cellule OVCAR-3 in RPMI-1640 Medium, integrate con il 10% di FBS e 1x penicillina-streptomicina.
   2. Il giorno prima dell'iniezione, le cellule della sottocoltura in nuovi piatti di coltura da 100 mm con 10 mL di mezzo / piatto completo. Utilizzare il numero di cella di 0,5-1 x 10⁶ celle/piatto.
   3. Incubare le colture a 37 °C di temperatura, 95% di umidità e 5% di CO₂ per 20-24 ore.
   4. Il giorno dell'iniezione, rimuovere il mezzo di crescita dai piatti di coltura. Risciacquare accuratamente lo strato cellulare con ca²⁺/Mg²⁺ dulbecco libero dulbecco tamponato di fosfato (DPBS) per rimuovere cellule morte, detriti cellulari e tutte le tracce di siero, che possono interferire nell'azione della tripsina.
   5. Tripinare le cellule aggiungendo 1,0-1,5 mL di soluzione di Tripina-EDTA ad ogni piatto e cercare di diffondere la soluzione inclinando il piatto tutto intorno seguito da incubazione a 37 °C per 5-10 min.
      NOTA: Osservare le cellule al microscopio invertito per controllare lo stato effettivo di tripsicinazione. Sotto la tripsicinazione si traduce in un minor numero di distacco cellulare dalla superficie del piatto di coltura, la tripsininazione induce stress cellulare. Quindi, una corretta tripinazione è importante.
   6. Aggiungere 1,0-1,5 mL di mezzo di crescita completo a ogni piatto per interrompere l'azione della tripina, dopo di che sospendere le celle tubazionando delicatamente.
      NOTA: La pipettazione delicata è importante per mantenere la salute delle cellule.
   7. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml e girare a 250 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   8. Raccogliere il pellet di cella dopo aver rimosso il supernatante e lavare le cellule sospendendo il pellet in 1x DPBS.
   9. Ruotare la sospensione cellulare a bassa velocità 250 x g per 5 minuti.
   10. Aggiungere 500 μL di DPBS e sospendere di nuovo le celle mediante pipettazione delicata per ottenere sospensioni a cella singola.
   11. Contare le celle utilizzando emocitometro o contatore di celle automatizzato.
       NOTA: Per una migliore precisione, ripetere il conteggio per tre volte e prendere una media.
   12. Regolare il volume in modo tale che la densità finale delle celle sia di 1 x 10⁸ celle/mL.
2. Iniezione sottocutanea di cellule per sviluppare xenografti di topo
   NOTA: Tutte le procedure devono essere fatte in un armadio di sicurezza BSL2. Athymic Nude Foxn1^nu/Foxn1⁺ topi sono stati utilizzati nello studio attuale.
   1. Prendere 50 μL della sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml e mescolare con 50 μL di mezzo a matrice di membrana basale.
      NOTA: Il mezzo a matrice di membrana basale tende a formare uno stato simile a un gel a temperatura ambiente, quindi mantieni attentamente le cellule e la miscela media della matrice sul ghiaccio. Si consiglia di tenere tubi, punte e siringhe in frigo e quindi trasferire sul ghiaccio prima dell'iniezione animale.
   2. Agitare la miscela per evitare qualsiasi raggruppamento cellulare. Quindi, prendere questi 100 μL della miscela media a matrice di sospensione cellulare che contiene 5 x 10^{6 cellule,} in una siringa da 1 cc.
   3. Sollevare delicatamente la pelle dell'animale per separare la pelle dallo strato muscolare sottostante e iniettare lentamente la sospensione cellulare (100 μL) sotto la pelle (5 x 10^{6 cellule),} con un ago da 26 G. Attendere alcuni secondi prima di eserti l'ago, in modo che il mezzo della matrice del seminterrato possa formare la struttura semi-solida del gel insieme alle cellule sotto la pelle, impedendo alla miscela di uscire dal sito di iniezione.
      NOTA: Le cellule devono essere testate prima dell'iniezione per qualsiasi contaminazione che possa danneggiare topi immunodifesa. Durante l'iniezione non mettere l'ago troppo in profondità nella pelle in quanto ciò potrebbe formare il tumore più profondo del previsto.
   4. Tenere l'animale in una gabbia sterile e osservare per circa 20 minuti.
   5. Osservare i topi per 2-3 settimane e consentire al tumore di crescere fino a 500 mm³ dimensioni.

4. Localizzazione degli anticorpi utilizzando un sistema di imaging in vivo

NOTA: Le apparecchiature di imaging in vivo (vedi Tabella dei materiali)utilizzate in questo esperimento utilizzano una serie di filtri ad alta efficienza e algoritmi spettrali di non miscelazione per la visualizzazione non invasiva e il monitoraggio dell'attività cellulare e genetica all'interno di un organismo vivente in tempo reale. Il sistema fornisce sia capacità di monitoraggio della fluorescenza che della bioluminescenza.

