Articolo metodologico

Individuazione degli obiettivi normativi CsgD nel biofilm della Salmonella mediante l'immunoprecipitazioni della cromatina e il sequenziamento ad alto rendimento (ChIP-seq)

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DOI:

10.3791/60736

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18 gennaio 2020

 ,  , 
1Vaccine and Infectious Disease Organization-International Vaccine Centre, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Saskatchewan, 3Department of Cell Biology and Genetics, Shenzhen University Health Science Center

In questo articolo

Sommario

L'immunoprecipitazioni della cromatina abbinata al sequenziamento di nuova generazione (ChIP-seq) è un metodo utilizzato per stabilire le interazioni tra i fattori di trascrizione e le sequenze genomiche che controllano. Questo protocollo delinea le tecniche per l'esecuzione di ChIP-seq con biofilm batterici, utilizzando come esempio il biofilm batterico di Salmonella enterica serovar Typhimurium.

Abstract

L'immunoprecipitazioni della cromatina seguita dal sequenziamento (ChIP-seq) è una tecnica che può essere utilizzata per scoprire gli obiettivi normativi dei fattori di trascrizione, delle modifiche agli istoni e di altre proteine associate al DNA. I dati ChIP-seq possono essere utilizzati anche per trovare l'associazione differenziale dei fattori di trascrizione in diverse condizioni ambientali o tipi di cellule. Inizialmente, ChIP è stato eseguito attraverso l'ibridazione su un microarray (ChIP-chip); tuttavia, ChIP-seq è diventato il metodo preferito attraverso i progressi tecnologici, riducendo le barriere finanziarie al sequenziamento e le enormi quantità di output di dati di alta qualità. Le tecniche di esecuzione di ChIP-seq con biofilm batterici, una delle principali fonti di infezioni persistenti e croniche, sono descritte in questo protocollo. ChIP-seq viene eseguito su biofilm di Typhimurium di Typhimurium e cellule planctoniche della Salmonella, mirando al regolatore principale del biofilm, CcGD, per determinare l'associazione differenziale nei due tipi di cellule. Qui, dimostriamo la quantità appropriata di biofilm da raccogliere, normalizzandosi in un campione di controllo planctonico, omogeneizzando biofilm per l'accesso cross-linker ed eseguendo passaggi ChIP-seq di routine per ottenere risultati di sequenziamento di alta qualità.

Introduzione

I biofilm batterici, aggregati strutturali di cellule incorporate in una matrice autoprodotta, sono resistenti alla disidratazione, agli antibiotici e alle risposte immunitarie dell'ospite1. Come tali, causano infezioni persistenti e croniche e presentano sfide uniche ai ricercatori a causa delle loro soluzioni alla sopravvivenza e alla trasmissione. Salmonella enterica sierovar Typhimurium (S. Typhimurium) è stato trovato per stabilire popolazioni fenotipicamente eterogenee di aggregati di biofilm che sono resistenti alla disidratazione e agli antibiotici, e cellule planctoniche che esprimono fattori di virulenza nella coltura pura quando esposte allo stress ambientale (28 gradi centigradi, limitando i nutrienti)2. Questi due tipi di cellule sorgono a causa dell'espressione bistabile del regolatore principale del biofilm, CsgD3. Abbiamo ipotizzato che questa possa essere una strategia di copertura delle scommesse per la Salmonella, dove le cellule planctoniche partecipano alla trasmissione a breve termine e le cellule di biofilm sono in grado di persistere a lungo termine nell'ambiente fino a quando non sorge l'opportunità di infettare un nuovo ospite2,4. Molti degli elementi normativi che controllano l'espressione csg operon sono ben caratterizzati5. Tuttavia, a parte adrA e l'operon csg 6, sono noti pochi obiettivi normativi di CsgD. L'identificazione della rete di regolamentazione CsgD ci aiuterebbe a comprendere meglio il ciclo di vita della Salmonella e il ruolo che i biofilm svolgono nella trasmissione.

L'immunoprecipitazioni della cromatina seguita dal sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è una potente tecnica in vivo per l'identificazione a livello di genoma delle interazioni proteina-DNA e fornisce informazioni sui processi normativi che coinvolgono fattori di trascrizione, modifiche agli istoni o nucleosomi7. Studi più recenti hanno utilizzato questa tecnica per valutare il legame differenziale delle proteine tra le condizioni di crescita e i tipi di cellule8. Nell'immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP), i frammenti di DNA con proteine interagenti vengono arricchiti attraverso la selezione degli anticorpi delle proteine bersaglio. Le cellule vengono raccolte e le proteine che legano il DNA sono collegate incrociatamente al DNA in vivo attraverso il trattamento cross-linker della formaldeide. Le cellule sono lised, rilasciando il contenuto della cella, e la cromatina viene tosata in circa 200-600 bp frammenti7. I frammenti di DNA legati alla proteina bersaglio sono immunoprecipitati con anticorpi e isolati per decrosslinking seguiti dalla digestione delle proteine9. Questi frammenti di DNA rappresentano siti di legame proteico abbinati per ibridazione a un microarray (ChIP-chip) o da sequenziamento profondo e mapping alla sequenza genoma10,11. Sebbene gli esperimenti ChIP-chip producano dati normativi adeguati, sono limitati a causa dell'uso di sonde costose, nonché dell'ibridazione e della distorsione degli array12. ChIP-seq ha una gamma dinamica più ampia con maggiore risoluzione e copertura dei nucleotidi, un migliore rapporto segnale-rumore e un minor numero di artefatti rispetto a ChIP-chip7.

