Method Article

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo per l'immobilizzazione di singole macromolecole in dispositivi microfluidici e la quantificazione dei cambiamenti nelle loro conformazioni sotto il flusso di taglio. Questo protocollo è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche e funzionali di biomolecole come proteine e DNA in un ambiente di flusso.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il comportamento di una singola molecola in perturbazione meccanica è stato ampiamente caratterizzato per comprendere molti processi biologici. Tuttavia, metodi come la microscopia a forza atomica hanno una risoluzione temporale limitata, mentre il trasferimento di energia a risonanza del Fàrster (FRET) consente solo di dedurre le conformazioni. La microscopia a fluorescenza, d'altra parte, consente la visualizzazione in tempo reale in situ di singole molecole in varie condizioni di flusso. Il nostro protocollo descrive i passaggi per catturare i cambiamenti conformazionali di singole biomolecole in diversi ambienti di flusso di taglio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Il flusso di taglio viene creato all'interno di canali microfluidici e controllato da una pompa di siringa. Come dimostrazioni del metodo, il fattore von Willebrand (VWF) e il DNA lambda sono etichettati con biotina e fluoroforo e quindi immobilizzati sulla superficie del canale. Le loro conformazioni sono continuamente monitorate sotto flusso di taglio variabile utilizzando la riflessione interna totale (TIRF) e la microscopia a fluorescenza confocale. Le dinamiche reversibili di svelamento di VWF sono utili per comprendere come la sua funzione è regolata nel sangue umano, mentre la conformazione del DNA lambda offre approfondimenti sulla biofisica delle macromolecole. Il protocollo può anche essere ampiamente applicato per studiare il comportamento dei polimeri, in particolare dei biopolimeri, in condizioni di flusso variabili e per studiare la reologia dei fluidi complessi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono stati ampiamente studiati i meccanismi di risposta alle biomolecole agli stimoli ambientali. In un ambiente di flusso in particolare, le forze di taglio e di allungamento regolano i cambiamenti conformazionali e potenzialmente la funzione delle biomolecole. Esempi tipici includono lo srotolamento indotto dalla cesoia del DNA lambda e il fattore von Willebrand (VWF). Il DNA Lambda è stato utilizzato come strumento per comprendere le dinamiche conformazionali delle singole catene polimeriche flessibili e la reologia delle soluzioni polimeriche1,2,3,4. VWF è un sensore di flusso naturale che aggrega le piastrine nei siti ferita dei vasi sanguigni con tassi di taglio anomali e modelli di flusso. Lo srotolamento di VWF è essenziale per attivare l'associazione delle piastrine al dominio A1 e il binding del collagene al dominio A3. Inoltre, l'elevata diffusione del dominio A2 indotto dalla cesoia consente la scissione di VWF, che regola la sua distribuzione del peso molecolare in circolazione5,6. Pertanto, la visualizzazione diretta di come queste molecole si comportano sotto il flusso può migliorare notevolmente la nostra comprensione fondamentale della loro biomeccanica e funzione, che a sua volta può consentire nuove applicazioni diagnostiche e terapeutiche.

Le metodologie tipiche per caratterizzare le conformazioni a singola molecola includono pinzette ottiche/magnetiche, microscopia a forza atomica (AFM) e trasferimento di energia a risonanza di rete (FRET)7a singola molecola. La spettroscopia a forza singola è un potente strumento per studiare la forza e il movimento associati ai cambiamenti conformazionali delle biomolecole. Tuttavia, manca la capacità di mappare le conformazioni molecolari complessive8. AFM è in grado di imaging ad alta risoluzione spaziale, ma è limitato nella risoluzione temporale9,10. Inoltre, il contatto tra la punta e il campione può confondere la risposta indotta dal flusso. Altri metodi come FRET e nanoporanalytics determinano gli stati di ripiegamento e dispiegamento delle proteine a singola molecola in base al rilevamento della distanza intramolecolare e dei volumi esclusi. Tuttavia, questi metodi sono ancora nella loro infanzia e limitati nella loro osservazione diretta di conformazioni a singola molecola11,12,13,14.

