LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine

L'imaging live time-lapse è un metodo potente per studiare i processi cellulari dinamici. Le informazioni spaziali e temporali fornite dai filmati time-lapse possono rivelare dettagli importanti per rispondere alle domande della biologia cellulare. La larva della Drosophila è stata un modello in vivo diffuso per le indagini utilizzando l'imaging dal vivo perché la sua parete del corpo trasparente consente l'imaging non invasivo delle strutture interne^1,2. Inoltre, in Drosophila sono disponibili numerosi strumenti genetici per etichettare fluorescentmente strutture anatomiche e macromolecole³. Tuttavia, l'imaging a lungo termine delle larve della Drosophila è impegnativo. A differenza degli embrioni precoci stazionari o delle pupe, le larve di Drosophila si muovono costantemente, rendendo necessaria l'immobilizzazione per l'imaging dal vivo. Modi efficaci di immobilizzare le larve di Drosophila vive includono il montaggio in olio di alocarbonio con cloroformio⁴, anestesizzando utilizzando la soluzione isoflurane o Dichlorvos⁵, e la compressione tra il coperchio e il microscopio⁶. Anche se alcuni di questi metodi sono stati utilizzati per la microscopia, nessuno di essi è efficace per l'imaging dal vivo a lungo termine. Altri metodi sono stati sviluppati per l'imaging di neuroni della parete del corpo nelle larve striscianti utilizzando la microscopia confocale convenzionale o la microscopia a fogli di luce^7,8^,9. Tuttavia, questi metodi non sono ideali per monitorare la dinamica cellulare a causa del movimento delle larve.

Sono stati sviluppati nuovi metodi per ottenere l'imaging a lungo termine delle larve della Drosophila. Utilizzando un "chip larva" polidimetilsiloxane (PDMS), le larve di Drosophila possono essere efficacemente immobilizzate attraverso un'aspirazione generata dal vuoto in una microcamera specializzata senza anestesizzazione. Tuttavia, questo metodo non offre alta risoluzione temporale per gli studi di biologia cellulare e ha severe limitazioni sulla dimensione animale¹⁰. Un altro metodo che utilizza un dispositivo di anestesizzazione ha raggiunto l'imaging dal vivo delle larve di Drosophila in più punti temporali ed è stato applicato per studiare giunzioni neuromuscolari^11,12,13,14^,15,16. Tuttavia, questo metodo inoltre non consente l'imaging continuo per più di 30 min e richiede l'uso di desflurane ripetutamente, che può inibire l'attività neurale e influenzare il processo biologico studiato^17,18. Recentemente, un nuovo metodo che combina dispositivo microfluidico e crioanestesia è stato utilizzato per immobilizzare larve di varie dimensioni per brevi periodi di tempo (minuti)¹⁹. Tuttavia, questo metodo richiede dispositivi specializzati come un sistema di raffreddamento e lunghi periodi di immobilizzazione richiedono il raffreddamento ripetuto delle larve.

Qui presentiamo un metodo versatile per immobilizzare le larve di Drosophila che è compatibile con l'imaging time-lapse ininterrotto per più di 10 h. Questo metodo, che chiamiamo "Stabilizzazione larva per attaccamento parziale" (LarvaSPA), prevede l'adesione della cuticola larvale a un coperchio per l'imaging in una camera di imaging costruita su misura. Questo protocollo descrive come fare la camera di imaging e come montare le larve in una varietà di stadi di sviluppo. Nel metodo LarvaSPA, i segmenti del corpo desiderati vengono apposti sul coperchio utilizzando una colla UV-reattiva. Un cuboide PDMS applica inoltre pressione alle larve, impedendo la fuga. L'aria e l'umidità nella camera di imaging assicurano la sopravvivenza delle larve parzialmente immobilizzate durante l'imaging. I vantaggi di LarvaSPA rispetto ad altre tecniche includono quanto segue: (1) È il primo metodo che consente l'imaging dal vivo continuo di larve di Drosophila intatte per ore ad alta risoluzione temporale e spaziale; (2) Il metodo ha meno limitazioni sulle dimensioni della larva; (3) La camera di imaging e i cuboidi PDMS possono essere fabbricati ad un costo minimo e sono riutilizzabili.

