Articolo metodologico

Knockdown condizionale combinato e formazione di sfere adattate Per studiare un gene associato alla staminalizza delle cellule staminali del cancro gastrico derivato dal paziente

DOI:

10.3791/60799

⸱

9 maggio 2020

 ,  ,  , 
1Guangdong Key Laboratory of Genome Stability and Human Disease Prevention, Department of Pharmacology and Shenzhen University International Cancer Center, Shenzhen University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.

Abstract

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Le cellule staminali tumorali (CSC) sono implicate nell'iniziazione del tumore, nello sviluppo e nella recidiva dopo il trattamento e sono diventate al centro dell'attenzione di molti studi negli ultimi decenni. Pertanto, è importante sviluppare metodi per studiare il ruolo dei geni chiave coinvolti nella staminalità delle cellule tumorali. Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di cancro. Si ritiene che le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) siano la radice della ricaduta del cancro gastrico, della metastasi e della resistenza ai farmaci. Comprendere la biologia dei GCSCs è necessario per far progredire lo sviluppo di terapie mirate e, infine, per ridurre la mortalità tra i pazienti. In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.

Introduzione

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Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di tumori1. Nonostante i progressi nella chirurgia combinata, chemioterapia e radioterapia nella terapia GC, la prognosi rimane scarsa e il tasso di sopravvivenza a cinque anni è ancora molto basso2. La ricorrenza e la metastasi sono le ragioni principali che causano i decessi post-trattamento.

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono un sottoinsieme di cellule tumorali che possiedono la capacità di auto-rinnovarsi e generare le diverse linee cellulari che ricostituire il tumore3. Si ritiene che i CSC siano responsabili della ricaduta e della metastasi del cancro a causa delle loro capacità di auto-rinnovamento e semina di nuovi tumori, così come la loro resistenza alle tradizionali chemio e radioterapie4. Pertanto, il targeting per i CSC e l'eliminazione delle CSC offrono un potenziale entusiasmante per migliorare il trattamento e ridurre la mortalità dei pazienti oncologici.

I CSC sono stati isolati da molti tipi di tumori solidi5. Nel 2009, le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) isolate dalle linee cellulari del cancro gastrico umano sono state originariamente descritte da Takaishi et al.6. Chen e colleghi hanno in primo luogo identificato e purificato i GCSC dai tessuti tumorali dell'adenocarcinoma gastrico umano (GAC)7. Questi risultati non solo forniscono l'opportunità di studiare la biologia dei GCSCs, ma forniscono anche grande importanza clinica.

Una caratteristica particolare dei CSC è la loro capacità di formare una sfera8. Le singole cellule sono placcate in condizioni non aderenti a bassa densità, e solo le cellule possedute dall'auto-rinnovamento possono crescere in un solido ammasso sferico chiamato sfera. Pertanto, il saggio sulla formazione della sfera è stato considerato come il saggio gold standard e ampiamente utilizzato per valutare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali in vitro.

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è un potente strumento di ricerca per studiare la funzione genica mediante l'abbattimento di un genespecifico 9. Tuttavia, le tecnologie di abbattimento genico stabili a lungo termine hanno alcune limitazioni, come la sfida di esplorare la funzione di un gene che è essenziale per la sopravvivenza cellulare. I sistemi RNAi condizionali possono essere utili per la downregolazione dei geni desiderati in modo temporale e/o controllato speciale dalla somministrazione di un agente induttivo. I sistemi indutbili di tetraciclina (Tet) sono uno dei sistemi RNAi condizionali più utilizzati10. I sistemi indutbili di Tet possono indurre il silenziamento genico bersaglio controllando l'espressione dello shRNA su aggiunta di un induttore esogeno (preferibilmente doxycycline, Dox). I sistemi Tet-inducible possono essere suddivisi in due tipi: sistemi Tet-On o Tet-Off. L'espressione di shRNA può essere attivata (Tet-On) o spenta (Tet-Off) in presenza dell'indottore. Nel sistema Tet-ON senza un induttore, il reprimere Tet (TetR) espresso in modo costitutivo si lega alla sequenza di elementi Tet-responsive (TRE) contenente un promotore dipendente da Pol III per l'espressione shRNA, reprimendo così l'espressione dello shRNA. Mentre su aggiunta di Dox, il TetR è sequestrato lontano dal promotore Tet-responsive Pol III-dipendente. Questo facilita l'espressione dello shRNA e porta al knockdown genico.