D'altra parte, osservare direttamente le macromolecole ad alta risoluzione temporale e spaziale nell'ambito della microscopia a fluorescenza ha migliorato la nostra comprensione della dinamica a singola molecola in molti processi biologici15,16. Ad esempio, Fu et al. ha recentemente raggiunto la visualizzazione simultanea dell'allungamento del VWF e del legame del recettore delle piastrine per la prima volta. Nel loro lavoro, le molecole VWF sono state immobilizzate sulla superficie di un canale microfluidico attraverso interazioni biotina-streptavidine e immagini sotto microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) in diversi ambienti di flusso di taglio17. Applicando un metodo simile a quello di Fu, qui dimostriamo che le conformazioni del VWF e del DNA lambda possono essere osservate direttamente sia nella microscopia TIRF che confocale a fluorescenza. Come illustrato nella Figura 1,i dispositivi microfluidici vengono utilizzati per creare e controllare il flusso di taglio e le biomolecole vengono immobilizzate sulla superficie del canale. Al momento dell'applicazione di tassi di taglio variabili, le conformazioni della stessa molecola vengono registrate per misurare la lunghezza dell'estensione, mostrata anche nella Figura 1. Il metodo potrebbe essere ampiamente applicato per esplorare altri comportamenti polimerici in ambienti di flusso complessi per studi reologici e biologici.

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Protocol

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1. Preparazione di VWF

  1. Ricostituire il VWF plasma umano per prepararlo alle reazioni di etichettatura. Aggiungete 100 l'l di acqua deionizzata (DI) a 100 g di VWF liofilizzato per creare una soluzione di stock da 1 mg/mL VWF.
  2. Dialyze Soluzione di stock VWF al fine di rimuovere l'eccesso di glicina, aumentando così l'efficienza di etichettatura della biotina e del fluoroforo.
    1. Trasferire 50 l di VWF in un'unità di dialisi da 0,1 ml con un taglio e guarnizione di peso molecolare di 10.000 unità molecolari. Conservare la soluzione di stock rimanente a -20 gradi centigradi. Lo stock di VWF sarà stabile fino a 1 anno a -20 gradi centigradi.
    2. Eseguire la dialisi in 500 mL di 1x di salina sterile con buffer di fosfato (PBS) (0,01 M disodio fosfato, 0,0018 fosfato monopotassio, 0,0027 Clidrato di potassio, 0,137 M di cloruro di sodio, pH 7,4 a 25 gradi centigradi) Ripetere la dialisi per un'ora aggiuntiva utilizzando 500 mL di PBS fresco.
  3. Iniziare la reazione di etichettatura biotina. Preparare una soluzione da 2 mM di NHS-PEG4-biotin a sciogliendo il solido in acqua DI immediatamente prima della reazione. Consentire a NHS-PEG4-biotina di rimanere in acqua per un tempo prolungato causerà l'idrolizzare il gruppo NHS-ester, riducendo così l'efficienza di etichettatura.
    1. Aggiungete 2,5 ll di 2 mM NHS-PEG4-biotinall all'unità di dialisi contenente la soluzione di stock VWF. Ciò si tradurrà in un eccesso molare di biotina di 20 volte rispetto ai monomeri VWF. Le aree primarie di VWF reagiranno con i gruppi NHS-ester, legandosi in modo covalente ai gruppi peg4-biotin tramite collegamenti intermedi.
    2. Posizionare l'unità di dialisi all'interno di un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Sigillare l'unità di dialisi con il tappo corrispondente. Fissare il gruppo tube-dialisi con Parafilm. Mantenere in posizione verticale e lasciare a temperatura ambiente per 40 min.
  4. Iniziare la reazione di etichettatura del fluoroforo. Preparare una soluzione di 2,8 mM di Alexa 488 tetrafluorophenyl-ester (TFP-ester) colorante fluorescente (eccitazionemax 498 nm,massimo di emissione 519 nm) disrisolvendo il solido fluoroforo nell'acqua DI. Eseguire questa operazione immediatamente prima della reazione per evitare che il gruppo TFP-ester si istitri.
    1. Aggiungere 2,9 litri del fluoroforo di 2,8 mM all'unità di dialisi. Ciò si tradurrà in un eccesso molare di fluoroforo 34 volte rispetto ai monomeri VWF. Le restanti ammine primarie di VWF reagiranno con i gruppi TFP-ester, legandosi in modo covalente ai fluorofori tramite collegamenti a metà.
    2. Aggiungere 2,0 lofan di bicarbonato di sodio da 1 M (sciolto nell'acqua DI) all'unità di dialisi. Questo regola il pH della reazione più vicino a 8.0, che aumenta l'efficienza del TFP-ester e la reazione dell'ammina primaria.
    3. Fissare l'unità di dialisi in un tubo di microcentrifuga proprio come nel passaggio 1.3.2. Conservare al buio per evitare il fotosbiancamento e lasciare a temperatura ambiente per 1 h e 30 min.
  5. Collocare l'unità di dialisi in 900 mL di 1x PBS sterile e dialpare durante la notte a 4 gradi centigradi. Ciò produrrà circa 70 l di VWF etichettato ad una concentrazione di 0,71 mg/mL o 2,84 M (concentrazione di monani).
  6. Trasferire vWF etichettato in un tubo di microcentrismo. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e proteggere dalla luce. Conservare a 4 gradi centigradi. Per lo stoccaggio a lungo termine, aggiungere l'azide di sodio dell'agente antimicrobico a una concentrazione finale dello 0,02% (w/v).
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Preparazione del DNA Lambda