Oltre a descrivere il metodo di montaggio larvale, forniamo diversi esempi della sua applicazione per studiare lo sviluppo dei dendriti e la degenerazione dei dendrite dei neuroni dell'arborizzazione dendritica (da) della Drosophila.

1. Fare la camera di imaging

1. Il telaio in metallo può essere costruito da un blocco di alluminio in un tipico negozio di macchine. Le specifiche del telaio sono illustrate nella Figura 1A.
2. Per costruire la camera di imaging, sigillare la parte inferiore del telaio metallico utilizzando un long coverslip (22 mm x 50 mm) e colla UV (Figura 1A). Curare la colla UV utilizzando una lampada UV portatile.

2. Realizzazione di cuboidi PDMS

1. Preparare lo stampo per i cuboidi PDMS.
   1. Fissare strati di nastro da imballaggio alla superficie interna di una piastra di Petri rettangolare (80 mm x 55 mm) o di una piastra di coltura a cellule rotonde. Utilizzare uno strato (spesso 0,063 mm) per le larve a stella seconda, 2 strati (0,126 mm di spessore) per le prime larve della terza stella o tre strati (spesso0,189 mm) per larve della terza stella(Figura 1B).
   2. Tagliare il nastro in strisce di larghezza specifica con una lama da rasoio: 1,5 mm per il nastro a 1 strato e 2 mm per nastro a 2 strati o 3 strati. La larghezza e lo spessore della striscia determineranno la dimensione delle larve che il cuboide PDMS finale può contenere. Lasciare almeno uno spazio di 5 mm tra le due strisce. Rimuovere gli strati del nastro che coprono lo spazio (Figura 1B).
   3. Rimuovere la polvere dalla superficie interna della piastra utilizzando il nastro adesivo. Lo stampo è pronto per l'uso.
2. Preparare il mix PDMS.
   1. Mescolare 7 g di base PDMS e 0,7 g di agente di polimerità (rapporto 10:1) accuratamente in un piccolo contenitore.
   2. Mettere il contenitore in un desiccatore sottovuoto per almeno 15 min per rimuovere l'aria dalla miscela.
   3. Versare lentamente circa 5,5 g di miscela PDMS sullo stampo per raggiungere uno spessore di 1–2 mm (Figura 1B).
   4. Mettere nuovamente la miscela PDMS nel desiccatore sottovuoto per almeno 15 minuti per rimuovere le bolle d'aria rimanenti dalla miscela. Rompere le ultime bolle con una punta pipetta.
   5. Curare il PDMS su una superficie piana in un'incubatrice di calore a 65 gradi centigradi per 2 ore.
   6. Utilizzare una lama di rasoio per allentare il PDMS curato lungo il bordo dello stampo e staccarlo dallo stampo. Conservare il PDMS tra due pezzi di grande nastro adesivo a temperatura ambiente.
   7. Per le larve a stella presto e tardiva, tagliare il PDMS in cuboidi 8 mm x 2 mm x 1 mm (lungo le linee tratteggiate nella Figura 1B) posizionando la scanalatura creata dalla striscia di nastro (passaggio 2.1.2) al centro del lato lungo del cuboide (Figura 1B,C). Per le seconde larve instar, tagliare il cuboide a 8 mm x 1 mm x 1 mm.

