Method Article

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

DOI:

10.3791/60738

⸱

January 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine indotta chimicamente con l'affinità e la specificità desiderate per ogni piccolo ligando molecolare avrebbe molte applicazioni biologiche di rilevamento e attuazione. Qui, descriviamo un metodo efficiente e generalizzabile per l'ingegneria de novo di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti attraverso la selezione graduale di una libreria di anticorpi combinatori combinatori e di foragi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli eventi di dimerizzazione delle proteine che si verificano solo in presenza di un ligando di piccole molecole consentono lo sviluppo di biosensori di piccole molecole per la dissezione e la manipolazione dei percorsi biologici. Attualmente, ne esistono solo un numero limitato di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti (CID) e l'ingegneria di nuovi sistemi con la sensibilità e la selettività desiderate per specifici ligandi di piccole molecole rimane una sfida nel campo dell'ingegneria delle proteine. Qui descriviamo un metodo di screening ad alta produttività, combinatorial binders-enabled selezione di CID (COMBINES-CID), per l'ingegneria de novo di sistemi CID applicabili a una grande varietà di ligandi. Questo metodo utilizza la selezione in due passaggi di una libreria nanobody combinatorial visualizzata da fago per ottenere 1) "leganti di ancoraggio" che prima si legano a un ligando di interesse e poi 2) "leganti di dimerizzazione" che si legano solo ai complessi binder-ligando di ancoraggio. Per selezionare i leganti di ancoraggio, una libreria combinatoria di oltre 109 nanocorpi randomizzati di regioni (CDR) viene sottoposta a screening con un legamento biotinylato e gli colpi vengono convalidati con il legamento senza etichetta tramite interferometria biostrato (BLI). Per ottenere leganti di dimerizzazione, la libreria nanobody viene sottoposta a screening con complessi di legatrice-ligando di ancoraggio come obiettivi per lo screening positivo e i leganti di ancoraggio non associati per lo screening negativo. COMBINES-CID è ampiamente applicabile per selezionare leganti CID con altri immunoglobulina, non immunoglobulina, o scaffold progettati computazionalmente per creare biosensori per il rilevamento in vitro e in vivo di farmaci, metaboliti, molecole di segnalazione, ecc.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I sistemi CID, in cui due proteine si dimerdano solo in presenza di un ligando di piccole molecole (Figura 1), offrono strumenti versatili per sezionare e manipolare metaboliche, segnalazioni e altre vie biologiche1. Hanno dimostrato il potenziale nell'attuazione biologica, come l'attivazione delle cellule T controllate da farmaci2 e l'apoptosi3,4, per migliorare la sicurezza e l'efficacia della terapia con cellule T adottiva. Inoltre, forniscono una nuova metodologia per il rilevamento in vivo o in vitro di bersagli di piccole molecole. Ad esempio, le proteine CID possono essere geneticamente fuse con sistemi di segnalazione di fluorescenza (ad esempio, il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)5 e proteine fluorescenti permutate in modo circolare)6 per misurazioni in vivo in tempo reale, o servono come reagenti di affinità per gli immunosbenatori simili a assaggi di assaggio (ELISALISA).

Nonostante le loro ampie applicazioni, la creazione di nuovi sistemi CID che possono essere controllati da un determinato ligando di piccole molecole ha grandi sfide. Metodi di ingegneria dei leganti proteici stabiliti, tra cui l'immunizzazione animale7, la selezione in vitro8,9e il disegno delle proteine computazionali10 possono generare proteine leganti che funzionano tramite interazioni binarie proteina-ligando. Tuttavia, questi metodi hanno difficoltà a creare un complesso CID ternario indotto dal ligando. Alcuni metodi creano CID collegando chimicamente due ligando che si legano in modo indipendente alle stesse proteine11,12, 13,14,15,16 o si basano sulla selezione di proteine leganti come anticorpi che colpiscono piccoli complessi molecolari-proteine preesistenti17,18, e quindi hanno una scelta limitata di ligandi.