  1. Biotinylate lambda lineare DNA riempiendo i suoi siti finali coesivi (siti cos) con nucleotidi biotina-14-dCTP secondo i protocolli standard, ripetuto qui al passo 2.118. Compilare il resto dei siti cos con nucleotidi dATP, dTTP e dGTP.
    1. Preparare 1 mM di soluzioni di dATP, dTTP, dGTP e biotina-14-dCTP in un buffer di reazione 10x (500 mM di cloruro di sodio, 100 mM di cloruro di Tris, 100 mM di cloruro di magnesio, 10 mM dithiothreitol, pH 7,9 a 25 gradi centigradi).
    2. Mettete 48 lun di 500 ng/L di DNA lambda in un tubo PCR e riscaldate per 5 min a 65 gradi. I siti cos del DNA lambda circolare si separeranno sotto il calore, linearizzando la molecola e rendendo gli sbalzi a filamento singolo pronti per la biotinylazione. Subito dopo, mettere sul ghiaccio per evitare che i siti cos si ri-annealing.
    3. Aggiungete al DNA lambda di 5 ll di 1 mM dATP, dTTP e dGTP e di 4 MM biotina-14-dCTP. Aggiungete anche 2,5 L di 5 frammenti di Klenow U/L (3'à5' exo-) per catalizzare la sintesi del DNA.
    4. Incubare la miscela di reazione per 1 h a 37 .
    5. Aggiungete 1,2 m di EDTA. Quindi riscaldare la miscela di reazione per 5 minuti a 70 gradi centigradi. Questo disattiverà il frammento di Klenow e la reazione biotinylazione.
  2. Rimuovere i nucleotidi in eccesso dal DNA lambda utilizzando una colonna di spin che può contenere 10-70 l e ha un taglio di peso molecolare di 6.000.
    1. Posizionare la colonna all'interno di un tubo di microcentrifuga da 2 mL. Centrifugare la colonna e il tubo a 1000 x g per 2 min. Dispose di flow-through che si raccoglie nel tubo.
    2. Sostituire il buffer di colonna con una soluzione 1x dello stesso buffer di reazione dal passaggio 2.1.1. A tale scopo, aggiungere 500 l- l of 1x buffer alla colonna. Centrifuga per 1 min a 1000 x g. Eliminare il flusso attraverso. Ripetere queste 2 volte in modo che alla colonna sia stato aggiunto un totale di 1500 l.
    3. Collocare la colonna in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere con attenzione la soluzione dal passaggio 2.1.5 allo strato superiore della colonna. Centrifuga per 4 min a 1000 x g.
    4. Raccogliere il flusso attraverso (40-70 l) dal tubo di microcentrifuga e posizionare in un tubo PCR. Questo contiene il DNA lambda purificato e biotinylato.
  3. Etichettare il DNA lambda con colorante fluorescente YOYO-1 (massimoeccitazione - 490 nm,numero massimo di emissioni - 509 nm) secondo i protocolli standard, ripetuto qui nel passaggio 2.3.120.
    1. Preparare una soluzione di coloranti YOYO-1 e DNA lambda con un rapporto molare da coloranti a coppia base di 1:10. Si supponga che nessun DNA sia stato perso nella fase di purificazione per calcolare la concentrazione della coppia di basi del DNA lambda. Il DNA lambda a lunghezza intera ha 48.502 coppie di basi.
      NOTA: Ad esempio, se dal punto 2.2.4 è stato recuperato il valore 50OL della soluzione, aggiungere 7,4 DI YOYO-1.
    2. Riscaldare la soluzione per 2 h a 50 gradi centigradi al buio per completare la reazione.
    3. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e proteggere dalla luce. Conservare a 4 gradi centigradi. La soluzione è ora pronta per essere iniettata in dispositivi microfluidici.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Creazione di stampi di canale microfluidico in wafer di silicio

  1. Utilizzare la fotolitografia per creare canali microfluidici con dimensioni appropriate (Figura 2) su un wafer di silicio master secondo i protocolli standard19.