3. Larve di montaggio per l'imaging time-lapse a lungo termine

1. Preparare il coperchio superiore per il montaggio.
   1. Scegli sei cuboidi PDMS con scanalature corrispondenti alle dimensioni delle larve. Seguire la scanalatura e le dimensioni consigliate di PDMS in base ai passaggi 2.1.1, 2.1.2 e 2.2.7.
   2. Rimuovere la polvere dalla superficie del PDMS con nastro adesivo.
   3. Attaccare quattro pezzi di nastro a doppia lato (12 mm x 5 mm) su un long coverslip (22 mm x 50 mm) per fissare i cuboidi PDMS in un secondo momento. Gli spazi tra i due pezzi di nastro a doppio lato devono essere uguali alla larghezza della scanalatura PDMS.
   4. Applicare una piccola goccia di colla UV nella scanalatura di ogni cuboide PDMS e aggiungere sei piccole gocce di colla UV nello spazio tra il nastro a due lati sulla copertina.
2. Preparare le larve per il montaggio.
   1. Utilizzando un paio di pinze, pulire le larve in acqua per rimuovere il cibo dalla superficie del corpo.
   2. Posizionare le larve pulite su un piccolo pezzo di carta velina inumidita in un piccolo piatto petri (35 mm) senza coperchio. Mettere il piccolo piatto Petri in un grande piatto Petri (60 mm) contenente un pezzo di carta velina secca. In un cappuccio chimico, applicare 8-12 gocce (160-240) di isoflurane sulla carta velina secca utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica e chiudere il coperchio del grande piatto Petri.
   3. Attendere 2-3 min durante il monitoraggio delle larve. Estrarre le larve dal grande piatto Petri una volta che la bocca si aggancia smette di muoversi.
3. Montare gli animali.
   1. Per immaginare strutture sul lato dell'animale, posizionare le larve immobilizzate sulla colla UV tra il nastro a due lati sulla coverslip con la cuticola dorsale rivolta verso la coverslip dorsale.
   2. Coprire ogni larva con un blocco PDMS e inserire il tronco della larva nella scanalatura del PDMS. Lasciare la testa e la coda della larva all'esterno della scanalatura PDMS. Evitare di bloccare gli spiracoli della larva dalla colla.
   3. Premere verso il basso sulle estremità del blocco PDMS sul nastro fronte/retro senza applicare la forza sulla scanalatura. Tirare delicatamente sulla coda della larva per appiattire la cuticola sotto la PDMS.
   4. Curare la colla UV per 4 min utilizzando una lampada UV portatile all'altezza (a circa 0,07 mW/mm²).
      AVVISO: Proteggere gli occhi con occhiali di sicurezza durante l'utilizzo della lampada UV.
   5. Capovolgere la coverslip a testa in giù e ripetere il passaggio 3.3.4.
   6. Inumidire un piccolo pezzo di carta lente (15 mm x 30 mm) con 20-L-30 l'acqua. Posizionare la carta lente inumidita nella parte inferiore della camera di imaging(Figura 1A,D).
   7. Posizionare il coperchio sulla camera in modo che le larve siano rivolte verso l'interno della camera. Aderire entrambe le estremità del coperchio alla superficie metallica utilizzando colla UV (Figura 1A,D). Il lato dorsale delle larve è pronto per l'imaging al microscopio confocale (Figura 1E).

4. Imaging

1. Larve di immagine con un microscopio appropriato. Tutti i risultati illustrati in questo protocollo (Figura 2, Figura 3, Video S2, Video S3e Video S4) sono stati acquisiti utilizzando un sistema confocale con un obiettivo di olio 40x (1.30 NA).

5. Recupero della camera di imaging e dei cuboidi PDMS

1. Dopo l'imaging, rimuovere l'olio sul coperchio superiore utilizzando una carta lente. Staccare il coperchio superiore dal telaio metallico tagliando nello spazio tra il coperchio e il telaio metallico con una lama di rasoio. La camera di imaging è pronta per il riutilizzo.
2. Scollegare i cuboidi PDMS dalla vessilla superiore con pinze. Arrotolare i cuboidi PDMS su nastro adesivo per rimuovere residui di colla e polvere. I cuboidi PDMS sono pronti per il riutilizzo.

