Articolo metodologico

Localizzazione e quantificazione dei begomovirus nei tessuti delle mosche bianche mediante immunofluorescenza e PCR quantitativo

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DOI:

10.3791/60731

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8 febbraio 2020

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1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un'immunofluorescenza e un metodo PCR quantitativo per la localizzazione e la quantificazione dei begomovirus nei tessuti degli insetti. Il protocollo di immunofluorescenza può essere utilizzato per co-localizzare proteine virali e vettoriali. Il protocollo PCR quantitativo può essere esteso per quantificare i virus in corpi di mosca intero e piante infettate da virus.

Abstract

I begomovirus (genere Begomovirus, famiglia Geminiviridae) sono trasmessi da mosche bianche del complesso bemisia tabaci in modo persistente e circolativo. Considerando gli ingenti danni causati dai begomovirus alla produzione agricola in tutto il mondo, è imperativo comprendere l'interazione tra i begomovirus e il loro vettore di mosche bianche. Per farlo, la localizzazione e la quantificazione del virus nei tessuti vettoriali è fondamentale. Qui, usando il virus del ricciolo delle foglie gialle di pomodoro (TYLCV) come esempio, descriviamo un protocollo dettagliato per localizzare i begomovirus nei midguts delle lamiche bianche, nelle ghiandole salivari primarie e nelle ovaie per immunofluorescenza. Il metodo si basa sull'uso di anticorpi specifici contro una proteina del mantello di virus, anticorpi secondari etichettati con coloranti e un microscopio confocale. Il protocollo può essere utilizzato anche per colocalizzare le proteine begomvirale e della mosca bianca. Descriviamo inoltre un protocollo per la quantificazione del TYLCV nei midgut sottabi, nelle ghiandole salivari primarie, nell'emolymph e nelle ovaie per PCR quantitativo (qPCR). Utilizzando primer specificamente progettati per TYLCV, i protocolli per la quantificazione consentono il confronto della quantità di TYLCV in diversi tessuti della mosca bianca. Il protocollo descritto è potenzialmente utile per la quantificazione dei begomovirus nel corpo di una mosca bianca e di una pianta infettata da virus. Questi protocolli possono essere utilizzati per analizzare la via di circolazione dei begomovirus nella mosca bianca o come complemento ad altri metodi per studiare le interazioni bianco-begomovirus.

Introduzione

Negli ultimi decenni, i begomovirus (genere Begomovirus, famiglia Geminiviridae) hanno causato gravi danni alla produzione di molte colture vegetali, fibre e ornamentali in tutto il mondo1. I begomovirus sono trasmessi in modo persistente dalla mosca bianca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), che è una specie complessa che contiene oltre 35 specie criptiche2,3. I begomovirus possono influenzare direttamente o indirettamente la fisiologia e il comportamento delle mosche bianche, come la fecondità4,la longevità4e la preferenza host5,6. Inoltre, l'efficienza di trasmissione di una determinata specie/ceppo di begomovirus varia per diverse specie criptiche della mosca bianca anche nelle stesse condizioni sperimentali7,8,9,10, indicando che esiste una complessa interazione tra begomovirus e mosche bianche. Per comprendere meglio i meccanismi alla base delle interazioni bianco-begomovirus, la localizzazione e la quantificazione del virus nei tessuti della mosca bianca sono essenziali.

Pomodoro giallo foglia curl virus (TYLCV) è un begomovirus che è stato segnalato per la prima volta in Israele, ma al giorno d'oggi provoca gravi danni alla produzione di pomodoro in tutto il mondo11,12. Grazie alla sua importanza economica, è uno dei begomovirus più studiati13. Come altri virus begomovirus monopartitici, TYLCV è un virus del DNA circolare a singolo filamento con una dimensione del genoma di circa 2.800 nucleotidi14. Mentre ancora in discussione, diverse linee di prova supportano la replica di TYLCV in whiteflies15,16,17. Inoltre, l'interazione delle particelle TYLCV e delle proteine delle mosche bianche è stata segnalata6,18,19,20. Per la trasmissione del virus, le mosche bianche acquisiscono TYLCV nutrendosi di piante infettate dal virus, i virioni passano lungo il canale alimentare per raggiungere l'esofago, penetrano nella parete centrale per raggiungere l'emolfo, quindi si traslocano nelle ghiandole salivari primarie (PSG). Infine, i virioni sono estratta con saliva lungo il condotto salivare in phloem21. Inoltre, diversi studi dimostrano che TYLCV è in grado di essere trasmesso transovarialmente dalle mosche bianche femminili alla loro prole22,23. In altre parole, per ottenere una trasmissione produttiva, il virus deve superare le barriere cellulari all'interno della moschea bianca per traslocare da un tessuto all'altro. Durante l'attraversamento di queste barriere, è probabile che si verifichino interazioni tra le proteine delle mosche bianche e del virus, probabilmente determinando l'efficienza con cui i virus vengono trasmessi.