4. Preparazione del dispositivo microfluidico polidimetilsilàxana (PDMS)

  1. Aggiungere 5 parti in silicone elastomer base a 1 parte agente di polimerità (per massa) in una barca di pesatura. Mescolare accuratamente il contenuto per 1 min per creare una soluzione PDMS pre-curata.
  2. Mettere il wafer di silicio maestro in un piatto di plastica Petri. Versare la soluzione PDMS sul wafer per creare uno strato da 5 mm. Coprire il piatto e lasciare in un desiccatore sotto vuoto per 1 h per rimuovere le bolle d'aria.
  3. Incubato coperto piatto Petri a 60 gradi durante la notte per curare PDMS in un solido flessibile. La cura si tradurrà in canali microfluidici modellati nel PDMS nell'interfaccia PDMS-wafer.
  4. Tagliare rettangoli da 20 x 10 mm nel PDMS, intorno a ogni canale microfluidico, utilizzando un rasoio. Rimuovere i blocchi PDMS rettangolari con una pinzetta.
  5. Utilizzare un ago di estremità smussato da 25 G con spigoli affilati per perforare un foro di 0,5 mm di diametro ad un'estremità del canale, assicurandosi che il foro passi completamente attraverso il blocco PDMS (Figura 2). Utilizzare un ago sottile per perforare PDMS dal foro. Ripetere l'operazione all'altra estremità del canale. Questo creerà un ingresso e presa per il flusso attraverso il canale.
  6. Pulire la superficie del blocco PDMS con nastro adesivo in vinile. Soffiare il gas di azoto compresso su un n. 1 1/2, 22 x 50 mm coverslip per rimuovere i detriti.
  7. Posizionare il blocco PDMS con il lato del canale verso l'alto e il coperchio nella camera di una macchina per il collegamento al plasma. Inizia il trattamento.
  8. Quando il trattamento è completo, posizionare rapidamente il blocco PDMS su un coperchio in modo che il canale sia in contatto con lo slip. Applicare la pressione lungo i bordi del blocco. Posizionare l'assieme coverslip-PDMS su una piastra calda a 115 gradi centigradi per 15 min per rafforzare il legame permanente.
  9. Inserire 10 cm di lunghezza, 0,25 mm di diametro interno tubing nel foro di uscita nella parte superiore del blocco PDMS. Ciò consente al fluido di fluire facilmente fuori dal canale. Il dispositivo è ora completo.

5. Trattamento della superficie del dispositivo microfluidico

  1. Iniettare l'albumina del siero bovino (BSA-biotin) disciolto nello sterile 1x PBS nell'insediazione del dispositivo microfluidico per gli esperimenti VWF. Iniettare <10 - L di 1 mg/mL BSA-biotin per esperimenti sul DNA lambda. Trattenere alcuni microlitri di BSA-biotina nella punta della pipetta dopo l'iniezione e lasciare che la punta rimanga incorporata nell'inseridio.
    1. Tenere sempre una goccia d'acqua DI intorno alla punta. Ciò impedirà alle bolle d'aria di entrare nel canale. Applicare questa tecnica ogni volta che una nuova soluzione viene iniettata nel canale.
    2. Lasciare incubare BSA-biotina nel dispositivo per 2 h. La BSA non si legherà in modo specifico alla superficie coverslip (Figura 3A).
  2. Rimuovere la punta della pipetta. Iniettare <10 - L di casocarina soluzione di blocco nel canale e lasciarlo incubare per 30 min. La caseina bloccherà eventuali siti liberi, riducendo il legame non specifico di biomolecole alla superficie (Figura 3B).
  3. Rimuovere la punta e iniettare <10 - L of 10 g/mL streptavidin disciolto in sterile 1x PBS nel canale per gli esperimenti VWF. Utilizzare 100 streptavidina di g/mL per gli esperimenti sul DNA lambda. Incubare per 10 min. La streptavidina si legherà ai gruppi di biotina della BSA-biotina (Figura 3C).
  4. Rimuovere la punta e iniettare <10 - L of 1x detergente (0.05% Tween 20 in PBS) nel canale per lavare via lo streptavidino in eccesso.
  5. Rimuovere la punta e iniettare <10 - L di VWF da 28,4 nM diluito nella soluzione caseina o DNA lambda dal passaggio 2.3.3. Incubare VWF per 3 min. Incubare il DNA lambda per 45 min (Figura 3D).
  6. Rimuovere la mancia e iniettare <10 - L di biotina libera da 5 mM diluita in soluzione caseina. La biotina gratuita bloccherà i siti di legame della streptavidina in eccesso sulla superficie del canale (Figura 3E).