La camera di imaging della larva è costruita incollando un telaio metallico su misura e due copricoperture insieme. La progettazione del telaio metallico è specificata nella Figura 1A. Le larve di drosophila all'interno della camera sono aderitate alla coverslip superiore con l'aiuto di colla UV e cuboidi PDMS. La scanalatura sul cuboide PDMS e il nastro a due lati del cuboide è attaccato per creare lo spazio per contenere le larve (Figura 1B,C). Il PDMS applica anche una leggera pressione per appiattire la parete larvale del corpo e limitare fisicamente il movimento larvale. Infine, un piccolo pezzo di carta per lenti bagnate viene posizionato nella parte inferiore della camera per fornire umidità. Questa configurazione può immobilizzare le larve di Drosophila per più di 10 h per l'imaging continuo. La maggior parte degli animali sono vivi dopo 10 h e possono essere recuperati per crescere nella fase pupa. La camera di imaging può ospitare fino a nove larve contemporaneamente. La figura 1D mostra sei larve a stella della terza parte montate nella camera. I tronchi delle larve sono fissi mentre la testa e la coda sono libere di muoversi (Figura 1E e Video S1). Questo metodo è stato utilizzato con successo per immaginare la seconda stella per vagare larve della terza stella con immagini continue ad alta risoluzione fino a 15 h. La camera è progettata per l'imaging utilizzando microscopi eretti, ma la configurazione funziona anche per i microscopi invertiti semplicemente capovolgendo la camera.

Qui dimostriamo l'applicazione di LarvaSPA nello studio della dinamica neuronale del dendrite e della degenerazione dei dendriti utilizzando i neuroni di classe IV da (C4 da) come modello (Figura 2, Figura 3, Video S2–S4). I neuroni C4 da sono nocicettori somatosensoriali situati sulla parete larvale del corpo, i cui dendriti innervano l'epidermide larvale1,20,21,22. C4 da dendrites mostrano comportamenti di crescita altamente dinamici in tutto lo sviluppo larvale, con conseguente copertura completa della superficie del corpo o spazio-riempimento23. C4 da neuroni sono stati utilizzati con successo anche per studiare la degenerazione e la rigenerazione dei dendriti dopo lesioni fisiche24,25,26,27.

Per l'imaging della dinamica della dendrite, le larve che vanno da 48 h dopo la deposizione delle uova (AEL) al secondo instar a 120 h AEL a cavallo terzo instar sono state montate nella camera di imaging per l'imaging time-lapse utilizzando la microscopia confocale a scansione punti. I filmati time-lapse sono stati ripresi con un intervallo di 3 minuti per catturare i comportamenti di crescita di C4 da dendrites etichettati da ppk-CD4-tdTom o UAS-CD4-tdTom guidati da ppk-Gal46. Durante tutto il periodo di imaging (fino a 12 h), i rami dendrite di alto ordine dei neuroni C4 da hanno mostrato comportamenti di crescita complessi, tra cui estensione, ritrazione, formazione di rami ed eliminazione di rami (Figura 2A–2F), che indicano la salute dei neuroni. I nostri film anche catturato repulsioni omotipipico dendro-dendrite in cui punte dendrite ritratta dopo aver contattato altri dendriti (Figura 2F). Nel complesso, questi risultati dimostrano che l'imaging time-lapse utilizzando LarvaSPA è efficace per studiare il neurosviluppo.