L'immunofluorescenza è una tecnica comunemente utilizzata per l'analisi della distribuzione delle proteine. La specificità degli anticorpi che si legano al loro antigene costituiscono la base dell'immunofluorescenza. A causa dell'importanza economica di TYLCV, sono stati sviluppati anticorpi monoclonali contro la proteina del cappotto TYLCV, offrendo un modo altamente sensibile per localizzare il virus24. La BICR quantitativa (qPCR) consente la quantificazione sensibile e specifica degli acidi nucleici. Questa tecnica si basa più frequentemente sull'uso di sonda idrolisi (ad esempio TaqMan) o rilevamento di coloranti fluorescente (ad esempio, SYBR Green). Per qPCR basato su sonda idrolisi, sono necessarie sonde specifiche, che di conseguenza aumentano il costo. Il qPCR fluorescente basato su coloranti è più semplice e conveniente, perché le sonde di ibridazione specifiche per amplicon etichettate non sono richieste25. Finora, diversi studi hanno usato l'immunofluorescenza e il qPCR insieme ad altri metodi per studiare le complesse interazioni begomovirus-mosca bianca. Ad esempio, Pan et al. ha eseguito l'analisi qPCR e immunofluorescenza del virus nei tessuti della mosca bianca e ha scoperto che la differenza nella capacità di trasmettere il virus del germoglio riccio di tabacco (TbCSV) tra le specie di mosca bianca AsiaII 1 e Medio Oriente Asia Minore 1 (MEAM1) era dovuta al fatto che il virus era in grado di attraversare in modo efficiente la parete centrale dell'AsiaII1 ma non MEAM18. Allo stesso modo, mentre le mosche bianche mediterranee (MED) possono trasmettere facilmente TYLCV, non riescono a trasmettere il virus cinese a ricciolo a foglia gialla pomodoro (TYLCCNV). La trasmissione selettiva è stata studiata utilizzando il rilevamento dell'immunofluorescenza del virus nei PSG, il che ha dimostrato che tyLCCNV non attraversa facilmente i PSG delle mosche bianche MED26. La co-localizzazione dell'immunofluorescenza di TYLCV CP e la proteina marcatore di autofagia ATG8-II nei midguts della mosca bianca mostrano che l'autofagia svolge un ruolo fondamentale nel reprimere l'infezione di TYLCV nella moschea bianca27.

Qui, usando TYLCV come esempio, descriviamo un protocollo per la localizzazione dei begomovirus nei midgut, nei PSG e nelle ovaie con una tecnica di immunofluorescenza. La tecnica include la dissezione, la fissazione e l'incubazione con anticorpi secondari primari e con coloranti. I segnali di fluorescenza che mostrano la posizione delle proteine virali nei tessuti della mosca bianca possono quindi essere rilevati al microscopio confocale. Ancora più importante, questo protocollo può essere utilizzato per colocalizzare proteine begomovirale e whitefly. Descriviamo inoltre un protocollo per la quantificazione di TYLCV utilizzando QPCR a base verde SYBR in midgut, PSG, emolymph e ovaie, che può essere utilizzato per confrontare la quantità di virus in diversi campioni di tessuto a mosca bianca.