6. Visualizzazione del DNA VWF e Lambda in microscopia a fluorescenza

  1. Preparare 1 mL di soluzione di blocco della caseina con 2,2 mM di acido protocatechuic e 37 nM protocatechuate-3,4-diossigenasi (per ridurre al minimo il fotobleaching). Caricare in una siringa e fissare in una pompa di siringa. Prendere 30 cm di lunghezza, 0,25 mm di diametro interno tubi e collegare un'estremità all'ago della siringa. Flusso nella soluzione per rimuovere le bolle d'aria. Attaccare l'altra estremità del tubo all'inserimento del dispositivo microfluidico. Si consiglia di farlo 3 minuti dopo il passaggio 5.6.
  2. Selezionare l'obiettivo di ingrandimento più alto (ad esempio, 60-100X) di una riflessione interna totale (TIRF) o al microscopio a fluorescenza confocale. Aggiungere una goccia di olio di immersione sul suo obiettivo, se necessario. Posizionare il dispositivo microfluidico sullo stadio del microscopio in modo che il coperchio sia a filo con l'obiettivo.
  3. Avviare la microscopia del campo luminoso. Regolare la messa a fuoco in modo che tutte le funzioni, come detriti e bolle, siano visibili. Quindi regolare lo stage nella direzione X e Y fino a quando il bordo del canale microfluidico è visibile e seziona il fotogramma.
  4. Passare al canale 488 (FITC). Regolare il livello di z e l'angolo TIRF in base alle esigenze fino a quando non si possono distinguere singole molecole verdi e globulari. Si tratta di molecole di DNA VWF o lambda.
  5. Regola il tempo di esposizione e l'intensità del laser per visualizzare le molecole fluorescenti senza fotoblilare troppo rapidamente. Regolare il contrasto per visualizzare le molecole in modo più chiaro.
  6. Avviare il flusso dalla pompa della siringa in modo che la caseina di blocco della soluzione scorra nel canale e fuori dalla presa. Eseguire questa operazione esattamente 5 minuti dopo il passaggio 5.6. Arrestare e avviare il flusso per osservare i cambiamenti nella conformazione delle molecole. Quando si applica il flusso, utilizzare velocità comprese tra 5.000 e 30.000 l/h. Ripetere questo in varie aree del dispositivo microfluidico. Continuare questo processo per individuare le molecole che possono estendere e rilassarsi su più cicli di arresto e di flusso di partenza.
  7. Notare quanto tempo ci vuole perché le molecole raggiungano la massima estensione e si rilassino completamente nei globuli. Registra video del comportamento continuo delle molecole sotto il flusso di taglio, selezionando il miglior tempo di esposizione, la frequenza di esposizione e la durata del video che cattureranno l'intera gamma di comportamenti estensioni e ridurranno al minimo il fotosbiancamento.
  8. Salvare i video con nome . File AVI con una barra della scala.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