Recentemente abbiamo sviluppato un metodo combinatorial binders-enabled di CID (COMBINES-CID) per l'ingegneria de novo dei sistemi CID19. Questo metodo può ottenere l'elevata specificità della dimerizzazione indotta dal ligando (ad esempio, una costante di dissociazione del legante di ancoraggio, KD (senza ligando)/KD (con ligando) > 1.000). La specificità della dimerizzazione si ottiene utilizzando leganti di ancoraggio con siti di legame flessibili che possono introdurre cambiamenti conformazionali al momento della legatura del ligando, fornendo una base per la selezione di leganti conformazionali selettivi che riconoscono solo leganti legati al ligando. Abbiamo dimostrato una prova di principio creando eterodimeri indotta da cannabidiolo (CBD) di nanocorpi, un frammento di anticorpi funzionale da 12-15 kDa da camelid che comprende un ponteggio universale e tre anelli CDR flessibili (Figura 2)20, che possono formare una tasca legante adattabile con epitopi di piccole molecole21,22. In particolare, la selezione invitro di una biblioteca proteica combinatoria dovrebbe essere conveniente e generalizzabile per l'ingegneria del CID, poiché la stessa libreria di alta qualità può essere applicata a diversi ligandi.

In questo protocollo e video, ci concentriamo sulla descrizione della selezione in vitro in due fasi e della convalida dell'ancora (Figura 3A) e dei leganti di dimerizzazione (Figura 3B) esaminando la biblioteca combinatoria di nanobody con una diversità superiore a 109 utilizzando il CBD come obiettivo, ma il protocollo dovrebbe essere applicabile ad altre librerie proteiche o a bersagli di piccole molecole. Lo screening dei leganti CID richiede solitamente 6-10 settimane (Figura 4).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Costruzione della biblioteca

  1. Utilizzare una libreria di anticorpi combinatori sintetici a dominio singolo con una varietà di 1,23–7,14 x 109, come descritto in precedenza19. Anche se questo protocollo non include la costruzione di librerie, può essere applicato ad altre librerie di leganti combinatori.

2. Biotinylazione dell'obiettivo di ligando o del ligando

  1. Biotinylate il ligando selezionato, ad esempio, CBD e tetraidrocannabinolo (THC)19, attraverso varie strategie di sintesi chimica, a seconda dei siti di biotinylazione adatti di un bersaglio.