ChIP è stato utilizzato per analizzare la regolazione Sfh e OmpR in Salmonella sierovar Typhimurium13,14, regolazione AphA quorum-sensing in Vibrio alginolyticus15, regolazione RpoS in Escherichi a coli16, regolatore di virulenza EspR regolazione in Mycobacterium tuberculosis17, potenziali cicliche diguanylate attraverso la regolazione Amr in Pseudomonas aeruginosa18, così come VraSR regolamento a Staphylococcus aureus19. Gli esperimenti batterici ChIP-seq che sono stati descritti iniziano con la crescita delle cellule nei supporti liquidi e la raccolta in forma singola di cellule. Tuttavia, l'analisi dei biofilm e la corrispondente regolazione genica rappresentano una nuova serie di sfide per generare un protocollo ChIP-seq di successo. In questo protocollo, ChIP-seq viene utilizzato per trovare obiettivi normativi differenziali di CsgD, il S. Regolatore di biofilm master di Typhimurium nei tipi di biofilm e cellule planctoniche. Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare la quantità appropriata di biofilm per ChIP-seq, raccogliere biofilm dalla coltura del fiascheno, normalizzare campioni di biofilm e di controllo a singola cellula, omogeneizzare il biofilm e l'immunoprecipitazioni completi. Questo sarà utile per studiare gli obiettivi normativi nei biofilm batterici e può essere adattato a molte specie.

Protocollo

1. Crescita delle cellule di coltura Flask

  1. Da scorte congelate, striscia ceppo di Ceppella serovar Ceppo Ditilio su LB agar (20 mL supporti solidi in 100 mm piastra Petri) con l'antibiotico appropriato e incubare a 37 gradi centigradi per 16-20 h per ottenere colonie isolate.
  2. Inoculare il brodo LB da 5 mL contenente l'antibiotico appropriato in un tubo di coltura borosilicato da 25 mm x 150 mm con 1-3 colonie da piastre di striature del punto 1.1. Incubare a 37 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min per 7 h.
  3. Misurare OD600 di cultura brodo utilizzando uno spettrometro. Diluire una serie di colture 1 su 4 in PBS in una cuvette da 2 mL e misurare l'assorbimento a 600 nm. Abbiamo scoperto che il fattore più critico in questo passaggio è il momento della crescita. I valori OD vengono utilizzati per normalizzare le impostazioni cultura in modo da fornire il numero desiderato di celle nel passaggio 1.4.
  4. Aggiungere 1,0 OD600 volume equivalente di coltura cellulare (cioè10 9 cellule) a un pallone Erlenmeyer contenente 100 mL di 1% di tryptone con l'antibiotico appropriato. Incubare a 28 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min per 13 h.
    Nota: Le cellule di Biofilm appariranno come fiocchi aggregati e singole cellule planctoniche sono nel supporto nuvoloso.

2. Raccolta senza cellule condizionata 1% tryptone

  1. Raccogliere coltura fiaschetta per senza cellule condizionata 1% tryptone. Cultura del pallone Pipette più volte per mescolare prima di aggiungere a un tubo di centrifuga.
  2. Centrifuga a 12.000 x g per 10 min a 10 gradi centigradi per pellet tutte le cellule.
  3. Decant supernatant in un'unità filtro di 0,2 m, filtro per vuoto, e dispensa in un nuovo tubo.
    Nota: gli aggregati Biofilm sono aderenti alle soluzioni convenzionali (ad esempio PBS) e si attaccano ai lati dei tubi e delle punte delle pipette. Dal momento che permette una più facile manipolazione, usiamo supporti condizionati (1% tryptone) per spostare biofilm inizialmente e utilizzare PBS caldo immediatamente prima del cross-linking (passaggio 4.5) per rimuovere eventuali substrati incrociati proteici che potrebbero essere presenti nei media.

3. Separazione delle cellule biofilm e planctoniche dalle colture difiasche2

  1. Utilizzando una sterile pipetta da 25 mL, coltura di fiaschetta in tubi da 15 mL. Centrifuga a bassa velocità (210 x g) per 2 min, per separare i due tipi di cellule.
    Nota: Le cellule del biofilm devono formare un pellet sciolto nella parte inferiore del tubo
  2. Pipetta la supernata contenente cellule planctoniche in due tubi di centrifuga da 40 mL per dopo (passaggio 5). Rimuovere tutto il liquido rimanente, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Ripetere l'operazione fino a quando i tipi di cella non sono stati separati da tutti i supporti di lingua di riferimento.

4. Preparazione degli aggregati di biofilm

Nota: il biofilm viene raccolto dal peso bagnato per produrre 25 g di DNA, il materiale minimo di partenza raccomandato per ChIP. Il Biofilm Conversion Factor (BCF) di S. Il chimusurium è 1,73 x 108 CFU/mg2. I ricercatori che preparano altri tipi di biofilm dovranno definire empiricamente il numero di cellule per unità di peso del biofilm, che viene utilizzato per trovare il peso del biofilm necessario per 25 g di materiale di partenza del DNA utilizzando questa equazione:
figure-protocol-1

  1. Pesare con precisione un tappo a scatto da 2 mL o un tubo a vite.
  2. Risospendere il pellet biofilm in 1 mL di tryptone condizionato. Spostare il biofilm sospeso in un tappo a scatto pre-pesato da 2 mL o in un tubo a vite.
  3. Centrifuga per 1 min a 11 000 x g a 20 gradi centigradi
  4. Rimuovere con attenzione tutti i supernatali dal tubo e pesare il tubo con precisione. Sottrarre il peso del tubo dal peso del tubo con biofilm per trovare il peso del biofilm. Dovrebbe essere il 10% del peso del biofilm di destinazione.
  5. Lavare le cellule per rimuovere il restante tryptone condizionato. Aggiungere 1 mL di PBS caldo al tubo e vortice delicatamente per risospendere il pellet. Centrifuga per 3 min a 8 000 x g per pellet biofilm e rimuovere il supernatante. Aggiungere 1 mL di PBS al tubo e vortice per risospendere il pellet.