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Protocollo

1. Mosca bianca, virus, piante e acquisizione del virus

  1. Le mosche bianche posteriori (MEAM1) sul cotone (Gossypium hirsutum cv.
  2. Eseguire la PCR convenzionale basata su whitefly mitocondriale cytochrome oxidase I gene per determinare la purezza della popolazione di mosca bianca.
    1. Raccogliere 20 mosche bianche adulte e trasferirle singolarmente su un tubo PCR contenente 30 tamponamento di lisi (10 mM Tris, pH - 8,4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatina, 0,45% [vol/vol/vol/] Nonidet P 40, 60 g/Kl Proteine).
    2. Aggiungere 5-7 perline ceramiche (2 mm di diametro) in ogni tubo PCR e macinare i campioni per eseguire la lisi tissutale.
    3. Incubare tutti i campioni a 65 gradi centigradi per 1 h seguito da 10 min a 100 gradi centigradi, quindi centrifugare brevemente. Utilizzare questo supernatante come modello per l'amplificazione PCR.
      NOTA: Se necessario, è possibile aumentare il tempo di incubazione a 65 gradi centigradi.
    4. Preparare la reazione PCR come segue: 1 U di polmeria di DNA Taq, 2 luna di 10x buffer (con Mg2x),1,6 L di miscela dNTP (2,5 mM), 0,5 l di ogni primer (10 m ciascuno), 2 l un l di supernatante di tessuto di mosche bianche e acqua doppia distillata per un volume totale di 20L per reazione. La sequenza di primer di inoltro è 5'-TTGATTGCATCCAGAAGT-3' e la sequenza di primer inversa è 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
      NOTA: Deve essere incluso un controllo negativo in cui il DNA viene sostituito con acqua priva di nuclea e un controllo positivo con il DNA della mosca bianca MEAM1 precedentemente verificato.
    5. Eseguire la PCR utilizzando i seguenti parametri di pedalata: denaturazione iniziale a 95 gradi centigradi per 3 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 95 gradi centigradi per 30 s, annealando a 50-55 gradi centigradi per 30 s, ed estensione a 72 gradi centigradi per 1 min, seguita da 72 gradi centigradi per 10 min.
    6. Digerire il prodotto amplificato con enzima di restrizione Taq I. Per farlo, preparare la miscela di digestione con 0,1 l (1 U) di enzima,1 l di 10x Taq I Buffer, 1 -L di BSA, 5 l di prodotto amplificato, e doppia acqua distillata ad un volume totale di 10. Incubare a 65 gradi centigradi per 1 h in un termociclore.
    7. Eseguire l'elettroforesi del gel di agarose dei campioni caricando 5-7 - L di ogni prodotto digerito e una scala di DNA (100-2.000 bp) nei pozzi di un gel di agarose dell'1%. Quindi, osservare le dimensioni della banda del DNA con colorazione gel-rosso in una macchina per la documentazione gel utilizzando la luce UV. Confrontare le dimensioni della banda dei prodotti digeriti con il controllo positivo per determinare la purezza della popolazione di mosca bianca.
  3. Agro-inoculare il clone infettivo di TYLCV (numero di adesione GenBank AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) in 3-4 piante di pomodoro a stadi a foglia reale(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
    1. Inoculate 10 mL di Luria-Bertani (LB) che contiene kanamycin (50 g/mL) e rifampicina (50 g/mL) con una singola colonia. Incubare a 28 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min fino a quando l'OD600 raggiunge 1,5 dollari.
    2. Raccogliere agrobatteri con centrifugazione a 4.000 x g per 10 min. Scartare il supernatante.
    3. Risospendere pellets in 10 mL di buffer di infiltrazione, costituito da 200 -M acetosyringone, 10 mM 2-(N-morpholino) acido solfonico (MES) e 10 mM MgCl2. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 1–2 h.
    4. Infiltrare 2-3 foglie di pianta utilizzando la miscela dal passo 1.3.3 con una siringa senza ago 1 mL. Mantenere le piante in una serra a 26 x 1 gradi centigradi.
  4. Circa 1 mese dopo, eseguire un'ispezione visiva e scegliere le piante che mostrano foglia di ricciolo giallo e sintomi di acrobazia.
  5. Trasferire adulti di mosca bianca non viruliferous su piante di pomodoro infettate da TYLCV per 48 h per l'acquisizione di virus.