3. Screening del legante di ancoraggio

  1. Inizio della selezione
    1. Inizia ogni round di selezione inoculando una singola colonia di cellule TG1, appena coltivata in 6 mL di 2YT a 37 gradi centigradi e 250 giri al minuto (rpm) a un assorbimento di 600 nm (OD600)di 0,5 dollari. Incubare le cellule sul ghiaccio per l'uso al punto 3.5.1.
  2. Selezione negativa con perline di streptavidina legate alla biotina
    1. Preparare le "perle di selezione negativa" lavando 300 -L di perline magnetiche rivestite di streptavidin utilizzando un rack di separazione magnetica, 3x con 0,05% di salina con tampone Tween (PBST, 1 x PBS con 0,05% vol/Vol Tween 20%) e 2x con 1 x PBS.
    2. Risospendere le perline con 1 mL dell'1% di caseina in 1 x PBS (pH - 7,4) e saturare le perline aggiungendo 5 volte la capacità di legame riportata utilizzando biotina. Incubare a temperatura ambiente (RT) su un rotatore per 1 h.
    3. Lavare le perline 5x utilizzando 0,05% PBST e 3x utilizzando 1 x PBS, per un totale di otto lavaggi.
    4. Aggiungete 1013 particelle di fagi nell'1% di caseina/1% di BSA in 1 x PBS (pH - 7,4) e incubate a RT su un rotatore per 1 h.
    5. Dopo l'incubazione, raccogliere il super-an viene utilizzato nel passaggio 3.3.6.
  3. Selezione positiva con perline di streptavidina leganti biotinylate
    1. Preparare le "perline di selezione positiva" utilizzando 1/2 il volume delle perline utilizzate per le "perline di selezione negativa" seguendo i passaggi 3.2.1.
    2. Sospendere nuovamente le perline con 1 mL 1% caseina in 1 PBS, pH 7.4 e saturare le perline aggiungendo 5 volte la capacità di legame completa calcolata in base al manuale utilizzando il legamento biotinyato di scelta. Incubare a RT su un rotatore per 1 h.
    3. Lavare le perline 5x utilizzando 0,05% PBST e 3x utilizzando 1 x PBS, per un totale di otto lavaggi.
    4. Bloccare le perline con 1 mL dell'1% di caseina/1% BSA in 1 x PBS (pH - 7,4) e incubare a RT su un rotatore per 1 h per evitare il legame non specifico tra i fagi e le perline magnetiche rivestite di streptavidin.
    5. Lavare le perle magnetiche rivestite di streptavidin 3x utilizzando 0,05% PBST e una volta utilizzando 1 x PBS, per un totale di quattro lavaggi.
    6. Risospendere le perle magnetiche rivestite di streptavidin utilizzando i fagi non legati presi dal passo 3.2.5 e incubare a RT su un rotatore per 1 h.
    7. Estrarre il supernatante senza disturbare le perline magnetiche. Salvare i fagi non associati come input, da utilizzare nel passaggio 3.5.1.Save the unbound phages as input, to be used in step 3.5.1.
    8. Lavare le perline 10x utilizzando 0,05% PBST e 5x utilizzando 1 x PBS. Tra ogni tre fumi, trasferiscili in un nuovo tubo per evitare fagi non specificamente legati alle pareti del tubo.
  4. Elution of phage-displayed nanobodies
    1. I fagi legati in modo competitivo sommando 450 -L del ligando non biotinylato,utilizzando una concentrazione nella gamma micromolare (ad es., 10-50 M) e incubando a RT su un rotatore per 30 min. La concentrazione di ligando selezionata per l'elusione competitiva dei fagi legati dipende dal KD desiderato del "legante di ancoraggio". Le concentrazioni di ligando possono essere relativamente elevate nei turni di selezione iniziali e quindi diminuite nei turni successivi.
    2. Raccogliere supernatali e salvare i fagi eluiti come output, da utilizzare nel passaggio 3.5.2.
  5. Titrazione di ingresso/uscita e infezione
    1. Per la titolazione di input, preparare 10x diluizioni seriali in 1 x PBS fino a 109-fold con il fago di ingresso dal passaggio 3.3.7. Utilizzare le diluizioni seriali da 107–109 per fare infezioni trasferendo un fagiolo di ingresso di 10 l da ciascuna diluizione a 70 celle TG1 (OD600 di 0,5 usd). Incubare a 37s per 45 min, placcare le cellule TG1 infette su tre piatti da 2YT-agar da 90 mm contenenti 100 anttadina e il 2% (wt/vol) di glucosio, e incubare la notte a 37 . Dalle piastre notturne, l'input di fago può essere calcolato come segue:
      figure-protocol-1
    2. Per l'infezione e la titolazione in uscita, trasferire i fagi eluiti dal passo 3.4.2 a 3 mL di cellule TG1 (OD600 di 0,5 dollari). Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 45 min. Quindi preparate le diluizioni seriali 10x in 2YT fino a 103volte, placcate ogni diluizione su piatti da 90 mm 2YT-agar e incubate la notte a 37 gradi centigradi. Dalle piastre notturne, l'uscita del fago può essere calcolata come segue:
      figure-protocol-2
    3. Dividere le restanti cellule TG1 infette su tre piastre da 2YT-agar da 150 mm contenenti 100 ampicillina e il 2% (wt/vol) di glucosio. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
  6. Amplificazione e recupero della libreria per ulteriori cicli di selezione
    1. Aggiungere 3 mL di 2YT per piastra, raschiare con un raschietto sterile e raccogliere tutte le cellule in un tubo conico da 50 mL. Mescolare le cellule raccolte con glicerolo sterile (20% wt/vol concentrazione finale). Misurare l'OD600 della miscela e fare 3-5 aliquote. Conservare a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
    2. Per il salvataggio dei fagi, diluire la miscela batterica TG1 contenente faghe con un composto da fagomici utilizzando 25 mL di supporti 2YT integrati con il 2% di glucosio e 100 ampillina a un OD600 di 0,1. Cellule di coltura a 37 e 250 rpm a un OD600 di 0,5 USD.
    3. Superinettare le cellule aggiungendo il fagiolo di aiuto CM13 a 5 x 109 pfu/mL e incubare a 37 e 250 rpm per 45 min. Il fago di aiuto CM13 fornisce le proteine del mantello di fago necessarie per l'assemblaggio di particelle di fagi complete.
    4. Centrifugare la coltura a 8.000 x g per 10 min per rimuovere il glucosio. Risospendere le cellule utilizzando un supporto da 50 mL di 2YT integrato con 100 ampicillina g/mL e 50 g/mL di kanamicina e incubare a 25 e 250 rpm durante la notte.
    5. Centrifugare le cellule della coltura notturna a 9.000 x g, 4 gradi centigradi per 30 min. Trasferire supernatali in un nuovo tubo e fagi precipitati nel supernatante utilizzando 1/5 volume peg/ NaCl soluzione (20% wt / vol polietilene glicole-6.000 e 2.5 M NaCl). Mescolare delicatamente e mettere sul ghiaccio per 1 h.
    6. Raccogliere le particelle di fago mediante centrifugazione utilizzando 12.000 g a 4 gradi centigradi per 30 min. Risospendere i pellet utilizzando 1 mL di 1 x PBS e trasferire la sospensione in un tubo di microcentrifuga. Centrifugare il tubo a 20.000 x g e 4 gradi centigradi per 10 min per rimuovere i batteri residui.
    7. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga senza disturbare il pellet batterico. Utilizzare una diluizione 1:100 per misurare l'assorbimento a 269 nm e 320 nm. Il numero totale di fagi può essere calcolato utilizzando la seguente formula23:
      figure-protocol-3
    8. Conservare la biblioteca di fagi a 4 gradi centigradi per uso a breve termine o con il 25% di glicerolo a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
    9. Ripetere i round di selezione (passaggi da 3,1 a 3,6) per 3-6 turni o fino a quando non viene osservato l'arricchimento desiderato (fare riferimento alla sezione Risultati). Piastra e scegliere singoli cloni (sezione 4) al fine di caratterizzare la loro affinità e specificità al ligando (sezioni 5-7).