5. Preparazione delle cellule planctoniche

  1. Registrare il volume e l'OD600 del supernata planctonico dalla centricazione a bassa velocità (passaggio 3.2) utilizzando uno spettrofotometro
  2. Calcolare il volume richiesto per un OD600 finale di 6.0:
    figure-protocol-2
  3. Raffreddare la centrifuga a 10 gradi centigradi e sedimentare le cellule planctoniche per centrifugazione (10.000 x g, 10 min a 10 gradi centigradi)
  4. Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare nel volume finale di PBS calcolato nel passaggio 5.2.
  5. Misurare nuovamente l'OD600 delle celle planctoniche utilizzando uno spettrofotometro e erogare il volume delle celle planctoniche 6.0 OD600 in un tappo a scatto da 2 mL o in un tubo a vite.
  6. Porta il volume a 1 mL con PBS.

6. Omogeneizzare le cellule

  1. Aggiungere un tallone sterilizzato in acciaio inossidabile da 5 mm a ciascuno dei tubi.
  2. Omogeneizzare utilizzando un mulino mixer per 5 min a 30 Hz. Osservare tubi aggregati per confermare che il biofilm è stato rotto.
  3. Trasferire le cellule omogeneizzate in un nuovo tubo da 1,5 mL, evitando il tallone metallico. Portare il volume a 1 mL con PBS.
    Nota: Eseguire diluizioni seriali per enumerare le celle di input e verificare che il numero di cella finale sia vicino al numero desiderato o previsto.

7. Collegamento incrociato delle proteine al DNA

  1. Distribuisci formaldeide fresca in tubi campione a una concentrazione finale dell'1%. Incubare per 30 min a temperatura ambiente su una ruota rotante.
    Attenzione: La formaldeide è corrosiva, una pelle, un occhio irritante e respiratorio irritante e infiammabile. Distribuisci in un cappuccio.
  2. Aggiungere 1 M di glicina ad una concentrazione finale di 125 mM per fermare il crosslinking. Incubare per 5 min a temperatura ambiente su una ruota rotante.

8. Lavare le cellule per rimuovere il crosslinker in eccesso

  1. Sedimentare le cellule a 8.000 x g per 3 min e rimuovere il supernatante
  2. Risospendere il pellet in 20 gradi l di 25x inibitori della proteasi e 500 -L L di filtro sterilizzato PBS.
  3. Tubo di centrifuga per 3 min a 8000 x g e rimuovere il supernatante.

9. Cellule di liscivia

  1. Risospendere il pellet nel buffer di lisi da 600 luna (fare riferimento alla tabella 1)e incubare sul ghiaccio per 10 min.
  2. Aggiungere 1,4 mL di buffer di diluizione IP (fare riferimento alla tabella 1) a un tubo sterile da 15 mL e spostare le cellule lisviate al tubo da 15 mL. Tenere il tubo sul ghiaccio per 1,5–2 h, e vortice delicatamente e di tanto in tanto.
    Nota: Alcuni materiali cellulari resistenti possono rimanere nei tubi. Un lungo periodo di incubazione sul ghiaccio con vortice occasionale si romperà materiale. Il resto sarà suddiviso attraverso la sonicazione.

10. Frammentazione del DNA mediante sonicazione

  1. Mettere il tubo da 15 mL in un bicchiere di ghiaccio e posizionare la sonda da 3 mm all'interno del tubo.
  2. Eseguire 5 giri di sonicazione di 30 s su a 20-40% di 400 W con 2 min di raffreddamento sul ghiaccio tra una raffica e l'altro.
  3. Sedimento precipitato per centrifugazione (8000 x g, 10 min a 4 gradi centigradi). Trasferire il supernatante in un nuovo tubo.
  4. Facoltativamente, eseguire il decrosslinking a 65 gradi centigradi per 30-60 min e digerire L'RNA e le proteine a 45 gradi centigradi per 30-60 min prima di funzionare su un gel di agarose del 2% per verificare la presenza di frammenti di dimensioni corrette.
    Nota: Immergere la sonda nella cella lisata. Mantenere la soluzione sul ghiaccio durante il suono e il riposo. Non rimuovere il tubo mentre la sonda sonicatore pulsa. La soluzione dovrebbe apparire nuvoloso pre-sonicazione e chiara post-sonicazione.