2. Dissezione e raccolta di Midguts, Primary Salivary Glands (PSG), Ovarie e Emolymph di Whiteflies Femminili

  1. Raccogli le mosche bianche usando l'aspirazione, e poi mettile sul ghiaccio per metterle in coma. Aggiungere il buffer 1x PBS (salina con buffer fosfato) su un vetrino al microscopio, quindi posizionare le mosche bianche nel buffer 1x PBS per la dissezione al microscopio stereo.
    1. Per la dissezione midgut, rompere l'addome della mosca bianca ed estrarre il midgut utilizzando un ago di agopuntura fine (0,25 mm di diametro). Trasferire il midgut per pulire, 1x PBS.
    2. Per la dissezione del PSG, rompere il corpo della mosca bianca nel torace vicino alla testa dal lato dorsale. Successivamente, inserire un ago nel torace per fissare la mosca bianca e utilizzare un altro ago per scuotere la mosca bianca fino a quando le due ghiandole salivari sono separate dal corpo. Quindi, trasferire i PSG per pulire, 1x PBS.
    3. Per la dissezione delle ovaie, rompere completamente l'addome della mosca bianca e utilizzare un ago per separare le ovaie dagli altri tessuti. Quindi, rimuovere i tessuti in eccesso con il pipettaggio.
    4. Per la raccolta emolymph, aggiungere 10 lof1x buffer PBS su un vetrino del microscopio, quindi posizionare una mosca bianca nel buffer. Per ottenere l'emolinfa, strappare delicatamente un buco nell'addome usando un ago sottile agopuntura e premere leggermente l'addome per rilasciare l'emolfa fuori nel tampone. Raccogliere 8 l' del liquido come campione di emolina.

3. Localizzazione di TYLCV in Whitefly Midgut, Primary Salivary Glands e Ovarie per immunofluorescenza

NOTA: La procedura per la localizzazione di TYLCV nei midguts è presentata come esempio. Il metodo può essere utilizzato per I PSG e le ovaie.

  1. Dissezionare i midguts nel buffer TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM di cloruro di sodio, pH 7,5) come descritto nel passaggio 2.2.1. Raccogliere 15-20 midgut sfarsi bianchi, trasferirli in una parabola Petri di vetro (3,5 cm di diametro), e quindi rimuovere il buffer TBS in eccesso.
  2. Aggiungere 1 mL di 4% paraformaldeia per fissare midguts per 2 h a temperatura ambiente, quindi rimuovere la soluzione fissativa. Pipette lentamente per lavare i midguts 3x in TBS per 2 min ciascuno.
  3. Incubare i midguts in 1 mL di 0,5% Triton X-100 per 30 min a permeabilizzare. Quindi rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e lavare i midguts 3x con TBST (1x TBS con 0.05% Tween 20) come descritto nel passaggio 3.2.
  4. Aggiungere 1 mL di 1% di BSA (albumina del siero bovino preparata in TBST) per bloccare i midguts. Eseguire la fase di blocco a RT per 2 h, quindi rimuovere la soluzione di blocco e lavare i midguts 3x in TBST.
  5. Diluire gli anticorpi primari (MAb 1C4 contro la proteina del cappotto TYLCV) a 1:400 con TBST24 e aggiungere la soluzione nella piastra Petri per immergere gli omiofghi. Incubare a 4 gradi centigradi durante la notte al buio. Eliminare la soluzione anticorpale primaria e lavare 3x in TBST.
  6. Diluire gli anticorpi secondari (anti-topo) a 1:400 con TBST e aggiungere la soluzione nel piatto Petri per immergere i midguts. Incubare il piatto per 2 h a RT al buio. Eliminare la soluzione anticorpale secondaria e lavare i midgut3x in TBST.
  7. Trasferire i midguts in un chiaro vetrino al microscopio. Aspirare il più TBST fuori dallo scivolo possibile. Aggiungere 1 goccia di DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilondole, dihydrochloride) per macchiare il nucleo, quindi posizionare la coverslip e sigillare con smalto. Esaminare al microscopio confocale.