4. Isolamento di un singolo clone

  1. Per isolare singoli cloni da una sottolibreria arricchita, preparare le diluizioni seriali 10 x delle cellule TG1 infettate da fagi (passaggio 3.5.2). Piatto diluizioni seriali su 90 mm 2YT-agar-agar piatti contenenti 100 g/mL ampicillina e 2% (wt/vol) glucosio e incubazione a 37 gradi durante la notte.
  2. Dalle piastre notturne, scegliete le colonie singole in 250 gradi di supporto 2YT integrati con 100 anflussi per pozzo in sterili piastre di pozzi profondi e crescono a 37 gradi durante la notte.
  3. Dalle colture notturne, inoculari 10 gradi l in 500 -L di nuovi supporti 2YT integrati con 100 ampicillina di g/mL.
  4. Far crescere le cellule fino a un OD600 di 0,5 dollari, aggiungere il fago di supporto CM13 a 5 x 109 pfu/mL e incubare a 37 e 250 rpm per 45 min.
  5. Aggiungete 500 l di supporti 2YT integrati con 100 ampicillin a 10g/mL e 50 g/mL di kanamycin. Incubare a 25 e 250 rpm durante la notte.
  6. Centrifugare le piastre del pozzo profondo dalle colture durante la notte a 3.000 x g per 10 min. Raccogliere il supernatante contenente le particelle di fago senza disturbare il pellet cellulare.
  7. Le particelle di fago possono essere utilizzate per ELISA per determinare la specificità dei cloni selezionati al ligando. La biotina o un omologo strutturale dell'obiettivo possono essere utilizzati come controllo negativo.