1. Iniettare 25 μg di anticorpo etichettato colorante attraverso la vena della coda.
   1. Anestetizzare i topi che portano il tumore usando il 2% di isoflurane. Verificare la mancanza di risposta ai riflessi del pedale.
   2. Una volta che i topi smettono di muoversi, dilatare la vena laterale della coda applicando acqua di verme.
   3. Iniettare 25 μg (in 100 μL) di anticorpo etichettato utilizzando una siringa per insulina da 1 cc con un ago da 26 G.
   4. Allo stesso modo, come controllo negativo, etichettare e iniettare l'anticorpo isotipo IgG1 non specifico che non si rivolge alle cellule tumorali.
2. Eseguire immagini dal vivo in vivo dopo 8, 24, 48 ore, ecc. di iniezioni di anticorpi.
   1. Nel software associato fare clic su Inizializza nel pannello di controllo e verificare che la temperatura dello stadio sia di 37 °C.
   2. Accendere l'alimentazione dell'ossigeno, tutte le pompe del sistema di anestesia, l'alimentazione di gas isoflurane alla camera anestetica e impostare la valvola del vaporizzatore di isoflurane al 2%.
   3. Trasferire i topi nella camera anestetica e attendere che i topi siano completamente anestetizzati. Applicare l'unguento lubrificante per gli occhi per evitare l'asciugatura degli occhi.
   4. Passare al pannello di controllo, impostare l'imaging a fluorescenza tramite l'opzione Creazione guidata imaging e selezionare l'eccitazione a 773 nm e l'emissione a 792 nm.
      NOTA: le impostazioni di esposizione automatica predefinite forniscono una buona immagine fluorescente. Tuttavia, le preferenze di esposizione automatica possono essere modificate in base alle esigenze.
   5. Trasferire i topi anestetizzati nella camera di imaging e assemblarli sul campo di imaging usando il cono del naso. La fase di imaging offre la possibilità di ospitare 5 topi alla volta.
      NOTA: avere topi di controllo con immagini insieme ai topi di prova per avere una quantità simile di esposizione e altre impostazioni durante l'analisi.
   6. Una volta che tutto è pronto, selezionare l'opzione Acquisisci sul pannello di controllo per l'acquisizione dell'immagine.
   7. Con le impostazioni di esposizione automatica il sistema genera l'immagine entro un minuto. L'immagine generata è la sovrapposizione di fluorescenza su immagine fotografica con intensità di fluorescenza ottica visualizzata in unità di conteggi o fotoni, o in termini di efficienza.
   8. Dopo aver acquisito l'immagine, trasferire i topi dalla camera di imaging alla loro gabbia e osservare per il loro recupero per 1-2 minuti.
3. Ottimizzare ulteriormente l'immagine con gli strumenti e le funzioni forniti all'interno del software per l'analisi delle immagini. Gli strumenti di analisi delle immagini si trovano nella barra dei menu e nella tavolozza degli strumenti.
   1. In Regolazione immagine regolarela luminosità, il contrasto o l'opacità e selezionare la scala dei colori.
   2. Utilizzare gli strumenti roi per specificare una regione di interesse (ROI) in un'immagine ottica e misurare l'intensità del segnale all'interno del ROI. Se necessario, esportare i dati del segnale quantificati in un software di foglio di calcolo e tracciare i dati.
   3. Per gli studi di follow-up, analizzare le necrosi dei topi di vari tessuti (ad esempio fegato, polmone, cuore, rene, milza, cervello, ecc.) fianco a fianco per una distribuzione dettagliata non specifica di anticorpi etichettati fluorescentmente.
      NOTA: I dati possono essere ulteriormente supportati con ELISA specifica del tessuto utilizzando antigene (FOLR1 in questo caso) in 96 saggi.

Risultati

Nella metodologia descritta, prima abbiamo clonato anticorpi mirati al recettore del folato alfa-1 (FOLR1) chiamato farletuzumab, e un anticorpo bispecifico chiamato BaCa costituito da farletuzumab e lexatumumab insieme a anticorpi di controllo come abagovomab (sequenze fornite nel file complementare 1). I dettagli dei domini rappresentativi della variabile pesante (VH) e della luce variabile (VL) nei cloni di DNA (pVH, pVL) sono mostrati nella figura 1A. Per confermare i cl...

Discussione

L'erogazione selettiva e specifica del tessuto tumorale dell'agente terapeutico anti-cancro è la chiave per misurare l'efficacia e la sicurezza di una data terapia^{mirata 13}. Qui abbiamo descritto un approccio rapido ed efficiente per indagare la distribuzione dettagliata dei tessuti e del tumore di anticorpi BaCa clinici, farletuzumab e non clinici. L'approccio descritto è applicabile a qualsiasi anticorpo appena generato e può essere utilizzato insieme a un anticorpo clinicamente efficace (con le...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
FreeStyle CHO media	Gibco Life Technologies	Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 15240-062
Agente antiaggregante	Gibco Life Technologies	Cat # 01-0057DG
BD Siringa da insulina	BD BioSciences	Cat #329420
Calibro IVIS Spectrum	PerkinElmer	Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
Cy5 coniugato Anti-Human IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 35050-061
Kit Maxiprep per plasmidi HiPure	Invitrogen	Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Colonna	GE Healthcare	Cat # 11-0034-93
Infusione	Takara BioScience	STO344
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR	Cat # 929-70020
Isoflurano, USP	Covetrus	Cat # 11695-6777-2
Lubrificante Unguento per gli occhi	Refresh Lacri-Lube	Cat #4089
Matrigel	Corning	Cat # 354234
Reagente di trasfezione PEI	Thermo Fisher	Cat # BMS1003A Cassette
dialisi Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	Cat # 66333
Steritop Vacuum Filtri	Millipore Express	Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA	Gibco Life Technologies	Cat # 15400-054
Modelli sperimentali: Linee cellulari
Umano: OVCAR-3	American Type Culture Collection	ATCC HTB-161
Umano: Cellule CHO-K	Stabile trasformato nel nostro laboratorio	ATCC CCL-61
Topo: 4T1	Gentile dono dal Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38	Gentile dono dalla Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Autenticato da STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1	Generato nel nostro laboratorio (Questo documento)
Modelli sperimentali: Animal
Mice: Nudo atimico Foxn1nu/Foxn1+	Envigo	Ordini
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	Jackson Laboratory	Ordini