LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per montare larve di Drosophila per ottenere più di 10 h di immagini ininterrotte intime in animali vivi intatti. Questo metodo può essere utilizzato per immaginare molti processi biologici vicino alla parete del corpo larvale.

Abstract

L'imaging dal vivo è un approccio prezioso per studiare le domande sulla biologia cellulare. La larva della Drosophila è particolarmente adatta per l'imaging vivo in vivo perché la parete larvale del corpo e la maggior parte degli organi interni sono trasparenti. Tuttavia, l'imaging live continuo di larve di Drosophila intatte per più di 30 min è stato impegnativo perché è difficile immobilizzare le larve per lungo tempo. Qui presentiamo un metodo di montaggio larvale chiamato LarvaSPA che consente l'imaging continuo di larve di Drosophila vive con alta risoluzione temporale e spaziale per più di 10 ore. Questo metodo prevede l'attaccamento parziale delle larve al coperchio utilizzando una colla UV-reattiva e inoltre un movimento larvale che trattiene utilizzando un blocco polidimetilsiloxane (PDMS). Questo metodo è compatibile con le larve in fase di sviluppo dal secondo instar al terzo instar errante. Dimostriamo l'applicazione di questo metodo nello studio dei processi dinamici dei neuroni somatosensoriali della Drosophila, tra cui la crescita dei dendrite e la degenerazione dei dendriti indotta da lesioni. Questo metodo può essere applicato anche per studiare molti altri processi cellulari che avvengono vicino alla parete del corpo larvale.

Introduzione

L'imaging live time-lapse è un metodo potente per studiare i processi cellulari dinamici. Le informazioni spaziali e temporali fornite dai filmati time-lapse possono rivelare dettagli importanti per rispondere alle domande della biologia cellulare. La larva della Drosophila è stata un modello in vivo diffuso per le indagini utilizzando l'imaging dal vivo perché la sua parete del corpo trasparente consente l'imaging non invasivo delle strutture interne^1,2. Inoltre, in Drosophila sono disponibili numerosi strumenti genetici per etichettare fluorescentmente strutture anatomiche e macromolecole

Protocollo

1. Fare la camera di imaging

1. Il telaio in metallo può essere costruito da un blocco di alluminio in un tipico negozio di macchine. Le specifiche del telaio sono illustrate nella Figura 1A.
2. Per costruire la camera di imaging, sigillare la parte inferiore del telaio metallico utilizzando un long coverslip (22 mm x 50 mm) e colla UV (Figura 1A). Curare la colla UV utilizzando una lampada UV portatile.

2. Realizzazione di cuboidi PDMS

1. Preparare lo stampo per i cuboidi PDMS.
   1. Fissare strati di nastro da imballa....

Risultati

La camera di imaging della larva è costruita incollando un telaio metallico su misura e due copricoperture insieme. La progettazione del telaio metallico è specificata nella Figura 1A. Le larve di drosophila all'interno della camera sono aderitate alla coverslip superiore con l'aiuto di colla UV e cuboidi PDMS. La scanalatura sul cuboide PDMS e il nastro a due lati del cuboide è attaccato per creare lo spazio per contenere le larve (Figura 1B,C).......

Discussione

Qui descriviamo LarvaSPA, un metodo versatile per montare larve di Drosophila vive per l'imaging time-lapse a lungo termine. Questo metodo non richiede il recupero o il rimontaggio delle larve, consentendo l'imaging ininterrotto. È quindi ideale per tracciare i processi biologici che richiedono ore per essere completati, come la degenerazione e la rigenerazione dei dendriti. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'imaging di dinamiche intracellulari del calcio ed eventi subcellulari come la crescita di m.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
6061 Barre in alluminio	McMaster-Carr	9246K421
Nastro biadesivo 3M	Ted Pella, Inc.	16093
Nastro da imballaggio 3M Scotch	3M		1,88 "L x 22,2 iarde
DUMONT # 3 Pinze	Fisher Scientific	50-241-34
Vetrino coprioggetti in vetro	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Microscopio confocale Leica		Leica SP8 dotato di un risonante scanner
Carta per lenti	Berkshire	LN90.0406.24
Piastre di Petri (medie)	VWR	25373-085
Piastre di Petri (piccole)	VWR	10799-192
Lama di rasoio	Ted Pella, Inc.	121-20
Piastra di Petri rettangolare	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (kit PBMS)	Microscopia elettronica Sciences	24236-10
Pipetta di trasferimento	Thermo Fisher Scientific	1371126
colla UV	Norland products	#6106, NOA 61	Indice di rifrazione 1.56
Lampada UV (Workstar 2003)	Maxxeon
essiccatore sottovuoto	Microscopia elettronica Scienze	71232
salviette	Kimberly-Clark	Kimwipes