5. Convalida del legante di ancoraggio da parte di ELISA

  1. Cappotto 96 pozze ELISA utilizzando 100 g l di 5 g/mL streptavidin nel tampone di rivestimento (100 mM di carbonato di tampone, pH - 8,6) a 4 gradi durante la notte.
  2. Lavare le piastre ELISA 3x utilizzando 0,05% PBST e aggiungere 100 -L di 1 bersaglio biotinylato di 1 M ai pozzedi bersaglio. Aggiungete 100 l di biotina o omologio bersaglio ai pozzetti di controllo. Incubare a RT per 1 h.
  3. Piastre lacerate 5x utilizzando 0,05% PBST e bloccano l'attacco non specifico aggiungendo 300 - L dell'1% di caseina in 1 x PBS. Incubare a RT per 1 h.
  4. Lavare le piastre ELISA 3x utilizzando 0,05%-PBST e aggiungere il supernatante di fago purificato. Incubare per 1 h a RT.
  5. Lavare le piastre ELISA 10x utilizzando 0,05% PBST e aggiungere 100 -L rafano perossidasi (HRP)-M13 anticorpo proteico principale del mantello (1:10.000 diluizione con 1 x PBS con 1% di caseina). Incubare a RT per 1 h.
  6. Lavare le piastre ELISA 3 volte utilizzando 0,05% PBST e aggiungere il substrato TMB (Tetramethylbenzidinine) di 100.L. Incubare per 10 min o fino a quando non si osserva un cambiamento di colore visibile. Fermare la reazione aggiungendo 100 luna di 1 M HCl. Leggere la piastra a 450 nm su uno spettrofotometro.
  7. Per l'espressione e la purificazione delle proteine, scegliere i cloni che mostrano un'elevata affinità e specificità per il target (vedere Discussione).

6. Espressione proteica, purificazione e biotinylazione

  1. Come riportato in precedenza19, i cloni secondari selezionavano i cloni della sezione 5 ed esprimono come nanocorpi con etichetta Avi e His.
  2. Esprimere i nanocorpi selezionati nel periplasma delle cellule E. coli WK6 (tipicamente nella coltura 1 L), rilasciare per shock osmotico e purificare utilizzando una colonna nichel-NTA (vedi Tabella dei materiali).
  3. Scambio di buffer con una colonna di salanding (1 x PBS con 5% glicerolo; vedere Tabella dei materiali).
  4. Nanocorpi biotinylate utilizzando un kit commerciale (vedi Tabella dei materiali)per un ulteriore utilizzo.

7. Caratterizzazione del legante di ancoraggio di BLI

  1. Analizzare l'affinità di legame e la cinetica di leganti di ancoraggio selezionati immobilizzando 200 leganti di ancoraggio biotinylati nM su biosensori streptavidina (vedi Tabella dei materiali) con buffer di analisi di legame (1 x PBS (pH - 7,4), 0.05% Tween 20, 0.2% BSA, 3% metanolo).
  2. Calcolare le costanti di dissociazione (KD) delle interazioni ancora binder-ligando mediante analisi dello stato costante utilizzando il software di analisi dei dati (vedere Tabella dei materiali). I valori KD ottenuti variano in genere da micromolare a singola e a due cifre.

8. Screening del legante di dimerizzazione

NOTA: Lo screening biopanning di "leganti di dimerizzazione" è simile a quello dei leganti di ancoraggio, ad eccezione di due passaggi critici: 1) I leganti di dimerazione vengono selezionati utilizzando un legante di ancoraggio biotinylato selezionato e il complesso di legatrice-ligando di ancoraggio per e le selezioni positive, rispettivamente. 2) Durante la fase di eluizione, 100 mM triethylamine viene utilizzato per eluire i fagi selezionati positivamente che erano legati solo al legante di ancoraggio --ligand omodello. La soluzione di trimethylamine da 100 mM (pH - 11,5) viene utilizzata per elutizzare cloni positivi interrompendo le interazioni proteiche.

