Localizzazione e quantificazione dei begomovirus nei tessuti delle mosche bianche mediante immunofluorescenza e PCR quantitativo

Summary

Descriviamo un'immunofluorescenza e un metodo PCR quantitativo per la localizzazione e la quantificazione dei begomovirus nei tessuti degli insetti. Il protocollo di immunofluorescenza può essere utilizzato per co-localizzare proteine virali e vettoriali. Il protocollo PCR quantitativo può essere esteso per quantificare i virus in corpi di mosca intero e piante infettate da virus.

Abstract

I begomovirus (genere Begomovirus, famiglia Geminiviridae) sono trasmessi da mosche bianche del complesso bemisia tabaci in modo persistente e circolativo. Considerando gli ingenti danni causati dai begomovirus alla produzione agricola in tutto il mondo, è imperativo comprendere l'interazione tra i begomovirus e il loro vettore di mosche bianche. Per farlo, la localizzazione e la quantificazione del virus nei tessuti vettoriali è fondamentale. Qui, usando il virus del ricciolo delle foglie gialle di pomodoro (TYLCV) come esempio, descriviamo un protocollo dettagliato per localizzare i begomovirus nei midguts delle lamiche bianche, nelle ghiandole salivari primarie e nelle ovaie per immunofluorescenza. Il metodo si basa sull'uso di anticorpi specifici contro una proteina del mantello di virus, anticorpi secondari etichettati con coloranti e un microscopio confocale. Il protocollo può essere utilizzato anche per colocalizzare le proteine begomvirale e della mosca bianca. Descriviamo inoltre un protocollo per la quantificazione del TYLCV nei midgut sottabi, nelle ghiandole salivari primarie, nell'emolymph e nelle ovaie per PCR quantitativo (qPCR). Utilizzando primer specificamente progettati per TYLCV, i protocolli per la quantificazione consentono il confronto della quantità di TYLCV in diversi tessuti della mosca bianca. Il protocollo descritto è potenzialmente utile per la quantificazione dei begomovirus nel corpo di una mosca bianca e di una pianta infettata da virus. Questi protocolli possono essere utilizzati per analizzare la via di circolazione dei begomovirus nella mosca bianca o come complemento ad altri metodi per studiare le interazioni bianco-begomovirus.

Introduction

Negli ultimi decenni, i begomovirus (genere Begomovirus, famiglia Geminiviridae) hanno causato gravi danni alla produzione di molte colture vegetali, fibre e ornamentali in tutto il mondo¹. I begomovirus sono trasmessi in modo persistente dalla mosca bianca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), che è una specie complessa che contiene oltre 35 specie criptiche^2,3. I begomovirus possono influenzare direttamente o indirettamente la fisiologia e il comportamento delle mosche bianche, come la fecondità^4,la longevità⁴

Protocol

1. Mosca bianca, virus, piante e acquisizione del virus

1. Le mosche bianche posteriori (MEAM1) sul cotone (Gossypium hirsutum cv.
2. Eseguire la PCR convenzionale basata su whitefly mitocondriale cytochrome oxidase I gene per determinare la purezza della popolazione di mosca bianca.
   1. Raccogliere 20 mosche bianche adulte e trasferirle singolarmente su un tubo PCR contenente 30 tamponamento di lisi (10 mM Tris, pH - 8,4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatina, 0,45% [vol/vol/vol/] Nonidet P 40, 60 g/Kl Proteine).
   2. Aggiungere 5-7 perline ceramiche (2 mm di diametro) in ogni tubo PCR e macinare i campioni per es....

Results

Le mosche bianche MEAM1 del complesso B. tabaci e TYLCV sono state utilizzate come esempio per descrivere le procedure. La panoramica delle procedure di immunofluorescenza e quantificazione virale descritte in questo manoscritto è illustrata nella Figura 1. La figura 2 mostra i risultati rappresentativi del rilevamento dell'immunofluorescenza di colorazione TYLCV e DAPI in PSG, midgut e ovaie, indicando che TYLCV si è accumulato di più nei GSP e nei mid.......

Discussion

Qui descriviamo un protocollo per la localizzazione e la quantificazione di un begomovirus nei tessuti del suo vettore di mosca bianca per immunofluorescenza e qPCR. La dissezione rappresenta il primo passo per localizzare e quantificare il virus nei tessuti delle mosche bianche. Il corpo della mosca bianca è di circa 1 mm di lunghezza, il che significa che i tessuti sono estremamente piccoli, ed è difficile sezionarli. Inoltre, ci sono forti connessioni tra i tessuti. Ad esempio, le ovaie sono strettamente collegate ai .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldeide	MultiSciences	F0001
4',6-diamidino-2-phé nylindole (DAPI)	Abcam	ab104139
Albumina sierica bovina (BSA)	MultiSciences	A3828
CFX Connect Sistema di rilevamento PCR in tempo reale	Bio-RAD	185-5201
Microscopia confocale	Zeiss	LSM800
Dylight 549-capra anti-topo	Earthox	E032310-02	Anticorpo secondario
monoclonale anticorpo primario (MAb 1C4)			Anticorpo primario
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Stereomicroscopio Sangon Biotech	B548119-0500
	Zeiss	Stemi 2000-C
TB premix verde Ex Taq (Tli RNase H Plus)	TaKaRa	RR820A	qPCR master mix
Thermocycler	Thermofisher	A41182
Tissuelyzer	Shaghai jingxin	Tissuelyser-48
Triton-X-100	BBI scienze della vita	9002-93-1
Tween 20	BBI scienze della vita	9005-64-5