Per immagini degenerazione dendrite, abbiamo usato un laser MaiTai per recidere i dendriti primari vicino ai corpi cellulari C4 da neuronali. Le larve sono state recuperate e montate nella camera per l'imaging a partire da 1,5 h dopo un infortunio (AI) (Figura 3, Video S4). I filmati hanno registrato eventi chiave durante la degenerazione dei dendrite, tra cui gonfiore dei dendriti, frammentazione dei dendriti e la distanza dei detriti di dendrite. Nello stesso esperimento, il corpo grasso larvale è stato anche progettato per secernere Annexin V-GFP (AV-GFP), un sensore che etichetta la fosfadiatidirice (PS) esternalizzata sulla superficie cellulare27. Abbiamo osservato un'etichettatura specifica dei dendriti degeneranti di AV-GFP (Figura 3), suggerendo che PS è stato esposto sulla superficie di dendriti degeneranti per servire come un segnale eat-me per la successiva liquidazione da fagocitosi27.

Figura 1: La camera di imaging per il montaggio di LarvaSPA. (A) Diagrammi della camera di imaging con specifiche dettagliate, che mostrano sia la vista superiore che la vista laterale. L'ombreggiatura azzurra nella vista superiore indica la carta lente inumidita. La camera è sigillata da un coperchio superiore e da un coperchio inferiore. La posizione di una larva montata è illustrata. (B) Diagrammi dello stampo PDMS (vista superiore) e dello stampo dopo il riempimento con la miscela PDMS (vista laterale). Le strisce in grigio indicano due strisce a 1 strato, due a 2 strati e due strisce a nastro a 3 strati, rispettivamente. L'ombreggiatura gialla nella vista laterale indica la miscela PDMS nello stampo. Le linee tratteggiate indicano dove tagliare il PDMS curato. La vista laterale del diagramma non viene disegnata in scala. (C) Fotografie che mostrano una vista dall'alto e una vista laterale di un cuboide PDMS. Barra di scala - 1 mm.(D) Fotografie che mostrano una camera di imaging prima del montaggio, e una camera di imaging con sei larve di Tardo terzo nella stella Drosophila immobilizzate montate sul lato dorsale verso l'alto. Barra di scala - 10 mm. (E) Una vista più ravvicinata di una larva in (D). Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagine time-lapse delle dinamiche dei dendriti. (A-F) Fotogrammi selezionati da filmati time-lapse di classe IV da neuroni dendriti in punti temporali specifici dopo l'inizio dell'imaging. Le immagini delle larve sono state scattate 48 h AEL (A e F),72 h AEL (B), 96 h AEL (C) e 120 h AEL (D). I neuroni sono etichettati da ppk>CD4-tdTom (A, D, Ee F) o ppk >CD4-tdTom (B e C). Le frecce blu indicano ritrazioni dendrite rispetto al punto temporale precedente. Le frecce gialle indicano estensioni dendrite rispetto al punto temporale precedente. (E) Morfologia dendrite alla fine di 12 h di imaging. (F) Fotogrammi consecutivi con intervalli di 3 minuti in un film che illustrano come un ramo dendrite in una seconda larva instar si estendeva (frecce gialle) e successivamente ritratta (frecce blu) dopo aver preso contatto con un altro dendrite. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagine time-lapse della degenerazione dei dendrite e dell'esposizione di un segnale eat-me. Fotogrammi selezionati da un film time-lapse di dendriti degeneranti di una classe IV da neurone dopo lesioni laser. I Dendrites sono stati etichettati da ppk>CD4-tdTom. Il segnale eat-me PS su dendriti degeneranti è stato rilevato da Annexin-GFP (AV-GFP), che è secreto dal corpo grasso. Le frecce gialle indicano i rami che mostrano l'etichettatura AV-GFP. Le frecce blu indicano i dendriti sottoposti a frammentazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video S1: Una terza larva instar viene immobilizzata nella tacca di un cuboide PDMS. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video S2: I dendriti si estendono e si ritraggono dinamicamente in una seconda larva instar. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video S3: I Dendriti si estendono e si ritraggono dinamicamente in una larva errante della terza stella. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video S4: Dendriti degenerano ed espongono la fosfatidilaseina dopo una terza larva instar. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.