  1. Inizio della selezione
    1. Inizia ogni round di selezione inoculando una singola colonia di cellule TG1, appena coltivata su un supporto minimo, in 6 mL 2YT a 37 e 250 rpm a un OD600 di 0,5 dollari. Incubano cellule sul ghiaccio.
  2. Rimozione di nanocorpi selezionati negativamente
    1. Preparare il "tubo di sottrazione" utilizzando 400 l una di perline magnetiche rivestite di streptavidin e seguire il passaggio 3.2. Tuttavia, invece di saturare con la biotina, aggiungere 5 volte la capacità di legame completa calcolata utilizzando il legante di ancoraggio biotinylato selezionato e salvare i fagi non associati da utilizzare nel passaggio 8.3.3.
  3. Selezione di nanocorpi selezionati positivamente
    1. Preparare il "tubo di cattura" utilizzando 1/2 il volume di perline magnetiche rivestite di streptavidin utilizzate per il "tubo di sottrazione" e seguendo i passaggi da 3.3.2 a 3.3.3. Tuttavia, invece di saturare con il ligando biotinylato, aggiungere cinque volte la capacità di legame completa calcolata utilizzando il legante di ancoraggio biotinylatoselezionato .
    2. Per formare il complesso di legatrice-ligando di ancoraggio per la selezione del legante di dimerizzazione positiva, aggiungere una concentrazione abbastanza alta di ligando non biotinylato. Questo permetterà alla maggior parte dei leganti di ancoraggio legati allo streptavidino di formare il complesso legato al ligando.
    3. Seguire i passaggi da 3.3.3 a 3.3.8, utilizzando i fagi non legati tratti dal "tubo di sottrazione".
  4. Elutizzazione di nanocorpi selezionati positivamente
    1. Elutare i fagi legati al complesso legante-ligando di ancoraggio aggiungendo 450 luna di 100 mM di triethylamine, e incubando a RT su un rotatore per 10 min.
    2. Raccogliere i fagi concorrenziali e seguire i passaggi da 3.4.1 a 3.4.2.
  5. Ulteriori cicli di selezione del raccoglitore di dimerizzazione
    1. Seguire i passaggi 3.5 e 3.6 per amplificare e recuperare la libreria per eseguire ulteriori cicli di selezione. Ripetere i round di selezione per 3-6 turni o fino a quando non viene osservato l'arricchimento desiderato. Piastra e scegliere singoli cloni (fare riferimento alla sezione 4) al fine di caratterizzare la loro affinità e specificità per il bersaglio.

9. Caratterizzazione del legante di dissorizzazione di ELISA

  1. Seguire i passaggi nella sezione 4 per isolare i singoli cloni per la caratterizzazione tramite ELISA.
  2. Per verificare l'affinità dei candidati leganti di dimerizzazione al complesso anchor binder-ligand, rivestire la piastra bersaglio ELISA utilizzando 100 nL di 100 nM legante di ancoraggio biotinylato. Dopo l'incubazione per 1 h, aggiungere 1 MM del bersaglio legante per formare il complesso di legante-ligando di ancoraggio.
  3. La piastra di controllo deve essere rivestita utilizzando il legante di ancoraggio biotinylato da solo per schermare cloni che possono anche legarsi al legante di ancoraggio libero. Aggiungere 100 luna di 100 nM legante di ancoraggio biotinylato e incubare a RT per 1 h.
  4. Seguire le sezioni 5.3–5.7.