11. Complessità immunoprecipitanti DNA-proteina-anticorpo

  1. Preparazione
    1. Eroga una aliquota di 1,35 mL per l'immunoprecipitazioni e una aliquota di 200 l come controllo di ingresso. Memorizzare il controllo di input a -80 gradi centigradi fino a quando non vengono eseguiti i passaggi di decrosslinking e digesting.
  2. Immunoprecipitazioni con anticorpi primari
    1. Aggiungete 10 g di anticorpo primario purificato specifico per le proteine all'aliquota 1,35. Incubare pernottamento a 4 gradi centigradi su una ruota rotante.
      Nota: L'anticorpo primario può essere un anticorpo monoclonale, un siero policlonale di alta qualità o un anticorpo commerciale epitope (ad esempio, anti-FLAG).
    2. Aggiungete 50 gradi di perline magnetiche proteiche G ai tubi dal gradino 11,2,1 e incubate a 4 gradi centigradi per 3 h su una ruota rotante.
    3. Inserire il buffer di lavaggio IP 1, il buffer di lavaggio IP 2 e TE pH 8.0 (fare riferimento alla tabella 1) in un secchio di ghiaccio. Buffer di elizione caldo a 65 gradi centigradi.
      Nota: Non mettere la soluzione contenente il tampone di eluizione sul ghiaccio.
    4. Legare le perle magnetiche Protein G al lato dei tubi utilizzando un supporto magnetico
    5. Eseguire lavaggi: lavare 2x con 750 sl di lavaggio IP freddo tampone 1, lavare 1x con 750 -L buffer di lavaggio IP freddo 2, e lavare 2x con 750 TE freddo a pH 8.0. Tenere i tubi sul supporto magnetico durante i lavamenti.
    6. Aggiungete 450 l di tampone di eluizione IP (fare riferimento alla tabella 1)ad ogni tubo e incubare a 65 gradi centigradi per 30 min con vortice delicato ogni 5 min.
    7. Legare perline sul lato dei tubi utilizzando un supporto magnetico. Attendere almeno 2 min fino a quando la soluzione è chiara.
    8. Distribuisci il supernatante cancellato in un nuovo tubo da 1,5 mL, facendo attenzione a non disturbare il pellet magnetico.

12. Decrosslinking complessi DNA-proteine e digerire l'RNA e le proteine co-purificanti

  1. Aggiungere 2 g di RNase A e NaCl ad una concentrazione finale di 0,3 M ad ogni tubo.
  2. Incubare a 65 gradi centigradi, per 6 h, o durante la notte.
  3. Completa la digestione delle proteine aggiungendo 180 g di Proteinase K ad ogni tubo, poi incubando a 45 gradi centigradi per 3-5 h.

13. Preparazione della biblioteca e sequenziamento

  1. Purificare il DNA con perline magnetiche
    Nota: Le perle magnetiche sono preferite per isolare le piccole quantità di DNA solitamente recuperate durante ChIP con cellule batteriche.
  2. Preparare le librerie utilizzando un kit compatibile con la piattaforma di sequenziamento selezionata.
  3. Controllare la concentrazione della biblioteca con un fluorometro e un kit dsDNA a vasta portata o un kit di quantificazione della libreria qRT-PCR.
    Nota: Nella nostra esperienza, le misurazioni del fluorometro possono sopravvalutare la concentrazione del DNA.
  4. Librerie di pool, che rappresentano una copertura adeguata per ogni esempio di libreria. Per il sequenziamento Illumina con Salmonella,abbiamo messo insieme 10-12 librerie. Aggiungere Tris-HCl pH 8.0 a una concentrazione finale di 1 mM.
  5. Sequenza in base alle specifiche della piattaforma selezionata.

Risultati

La preparazione di campioni di immunoprecipitazioni della cromatina da biofilm batterico prevede diversi passaggi, come mostrato nella Figura 1. Questi includono la coltivazione di biofilm nella coltura dei plachi, la raccolta di supporti condizionati, la raccolta di una quantità adeguata di biofilm e cellule planctoniche come controllo, il lavaggio delle cellule in PBS, l'omogeneizzazione delle proteine al DNA, la lisciviazione delle cellule, la frammentazione del DNA per la sonicazione, l'immunoprecipitamento del DNA con gli anticorpi appropriati e le perline proteiche G, il lavaggio e l'elusione del DNA immunoprecipitato e il DNA purificante per la preparazione della biblioteca e il sequenziamento.

Le cellule di S. Typhimurium coltivate in coltura liquida in condizioni di biofilm subiscono il commutazione del fenotipo per formare aggregati di biofilm multicellulari e cellule planctoniche. Questa popolazione conterrà circa il 40% di aggregati di biofilm, che esprimono livelli più elevati di circiclidi diguillati (DGC) e regolatori di biofilm, e il 60% di cellule planctoniche, che esprimono livelli più elevati di geni associati alla virulenza2,4 (Figura 2A). In questo protocollo, descriviamo un metodo per raccogliere entrambi i tipi di cellule per confrontare i siti di trascrizione attraverso ChIP-seq; tuttavia, questo protocollo può essere adattato ad altri tipi di biofilm formati da altre specie batteriche. Gli aggregati di biofilm e le cellule planctoniche sono separati da una centrifugazione a bassa velocità, che pellets biofilm e lascia le cellule planctoniche nel supernatante2 (Figura 2B). I tipi di cella vengono quindi trattati separatamente per i passaggi successivi nel protocollo.

La quantità raccomandata di input di DNA per ChIP-seq è di 10-25 g20. In S. Cultura del flacone di Typhimurium, 30 mg di biofilm producono circa 25 g di DNA. Poiché gli aggregati di biofilm hanno un'abbondanza di materiale extracellulare proteico, abbiamo ipotizzato che ciò interferirebbe con l'efficienza del collegamento incrociato. Se dovessimo semplicemente normalizzare i diversi tipi di cellule per numero di cellule, il trattamento delle cellule planctoniche può provocare una quantità ineguale di prodotto crosslinked presentato per l'immunoprecipitazioni. Un saggio proteico è stato eseguito per determinare la quantità equivalente di materiale cellulare planctonico per abbinare 30 mg di biofilm (Figura 3). 6.0 OD600 di cellule planctoniche sono stati raccolti per abbinare biofilm 30 mg.