7. Analisi dell'immagine dei cambiamenti conformazionali

  1. Calcolare la velocitàfigure-protocol-1di taglio della parete ( ) applicata alle macromolecole utilizzando la portata (Q) e l'altezza (h) e la larghezza (w) del canale microfluidico rettangolare. Per eseguire questa operazione, utilizzare l'equazione seguente:
    figure-protocol-2
  2. Determinare la lunghezza di qualsiasi biomolecola in vari tassi di taglio utilizzando un codice MATLAB personalizzato (vedere File supplementari). Creare un'analisi dei video con titolo cartella che includa i seguenti codici MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m e get_length.fig. Creare una sottocartella all'interno di video di analisi intitolata video e aggiungere . file AVI da analizzare in esso.
  3. Aprire main.m utilizzando MATLAB 2019a ed eseguire il codice. Digitare il nome del file video da analizzare nella finestra di comando in Immettere il file di dati da analizzare:.
  4. Nell'interfaccia utente grafica aperta (GUI), impostare la soglia (testo nella casella in alto a destra della finestra) a 20 e fare clic sul pulsante Imposta soglia per confermare.
  5. Usa il cursore dati nella barra degli strumenti superiore della finestra per scegliere un pixel in un punto qualsiasi della barra della scala. Fare clic su Punto iniziale nella sezione Barra della scala a destra della finestra. La posizione (x,y) del pixel scelto apparirà a destra del pulsante. Fare clic sul pulsante Dimensione pixel (m). Le dimensioni in pixel devono essere misurate una sola volta in ogni video.
  6. Scegli qualsiasi pixel sulla molecola di interesse. Fare clic su Punto iniziale nella sezione VWF. Dopo che la posizione del pixel scelto appare sulla casella di testo a destra, fare clic su Estremità sinistra, Fine destra e Lunghezza stringa per ottenere la lunghezza molecolare nell'immagine.
    NOTA: questo passaggio può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti conformazionali di qualsiasi biomolecola, nonostante il codice abbia una sezione specifica denominata VWF.
  7. Controllare due volte l'estremità sinistra e destra della molecola. Eseguire lo zoom avanti e utilizzare il cursore dati per verificare la posizione in pixel di interesse. Scegliere manualmente il pixel come fine e ricalcolare la lunghezza (in pixel) quando necessario.
  8. Registrate la dimensione in pixel in formato m e lunghezza della stringa in numero di pixel in un foglio di Excel e calcolate la lunghezza della stringa in m.
  9. Ripetere i passaggi precedenti per ogni immagine. Usa ultimo, Successivo nell'angolo in basso a destra della GUI per passare da un'immagine all'altra nello stesso file video. Fare clic su Chiudi per chiudere la finestra GUI.

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Results

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Osservare il comportamento dinamico di biomolecole come VWF e DNA lambda dipende fortemente dall'ottimizzazione del loro legame alla superficie del dispositivo. L'incubazione di trattamenti superficiali per i tempi raccomandati nel dispositivo microfluidico è fondamentale per ottenere il legame con alcuni punti di ancoraggio, in modo che le molecole possano estendere liberamente e rilassarsi al momento del flusso mutevole. Se le proteine o il DNA sono legati troppo fortemente con più collegamenti, si estenderanno a lungh...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per ottenere dati di alta qualità dei cambiamenti conformazionali a singola molecola utilizzando la microscopia a fluorescenza come descritto in questo metodo, è fondamentale incubare la molecola per la quantità di tempo appropriato, ridurre al minimo le sue interazioni non specifiche con la superficie e definire le impostazioni del microscopio che riducono il fotosbiancamento. La capacità della molecola di cambiare liberamente la conformazione è correlata al numero di interazioni biotina-streptavidina formate tra la mol...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della National Science Foundation DMS-1463234, National Institutes of Health grants HL082808 e AI133634, e finanziamenti interni della Lehigh University.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 Kit di etichettaturaInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Colonne in gelBio-Rad7326221
BiotinaSigma-AldrichB4501Utilizzare come biotina libera nel passaggio 5.6
Biotina-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinaSigma-AldrichA8549
Vetrini coprioggettiVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP SetInvitrogen10297018
Boe galleggianti per mini dispositivo di dialisiThermo Scientific69588
Frammento di Klenow (3'→ 5' exo-)New England BioLabsM0212SUtilizzare per il tampone di reazione 10X nella fase 2.1.1 e il tampone di reazione 1X nella fase 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Mini dispositivo per dialisiThermo Scientific6957010K MWCO, volume 0,1 mL
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protocatechuate 3,4-DiossigenasiSigma-AldrichP8279
Acido protocatechicoSanta Cruz Biotechnologysc-205818
Kit di elastomeri siliconici per la fabbricazione di PDMSThe Dow Chemical Company4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
La soluzione di bloccoCANDOR Bioscience110 050Utilizzare come soluzione bloccante la caseina in tutto il protocollo
Nastro per camera bianca in vinileFisher Scientific19-120-3217
von Willebrand Factor, Human PlasmaMillipore Sigma681300
YOYO-1 ColoranteAAT Bioquest17580
Tubo con diametro interno di 0,25 mmCole-ParmerEW-06419-00
Ago da 25 gaugeThomas ScientificJG2505X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

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