10. Caratterizzazione del legante di dimerizzazione da parte di BLI

  1. L'affinità di legame e la cinetica dei leganti di dimerizzazione per il legante di ancoraggio-complesso ligando possono essere analizzati immobilizzando leganti di dimerizzazione biotinyati su biosensori di streptavidina (SA) con il buffer di analisi di legame e quindi analizzati con 1 legante di ancoraggio m pre-equilibrato con diluzioni del ligando. Il KD, kon, e koff delle interazioni può essere calcolato utilizzando il nostro metodo segnalato19.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo la selezione in vitro in due fasi e la convalida dei leganti di ancoraggio e dimerizzazione esaminando la biblioteca combinatoria nanobody con una diversità superiore a 109 utilizzando CBD come obiettivo. È importante valutare l'arricchimento del fago biopanning durante i successivi cicli di selezione sia per i leganti di ancoraggio che per quelli di dimerizzazione. I risultati tipici dell'arricchimento dopo 4-6 cicli di selezione, come illustrato nella Figura 5, sono ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È fondamentale scegliere le giuste concentrazioni di librerie di faghi di input per diversi cicli di biopanning. In genere siamo partiti da una libreria di input di 10-1013 particelle di fago con una diversità >109, consentendo la presentazione di 100-1.000 copie di ogni clone di fago nel saggio pull-down. Se la concentrazione di fago in un saggio vincolante è troppo alta o bassa, la probabilità di legame non specifico o perdita di cloni positivi aumenterà. La selezione del legante di anc...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un brevetto provvisorio relativo a questo lavoro è stato depositato dall'Università di Washington.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dall'University of Washington Innovation Award (a L.G.), una sovvenzione degli U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 a L.G.), e da un fondo di avvio dell'Università di Washington (a L.G.). H.J. è stato sostenuto da una borsa di studio universitaria della Washington Research Foundation. K.W. è stato sostenuto da una borsa di studio universitaria dell'Università di Washington Institute for Protein Design.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Soluzione di substrato ELISA Ultra TMB a 1 faseThermo Fisher Scientific34029
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-2
Amicon Ultra-15 Unità filtrante centrifuga (taglio 3 kDa)MilliporeUFC900324
AmpicillinaThermo Fisher ScientificBP1760-25
Kit di analisi delle proteine Bio-Rad IIBio-Rad
di reazione standard 5000002 BirA biotina-proteina ligasiAvidityBirA500
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
CaseinaSigma-AldrichC7078-1KG
CM13 Helper fagoAnticorpo Design LabsPH020L
D-(+)-Glucosio monoidratoAlfa AesarA11090
Dynabeads M-280 StreptavidinaThermo Fisher Scientific11205D
DynaMag-2 MagneteThermo Fisher Scientific12321D
EDTAThermo Fisher ScientificBP120-1
Scala DNA veloceNew England BiolabsN3238S
FastDigest BglIThermo Fisher ScientificFD0074
GliceroloThermo Fisher ScientificBP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335
HiPrep 26/10 Colonna di desalinizzazioneGE Healthcare17508701
HisTrap-FF-1mlGE Healthcare11000458
ImidazoleAlfa Aesar161-0718
IPTGThermo Fisher Scientific34060
KanamycinThermo Fisher ScientificBP906-5
M13 Major Coat Protein AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-53004
NaClSigma-AldrichS3014-500G
NanoDrop 2000/2000c SpettrofotometriThermo Fisher ScientificND-2000
Nunc 96-Well Polipropilene DeepWell Piastre di conservazioneThermo Fisher Scientific260251
Nunc MaxiSorpThermo Fisher Scientific44-2404-21
Octet RED96ForteBioN/A
pADL-23c PhagemidVector Antibody Design LabsPD0111
PEG-6000Sigma-Aldrich81260-1KG
Platinum SuperFi DNA polimerasiInvitrogen12351010
PureLink PCR Purification KitThermo Fisher ScientificK310001
QIAprep Spin M13Qiagen27704
Mezzo di recuperoLucigen80026-1
SpectraMax Plus 384Dispositivi molecolariN/A
SaccarosioSigma-AldrichS0389-1KG
Biosensori Super Streptavidina (SSA)ForteBio18-5057
Superdex 75 aumento 10/300 GL ColonnaGE Healthcare28-9909-44
T4 DNA LigasiThermo Fisher Scientific15224-025
TG1 Celle elettrocompetentiLucigen60502-1
TrietilamminaSigma-Aldrich471283-100mL
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
TryptoneThermo Fisher ScientificBP9726-5
Tween 20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Estratto di lievitoThermo Fisher ScientificBP1422-2
Zeba Spin Colonna di desalinizzazioneThermo Fisher Scientific89882
Kit

References

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