Gli aggregati di biofilm devono prima essere suddivisi per consentire un accesso equo del cross-linker a tutte le cellule. Abbiamo scoperto che il modo più uniforme e ad alta produttività per omogeneizzare le cellule era l'utilizzo di un mulino mixer e 5 mm perline in acciaio inox (Figura 4A). Le cellule planctoniche vengono trattate allo stesso modo per ridurre le variabili nell'esperimento ChIP-seq (Figura 4B).

Una volta che il DNA è stato frammentato dalla sonicazione, crosslinked, e trattati con RNase e Proteinase K, può essere visualizzato su un gel di agarose 2%. Il DNA sonicato è suddiviso in una raccolta di frammenti che appaiono come uno striscio sul gel di agarose. La dimensione media dei frammenti diminuisce con un numero crescente di esplosioni di sonicazione (Figura 5). Il trasferimento di energia varierà per diverse unità di sonicatori, quindi si consiglia un saggio di sonicazione per determinare il numero di esplosioni di sonicazione necessarie per frammentare il DNA a una media inferiore a 1 kb. Per il nostro esperimento ChIP-seq, abbiamo scelto 5 burst.

Le linee guida ENCODE raccomandano una conferma dell'attività di legame del bersaglio degli anticorpi con un immunoblot21. In questo caso abbiamo misurato la specificità e la forza di legame del nostro anticorpo mediante immunoblot su lismi cellulari interi preparati per ChIP (Figura 6). Abbiamo confermato che l'anticorpo si lega a CsgD-3xFLAG; i segnali anti-FLAG e anti-CsgD si colocalizzano al peso molecolare previsto (28 kDa)22.

Le procedure ChIP spesso producono basse concentrazioni di DNA. Pertanto, è stato scelto un metodo di purificazione che rimuove i contaminanti e mantiene un'alta percentuale del DNA. La purificazione magnetica delle perline è stata scelta sulla purificazione basata su colonne perché ha mantenuto migliori basse concentrazioni di DNA ChIP in ingresso (Figura 7) e ha rimosso i contaminanti (dati non mostrati).

A causa della ridotta quantità iniziale di DNA, la preparazione della libreria del DNA ChIP può richiedere adattatori diluiti e arricchimento della PCR. Prima del sequenziamento, le librerie possono essere visualizzate dalla traccia Bioanalyzer per confermare la corretta distribuzione delle dimensioni prima e dopo l'arricchimento della PCR (Figura 8). Inoltre, se c'è un obiettivo normativo noto del fattore di trascrizione, qPCR deve essere utilizzato per confermare l'arricchimento delle regioni di legame confrontando la modifica di piegatura ( , Ct) tra l'abbondanza di sequenza genica di destinazione e di riferimento nota nel DNA di input immunoprecipitato e sonicato.

I dati di sequenziamento ChIP devono essere analizzati assegnando punteggi di qualità, tagliando basi di bassa qualità, allineando letture in avanti e in retromarcia (in sequenziamento finale accoppiato), assemblando si svolge in un genoma di riferimento di alta qualità, trovando picchi sopra lo sfondo ed eseguendo analisi a valle (Figura 9A). L'analisi a valle dovrebbe includere la visualizzazione e l'annotazione dei picchi, la coerenza con i campioni di replica biologica e l'analisi dei motivi, e potrebbe includere l'analisi del legame differenziale tra condizioni o tipi di cellule e l'integrazione dei dati con l'espressione genica da percorsi noti. Per i dati ChIP-seq come il nostro, i picchi devono essere identificati come significativamente sopra lo sfondo (Figura 9B,C, barre rosse) con una determinazione del valore p, non semplicemente da un cambiamento di piegatura. Nell'analisi finale, le letture mappate vengono visualizzate in base all'annotazione del genoma di riferimento (Figura 9D). Un risultato CIP-seq scarso apparirebbe come input-seq senza picchi significativi sopra lo sfondo.