4. Quantificazione di TYLCV in Whitefly Midgut, Primary Salivary Glands, Hemolymph e Ovaries con qPCR

  1. Dissezionare i mezzi bufala, i PSG, l'emolina e le ovaie in 1x PBS come descritto sopra.
  2. Estrarre il DNA dei midguts, PSG, emolymph, e ovaie.
    1. Dopo la dissezione, lavare i midgut, i PSG e le ovaie in pulito, 1x PBS buffer 2–3x.
    2. Raccogliere 20 midgut o 20 PSG in 5 o L di 1x PBS e trasferirli in una soluzione di lisi da 25 . Trasferire ogni ovaia in 5 ovaia di 1x PBS e quindi trasferire singolarmente nella soluzione di lisi 25 .
    3. Macinare i midgut, i PSG e i campioni di ovaie come descritto al punto 1.2.2.
    4. Raccogliere 8 Ll di emolymph con 1x PBS in un tubo PCR, quindi aggiungere 10 - L di soluzione di lisi. Mescolare accuratamente.
  3. Estrarre il DNA da tutti i campioni come descritto nella 1.2.3.
  4. Preparare due miscele master qPCR separate (18 gradi l una ciascuna) per TYLCV e il controllo interno ( gene diactina a z) come segue: 10 -L di SYBR Green mix, 0,8 l di ogni primer (10M ciascuno) e 6,4 litri di acqua distillata doppia per reazione. Per TYLCV, la sequenza di primer in avanti è 5-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3 e la sequenza di primer inversa è 5--GGAACATCATCGGGCTTCGATA-3. Per l'attodi z , la sequenza di primer in avanti è 5-TCTCCAGCCATCTTT-3 e la sequenza di primer inversa è 5-CGGTGATTCTCTCTGCATT-3.
  5. Distribuisci 18 - L del master mix in fiale di tubi a strisce qPCR o una piastra 96. Quindi, aggiungere 2 - L dei campioni di DNA in ogni fiala. Esegui tutte le reazioni con almeno tre repliche tecniche e tre repliche biologiche.
    NOTA: Il passaggio 4.5 deve essere eseguito sul ghiaccio.
  6. Chiudere i tubi qPCR o sigillare le 96 piastre ben con sigillo piastra adesiva.
  7. Centrifuga per raccogliere il liquido nella parte inferiore dei tubi qPCR o 96 piastra bene.
  8. Posizionare i tubi o la piastra nel ciclore termico in tempo reale ed eseguire qPCR.
    1. Eseguire il qPCR utilizzando i seguenti parametri di ciclismo: 95 c per 30 s, seguito da 40 cicli di 95 s per 5 s e 60 C per 34 s per l'annessione e l'allungamento del primer, 1 ciclo a 95 gradi per 15 s, terminando con un passo della curva di fusione da 60 a 95 gradi con un incremento di 0,5 gradi centigradi per 15 s.
    2. Scegliere SYBR come tinto fluoroforo e sconosciuto come tipo di campione.
  9. Esportare i dati quantitativi in un formato di foglio di calcolo e analizzare la quantità relativa di DNA virale con ilmetodo 28.

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Risultati

Le mosche bianche MEAM1 del complesso B. tabaci e TYLCV sono state utilizzate come esempio per descrivere le procedure. La panoramica delle procedure di immunofluorescenza e quantificazione virale descritte in questo manoscritto è illustrata nella Figura 1. La figura 2 mostra i risultati rappresentativi del rilevamento dell'immunofluorescenza di colorazione TYLCV e DAPI in PSG, midgut e ovaie, indicando che TYLCV si è accumulato di più nei GSP e nei mid...

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Discussione

Qui descriviamo un protocollo per la localizzazione e la quantificazione di un begomovirus nei tessuti del suo vettore di mosca bianca per immunofluorescenza e qPCR. La dissezione rappresenta il primo passo per localizzare e quantificare il virus nei tessuti delle mosche bianche. Il corpo della mosca bianca è di circa 1 mm di lunghezza, il che significa che i tessuti sono estremamente piccoli, ed è difficile sezionarli. Inoltre, ci sono forti connessioni tra i tessuti. Ad esempio, le ovaie sono strettamente collegate ai ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program (Numero di sovvenzione: 2017YFD0200600), il fondo stanziato per il China Agriculture Research System (numero di sovvenzione: CARS-23-D07) e la Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Ringraziamo jian-Xiang Wu per aver fornito anticorpi TYLCV CP.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% ParaformaldeideMultiSciencesF0001
4',6-diamidino-2-phé nylindole (DAPI)Abcamab104139
Albumina sierica bovina (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Sistema di rilevamento PCR in tempo realeBio-RAD185-5201
Microscopia confocaleZeissLSM800
Dylight 549-capra anti-topoEarthoxE032310-02Anticorpo secondario
monoclonale anticorpo primario (MAb 1C4)Anticorpo primario
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Stereomicroscopio Sangon BiotechB548119-0500
ZeissStemi 2000-C
TB premix verde Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
ThermocyclerThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI scienze della vita9002-93-1
Tween 20BBI scienze della vita9005-64-5

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Localizzazione del Begomovirusdissezione dei tessuti della mosca biancaprotocollo di immunofluorescenzamicroscopia confocalerilevamento del TYLCVfrazione vascolare stromaleraccolta dell emolinfaghiandole salivari primariequantificazione del virus

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