Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Summary

Presentiamo un protocollo per l'immobilizzazione di singole macromolecole in dispositivi microfluidici e la quantificazione dei cambiamenti nelle loro conformazioni sotto il flusso di taglio. Questo protocollo è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche e funzionali di biomolecole come proteine e DNA in un ambiente di flusso.

Abstract

Il comportamento di una singola molecola in perturbazione meccanica è stato ampiamente caratterizzato per comprendere molti processi biologici. Tuttavia, metodi come la microscopia a forza atomica hanno una risoluzione temporale limitata, mentre il trasferimento di energia a risonanza del Fàrster (FRET) consente solo di dedurre le conformazioni. La microscopia a fluorescenza, d'altra parte, consente la visualizzazione in tempo reale in situ di singole molecole in varie condizioni di flusso. Il nostro protocollo descrive i passaggi per catturare i cambiamenti conformazionali di singole biomolecole in diversi ambienti di flusso di taglio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Il flusso di taglio viene creato all'interno di canali microfluidici e controllato da una pompa di siringa. Come dimostrazioni del metodo, il fattore von Willebrand (VWF) e il DNA lambda sono etichettati con biotina e fluoroforo e quindi immobilizzati sulla superficie del canale. Le loro conformazioni sono continuamente monitorate sotto flusso di taglio variabile utilizzando la riflessione interna totale (TIRF) e la microscopia a fluorescenza confocale. Le dinamiche reversibili di svelamento di VWF sono utili per comprendere come la sua funzione è regolata nel sangue umano, mentre la conformazione del DNA lambda offre approfondimenti sulla biofisica delle macromolecole. Il protocollo può anche essere ampiamente applicato per studiare il comportamento dei polimeri, in particolare dei biopolimeri, in condizioni di flusso variabili e per studiare la reologia dei fluidi complessi.

Introduction

Sono stati ampiamente studiati i meccanismi di risposta alle biomolecole agli stimoli ambientali. In un ambiente di flusso in particolare, le forze di taglio e di allungamento regolano i cambiamenti conformazionali e potenzialmente la funzione delle biomolecole. Esempi tipici includono lo srotolamento indotto dalla cesoia del DNA lambda e il fattore von Willebrand (VWF). Il DNA Lambda è stato utilizzato come strumento per comprendere le dinamiche conformazionali delle singole catene polimeriche flessibili e la reologia delle soluzioni polimeriche^1,2,3,

Protocol

1. Preparazione di VWF

1. Ricostituire il VWF plasma umano per prepararlo alle reazioni di etichettatura. Aggiungete 100 l'l di acqua deionizzata (DI) a 100 g di VWF liofilizzato per creare una soluzione di stock da 1 mg/mL VWF.
2. Dialyze Soluzione di stock VWF al fine di rimuovere l'eccesso di glicina, aumentando così l'efficienza di etichettatura della biotina e del fluoroforo.
   1. Trasferire 50 l di VWF in un'unità di dialisi da 0,1 ml con un taglio e guarnizione di peso molecolare di 10.000 unità molecolari. Conservare la soluzione di stock rimanente a -20 gradi centigradi. Lo stock di VWF sarà stabile fino a 1 anno a -20 gradi centigradi.
   ....

Results

Osservare il comportamento dinamico di biomolecole come VWF e DNA lambda dipende fortemente dall'ottimizzazione del loro legame alla superficie del dispositivo. L'incubazione di trattamenti superficiali per i tempi raccomandati nel dispositivo microfluidico è fondamentale per ottenere il legame con alcuni punti di ancoraggio, in modo che le molecole possano estendere liberamente e rilassarsi al momento del flusso mutevole. Se le proteine o il DNA sono legati troppo fortemente con più collegamenti, si estenderanno a lungh.......

Discussion

Per ottenere dati di alta qualità dei cambiamenti conformazionali a singola molecola utilizzando la microscopia a fluorescenza come descritto in questo metodo, è fondamentale incubare la molecola per la quantità di tempo appropriato, ridurre al minimo le sue interazioni non specifiche con la superficie e definire le impostazioni del microscopio che riducono il fotosbiancamento. La capacità della molecola di cambiare liberamente la conformazione è correlata al numero di interazioni biotina-streptavidina formate tra la mol.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Kit di etichettatura	Invitrogen	A30006
Bio-Spin P-6 Colonne in gel	Bio-Rad	7326221
Biotina	Sigma-Aldrich	B4501	Utilizzare come biotina libera nel passaggio 5.6
Biotina-14-dCTP	AAT Bioquest	17019
BSA-Biotina	Sigma-Aldrich	A8549
Vetrini coprioggetti	VWR	48393-195	No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set	Invitrogen	10297018
Boe galleggianti per mini dispositivo di dialisi	Thermo Scientific	69588
Frammento di Klenow (3'→ 5' exo-)	New England BioLabs	M0212S	Utilizzare per il tampone di reazione 10X nella fase 2.1.1 e il tampone di reazione 1X nella fase 2.2.2
Lambda DNA	New England BioLabs	N3011S
Mini dispositivo per dialisi	Thermo Scientific	69570	10K MWCO, volume 0,1 mL
NEBuffer 4	New England BioLabs	B7004S
NHS-PEG4-Biotin	Thermo Scientific	21330
Protocatechuate 3,4-Diossigenasi	Sigma-Aldrich	P8279
Acido protocatechico	Santa Cruz Biotechnology	sc-205818
Kit di elastomeri siliconici per la fabbricazione di PDMS	The Dow Chemical Company	4019862
Streptavidin	Sigma-Aldrich	85878
La soluzione di blocco	CANDOR Bioscience	110 050	Utilizzare come soluzione bloccante la caseina in tutto il protocollo
Nastro per camera bianca in vinile	Fisher Scientific	19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma	Millipore Sigma	681300
YOYO-1 Colorante	AAT Bioquest	17580
Tubo con diametro interno di 0,25 mm	Cole-Parmer	EW-06419-00
Ago da 25 gauge	Thomas Scientific	JG2505X