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Figura 1: Illustrazione dei passi in ChIP-seq con biofilm batterici. Nella procedura descritta, S. Le cellule di typhimurium sono coltivate nella coltura del flask dell'1% del Tryptone a 28 gradi centigradi con agitazione (1), i supporti condizionati senza cellule vengono raccolti per la gestione dei tipi di cellule biofilm (2), che viene utilizzato per raccogliere una quantità adeguata di biofilm e cellule planctoniche (3). Queste cellule vengono lavate con PBS e omogeneizzate per rompere il biofilm (4). Le proteine sono interconnesse al DNA con un crosslinker di formaldeide, dopo di che le cellule vengono lised per rilasciare il contenuto cellulare (5). Il DNA nella cellula lisata è frammentato dalla sonicazione (6). Il DNA collegato alla proteina bersaglio viene selezionato attraverso l'immunoprecipitazioni con un anticorpo che si lega alla proteina bersaglio e alle perle magnetiche proteiche Del Gruppo (7). Il DNA selezionato viene lavato e eseguito da perline magnetiche proteiche G (8) e purificato per la preparazione e il sequenziamento della libreria (9). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Modello di pascino in vitro per lo studio di S. Sviluppo di biofilm di Typhimurium. (A) S. Le cellule di typhimurium coltivate nell'1% di tritone per 13 h a 28 gradi centigradi subiscono la commutazione del fenotipo per formare aggregati di biofilm e cellule planctoniche nella fase liquida della coltura del pallone. (B) Gli aggregati di biofilm e le cellule planctoniche della coltura del pallone in (A) sono stati separati attraverso la centrifugaa a 210 x g per 2 min. Il supernatante è stato raccolto per i preparati delle cellule plancttoniche e il pellet è stato raccolto per i preparati cellulari biofilm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Concentrazioni proteiche totali per le cellule planctoniche e i campioni di cellule biofilm raccolti da S. Cultura del fiascheno di Typhimurium. Sono stati eseguiti analisi delle proteine colorimetriche e le quantità di proteine relative a una curva standard BSA sono state misurate a 750 nm. Il contenuto proteico di campioni di cellule planctoniche lismitra a 4.0, 6.0, e 8.0 OD600 sono stati confrontati con 30 mg di aggregati biofilm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: omogeneizzazione dei campioni cellulari da S. Colture di fiaschedi biofilm di Typhimurium. (A) Gli aggregati Biofilm della coltura del pallone risospesi in PBS (a sinistra) sono stati omogeneizzati utilizzando un mulino a 30 Hz per 5 min (a destra). (B) Le cellule planctoniche della coltura del flacone risospese in PBS sono state lavorate dal mulino miscelatore a 30 Hz per 5 min per garantire la coerenza tra i campioni di tipo cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Analisi di Sonicazione con lisai delle cellule pre-ChIP. I campioni di cellule biofilm aggregate e planctoniche sono stati separati, omogeneizzati, incrociati e lismi. I complessi DNA-proteina sono stati sonicati fino a 8 volte a 30 s su e 2 min off sul ghiaccio per rompere il DNA in frammenti più piccoli. Una porzione del lisato sonoro è stata separata su un gel di agarose del 2%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Specificità di legame del bersaglio dell'anticorpo anti-FLAG utilizzato in ChIP-seq. La specificità degli anticorpi è stata valutata mediante immunoblotting contro i lismi cellulari interi preparati dalle colture di fiaschetta della S. Ceppi di typhimurium come mostrato. I campioni di biofilm ceppo e p3xFLAG/csgD e WT rappresentano gli aggregati di biofilm raccolti dai flaconi, mentre le cellule di ceppo, csgD e p3xFLAG, rappresentano cellule planctoniche. Purificato CsgD con tag fu caricato come controllo. Le lisati intere sono state normalizzate in modo che siano stati analizzati 30 g di proteine totali in ogni corsia. I numeri a sinistra si riferiscono alla dimensione (in kDa) dei marcatori di peso molecolare prestained. L'anticorpo primario utilizzato per la macchia superiore era l'anticorpo policlonale rabbit-anti-FLAG (Sigma-Aldrich #F7425), mentre la macchia inferiore è stata incubata con coniglio-anti-FLAG insieme a un anticorpo monoclonale specifico della CsgD2. L'anti-coniglio di capra IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) e l'antito-tono di capra IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) sono stati utilizzati come anticorpi secondari. I segnali fluorescenti sono stati visualizzati utilizzando il sistema di imaging Odyssey CLx e il pacchetto software Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences). Vengono visualizzate le immagini rappresentative. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Strategie di purificazione basate su perline a colonna o magnetica per piccole quantità di DNA risultanti da esperimenti ChIP-seq. I campioni di quantità note di DNA sono stati purificati utilizzando kit a colonna o perline magnetiche e la concentrazione dell'eluato è stata misurata dopo la purificazione. Le perle magnetiche hanno mostrato un migliore recupero a bassi livelli di DNA, simile alle basse quantità di DNA tipicamente incontrate alla fine del protocollo ChIP-seq, ma prima della preparazione della libreria NGS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Preparati del DNA ChIP e librerie successive visualizzate da Bioanalyzer. (A) La dimensione media dei frammenti del DNA genomico dopo la lisi cellulare e la sonicazione è stata di <1000 bp, con la maggior parte dei frammenti nell'intervallo di 200-500 bp. (B) Il materiale di partenza per la preparazione della libreria era al di sotto del rilevamento. (C) La legatura dell'adattatore e l'arricchimento della PCR consentono l'amplificazione dei frammenti della libreria. (D) Una scarsa preparazione della biblioteca ha picchi di DNA bassi, picchi di peso molecolari di forma dispari o alti, o picchi di adattatori abbondanti a circa 100 bp. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: I dati ChIP-seq vengono analizzati utilizzando strumenti bioinformatici e visualizzati su un browser genoma. A. Diagramma di flusso per l'analisi bioinformatica tipica dei dati ChIP-seq. Le letture non elaborate per i biofilm (ceppodi csgD , p3xFLAG /csgD) e le celle planctoniche(csgD e p3xFLAG) sono state pulite per letture e schede di bassa qualità e mappate a S. Genomi di Typhimurium 14028s (NC_016856.1 per il cromosoma e NC_016855.1 per il plasmide) di Bowtie2 (v2.3.3.1) con parametri di default23. MACS2 (v2.1.2) è stato utilizzato per chiamare i picchi con parametri di '-q 0.01 -- nomodel', prendendo biofilm replica come set di dati di prova e planctonici come controllo24. Il modulo MACS2 bdgcmp è stato ulteriormente utilizzato per generare una traccia di arricchimento con parametri di '-m FE'. Il file di picco significativo con traccia pieghevole è stato trasformato in un file di parrucca utilizzando bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 e visualizzato sul genoma di riferimento utilizzando Integrative Genomics Viewer v2.5.126. Vengono visualizzati i picchi rappresentativi (barre rosse). (B) La grande regione di 40 kbp, che contiene più picchi, è un risultato atipico ma ancora potenzialmente prezioso. (C) Si tratta di un risultato più tipico, che mostra due regioni di picco significative. (D) Ingrandisci il picco sinistro in C, mostrando le letture che vengono mappature alla regione della S. Typhimurium 14028s genoma contenente promotori divergenti per uspA e uspB. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Buffer di lisi cellulare
Buffer di lisi
50 mM Tris-HCl pH 8.1
10 mM EDTA
1% SDS
inibitori della proteasi
Buffer di diluizione IP
20 mM Tris-HCl pH 8.1
2 mM EDTA
150 mM NaCl
1% Triton X-100
0,01% SDS
Buffer di immunoprecipitazioni
Buffer di lavaggio IP 1
20 mM Tris-HCl pH 8.1
2 mM EDTA
50 mM NaCl
1% Triton X-100
0,1% SDS
Buffer di lavaggio IP 2
10 mM Tris-HCl pH 8.1
250 mM liCl
1 mM EDTA
1% NP-40
1% acido deossicolico
TE (T10E1) pH 8.0
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
Buffer di eluzione
1% SDS
100 mM NaHCO3

Tabella 1. Ricette buffer.

Discussione

Questo protocollo delinea una tecnica per eseguire ChIP-seq con Salmonella enterica sierovar biofilm e cellule planctoniche dalla coltura pura, per trovare obiettivi normativi del regolatore di biofilm master, CsgD. Ci aspettiamo informazioni di legame differenziale a causa della bistabilità della CsgD nei due tipi di cellule, con alti livelli negli aggregati dei biofilm e bassi livelli nelle celle planctoniche2,3. Tuttavia, questa tecnica può essere applicata anche ad altri fattori di trascrizione batterica, tipi di cellule o condizioni di crescita. In particolare, questa tecnica può essere adattata ad altri biofilm batterici utilizzando un fattore di conversione determinato sperimentalmente per la CFU per unità di peso delle cellule di biofilm.

ChIP-seq può essere soggetto all'amplificazione di errori tecnici tramite il sequenziamento; tuttavia, la conferma nei passaggi critici può impedire questo27. La specificità primaria degli anticorpi è importante per selezionare solo il fattore di trascrizione bersaglio e il DNA che controlla durante l'immunoprecipitazioni7. In questo esperimento, csgD è stato fuso in un tag 3xFLAG con codifica plasmide alla fine del gene, corrispondente al capo-C di CsgD22. Il plasmide p3xFLAG senza csgD è stato utilizzato come un "controllo" (S. Typhimurium 14028 -csgD - p3xFLAG). Le linee guida ENCODE raccomandano di eseguire immunoblot con anticorpo primario contro la proteina di interesse, e lisa dei ceppi ChIP e ceppi di eliminazione21. È importante assicurarsi che le condizioni di crescita siano coerenti tra le repliche per ridurre la variabilità nell'associazione dei fattori di trascrizione e nei risultati di sequenziamento a valle. Se si fa attenzione a garantire che le dimensioni dell'inoculo e le condizioni di crescita pre-inoculo siano costanti, la crescita dei biofilm nella cultura del fiaschetta è costante4. È importante confermare che tutti i biofilm sono stati separati dopo l'omogeneizzazione, per garantire la parità di accesso dei reagenti, in particolare del paradisi incrociato di formaldeide, a tutte le cellule.

Diverse modifiche possono consentire ai ricercatori di utilizzare questo protocollo per altre proteine che legano il DNA, tipi di cellule, ceppi, condizioni di crescita o attrezzature di laboratorio. Se viene utilizzato per specie che formano biofilm diverse da S. Typhimurium, il fattore di conversione delle unità formanti colonia per unità di peso del biofilm deve essere determinato sperimentalmente raccogliendo diverse quantità di biofilm, omogeneizzando accuratamente il biofilm ed eseguendo diluizioni seriali e il conteggio delle piastre per creare una curva standard, che potrebbe non essere accurata a pesi biofilm più bassi2. Trasferimento di energia Sonicator e resistenza al tipo di cellula possono differire; pertanto, si consiglia un saggio di sonicazione per trovare il numero di esplosioni di sonicazione che produrranno la gamma di dimensioni dei frammenti necessaria per la preparazione della libreria a valle e il sequenziamento11. La frammentazione della cromatina da nuclease micrococcale è un'alternativa alla sonicazione che produce alta risoluzione dei siti di occupazione; tuttavia, questo metodo può introdurre la distorsione della frammentazione7,28. La gamma di dimensioni del DNA può essere modificata a seconda dei kit di preparazione della libreria a valle e delle piattaforme di sequenziamento. Altri metodi di omogeneizzazione possono essere utilizzati al posto del mulino miscelatore. Ad esempio, un omogeneizzatore del tessuto di vetro può essere sostituito, ma può aerosolizzare o rompere in modo incompleto il biofilm. In termini di controlli, il DNA pre-immunoprecipitato può essere normalizzato nell'elaborazione e nell'analisi post-sequenziamento. Un controllo mock-IP con siero anticorpo normale abbinato a specie può essere utilizzato anche come controllo13.

I ricercatori devono considerare le limitazioni a questo metodo quando si considera un esperimento ChIP-seq. Potrebbero essere necessarie modifiche significative per adattarlo ad altri tipi di biofilm. Ad esempio, con Salmonella Typhimurium la sospensione immediata del biofilm in PBS porta alla perdita misurabile di aggregati di biofilm. L'immunoprecipitazioni mirare a bersagli normativi di fattori di trascrizione nei batteri può provocare piccole quantità di DNA, che è una sfida per la purificazione e il rilevamento nelle fasi successive. Bias può essere introdotto durante la tosatura e la manipolazione a valle durante il rilevamento della libreria9. Inoltre, questo metodo non rivela i livelli di espressione in vivo in risposta all'associazione del fattore di trascrizione. I ricercatori che hanno poca esperienza in bioinformatica possono essere sfidati dalla pipeline di analisi. Questo metodo può richiedere molto tempo e denaro; tuttavia, il costo del sequenziamento è spesso inferiore a quello di un microarray e sta diminuendo nel tempo man mano che si continuano a migliorare i miglioramenti tecnologici.

Pochi metodi nella letteratura descrivono ChIP con batteri, e la maggior parte degli esperimenti batterici inizia con una semplice condizione di crescita13,14,15,17,18. La preparazione dei campioni ChIP con singole cellule è semplice e presenta meno sfide rispetto alla preparazione dei campioni ChIP con le aggregazioni di biofilm. Per quanto riguarda ChIP-seq, i metodi precedenti di studio dei circuiti cis-regolatori, tra cui l'evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX), i saggi elettroforici per la mobilità (EMSA), ChIP-chip, la rimozione dei promotori e l'analisi dei reporter sono stati integrati o sostituiti da ChIP-seq29. ChIP-seq sta sostituendo ChIP-chip a causa dell'avanzata delle tecnologie e della disponibilità del sequenziamento. Il sequenziamento profondo fornisce ai ricercatori enormi quantità di dati in grado di identificare i siti con una minore affinità di legame e una risoluzione più elevata della coppia di basi con meno materiale iniziale rispetto a ChIP-chip11,30. L'analisi dei dati ChIP provenienti da organismi con genomi di riferimento di alta qualità è generalmente veloce e specifica. Inoltre, ChIP-seq è un metodo completo per scoprire in silico previsti siti di legame che non possono essere occupati in tutti i tipi di cellule, fase di crescita, o condizioni ambientali31.

In futuro, questo protocollo può essere utilizzato per facilitare la comprensione della patogenesi batterica, in particolare gli organismi che formano biofilm. Un'ampia adozione di questa tecnica e la disponibilità di nuovi set di dati possono portare all'integrazione dei dati per identificare gruppi di proteine che co-localizzano per controllare i processi cellulari nei microrganismi che formano biofilm32. Inoltre, i dati ChIP-seq e RNA-seq possono essere integrati per costruire modelli di sistema normativi33.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#2017-05737) ad AW e attraverso la cattedra Jarislowsky in Biotecnologia. MP è stato sostenuto da una borsa di studio NSERC-CREATE attraverso il programma di formazione integrata in malattie infettive, sicurezza alimentare e politica pubblica (ITraP) presso l'Università di Saskatchewan.

Gli autori ringraziano Dani Dale per le riprese e il montaggio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Polvere di agarosioFroggaBioA87-500G
Balance (Explorer pro)OhausEP214
(8510R)Eppendorf022627023
Bioanalyzer 2100AgilentG2939BA
BR dsKit DNAThermoFisher ScientificQ32850
ChIP-Grade Protein G Magnetic BeadsTecnologia di segnalazione cellulare9006
cOmplete, senza EDTA Cocktail di inibitori della proteasiSigma-AldrichCOEDTAF-RO ROCHE
Tubo conico 15 mLFroggaBioTB15-500
Tubo conico 50 mLFroggaBioTB50-500
DC Protein Assay Kit IIBioRad5000112
Cuvetta monouso, 1,5 mLFisher Scientific14-955-127
Apparecchiature per elettroforesi (mini-PROTEAN)Bio-Rad1658000
Centrifuga da pavimento (Sorvall Evolution RC)Termo Scientific728211
fluorimetro (Qubit 3.0)Thermo Fisher ScientificQ33216
FormaldeideSigma-Aldrich252549
GelRed® Gel per acido nucleico Stain 10 000x in acquaBiotium41003
Kit DNA ad alta sensibilitàAgilent5067-4626
Incubatore (agitazione)VWR1570-ZZMFG
Incubatore (agitazione a bagnomaria)New BrunswickG76D
LB mediaVWR90000-808
Supporto magnetico (DynaMag)Fisher Scientific12321D
Microcentrifuga (refrigerata)Eppendorf5415R
Provette per microcentrifuga, 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Kit di reagenti MiSeq v3 (150 cicli)IlluminaMS-102-3001
Mulino miscelatoreRetschMM400
Nalgene 115 mL Unità filtranti, sterile, 0,2 & micro; m dimensione dei poriThermo Scientific73520-980
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit per IlluminaNew England BioLabsE7370S
NGS Pulizia e dimensioni Seleziona perline magneticheMachery-Nagel744970.5
Siero di topo normaleAbCamab188776
Piastre di Petri con coperchio trasparente (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712
Pipetta controllerFroggaBioMP001
proteinasi KThermoFisher ScientificAM2542
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
Coniglio Anticorpo policlonale anti-FLAGSigma-AldrichF7425
RNasi A (10 mg/mL; Senza proteasi e proteasi)ThermoFisher ScientificEN0531
Ruota rotanteCrystal Technologies & IndustriesTR 01A
Provette Safe-Lock (2,0 mL, incolore)Eppendorf22363344
Pipetta sierologica 25 mLSpettrofotometro FroggaBio94024
Montreal Biotech Inc.Perline in acciaio inossidabile Libra S22
, 5 mmQiagen69989
Micropunta conica 1/8" (3 mm) Sonda sonicatriceSonics & Materiali, Inc.630-0418
Tryptone mediaVWR90000-286
Processore di liquidi ad ultrasuoni (Sonicator)Sonics & Materiali, Inc.VC300
Apparecchiature per il vuoto (Vacufuge plus)Eppendorf022820001
Bagnomaria 1 (Lab-line aquabath)Thermo Scientific18000-1
Bagnomaria 2 (Precision)Thermo Scientific51221044
Centrifuga da banco

Riferimenti

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