Il protocollo qui descritto utilizza un sistema di shRNA inducibile in tetraciclino funzionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare la funzione della clusterina nei GCSC derivati dalpaziente. Usiamo il protocollo descritto per studiare gli effetti della clusterina nell'auto-rinnovo dei GCSC. Questa metodologia è applicabile anche ad altri tipi di cellule staminali tumorali.

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Protocollo

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Tutte le sperimentazioni con cellule staminali gastriche derivate dal paziente sono state approvate nel documento del comitato eticolocale 7.

1. Coltura delle cellule staminali del cancro gastrico

  1. Preparazione dei GCSC completa coltura media
    1. Preparare il mezzo di coltura completa GCSC aggiungendo un mezzo DME/F12 fresco con i seguenti ingredienti essenziali: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% insulina/Transferrin/Sodium selenite, 0,2% glucosio, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoacido non essenziale, 10 M 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 tioglicerolo da 100 M, 100 penicillina IU/mL e 100 g/mL streptomicina. Filtrare e sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
      NOTA: si consiglia di memorizzare il supporto di coltura completo GCSC preferibilmente non più di due settimane a 4 gradi centigradi.
  2. Recupero di GCSC e cultura
    NOTA: I GCSC sono stati ottenuti come segue: I campioni di tumore sono stati sottoposti a dissociazione meccanica ed ezimatica. Le sospensioni a singola cella sono state ottenute filtrando con rete di nylon da sospensioni ben disperse. Le cellule tumorali risultanti sono state coltivate in GCSCs Complete Culture Medium, e alcune cellule sono cresciute fino a formare sfere. Queste sfere sono state poi sottoposte a dissociazione ezimatica, e i GCSC possono essere ottenuti mediante smistamento citofluorometrico della popolazione cellulare macchiata con marcatori CD44/CD54. Il protocollo dettagliato e gli analisi funzionali dei GCSC sono stati riportati7.
    1. I GCSC pre-caldi completano il mezzo di coltura a 37 gradi centigradi per non più di 30 minuti.
    2. Scongelare i GCSC dallo stoccaggio dell'azoto liquido e dal rapido scongelamento dei criovials in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi. Continua a vorticoso le fiale fino a quando l'intero contenuto si scioglie totalmente.
      NOTA: Scongelare rapidamente le cellule congelate (<1 min) in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi.
    3. Trasferire l'intero contenuto dei criovials in un tubo di centrifuga da 15 mL contenente 10 mL di mezzo di coltura completa GCSC. Centrifuga a 800 x g per 5 min a RT.
    4. Aspirare il supernatant con attenzione e sospendere il pellet cellulare in 10 mL di gcSCs mezzo completo fresco. Piastra la sospensione cellulare in una piastra Petri da 100 mm. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi in un'incubatrice 5% CO2 e aggiungere 5 mL di mezzo fresco completo il terzo giorno.
  3. Sottocultura delle gcSCs
    NOTA: I GCSC del centro delle cellule hanno solo nutrienti sufficienti prima che le sfere abbiano una dimensione fino a 80-100 m di diametro. Una volta che appaiono sfere di refattività scure e basse (circa 6 giorni di coltura), è necessario sottoculturare le sfere tumorali.
    1. Agitare delicatamente il piatto e trasferire il mezzo di coltura della coltura della coltura della coltura della cisfera tumorale GCSCs (il mezzo e le tasse tumorali non aderenti) in un tubo sterile di centrifuga da 15 mL. Per volumi medi più grandi, potrebbero essere necessari tubi di centrifuga più grandi.
    2. Centrifuga a 600 x g per 5 min e smaltire con cura il supernante. Dopo la centrifugazione, sarà visibile un pellet bianco e calato.
    3. Aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione cellulare per riesmirne il pellet per la dissociazione meccanica ed ezimatica a 37 gradi centigradi. Pipetta delicatamente su e giù 10 volte ogni 2-3 minuti nella procedura di digestione per rompere le sfere fino a quando le cellule tumorali sono disperse in sospensione a singola cellula. Questo processo di dissociazione totale è raccomandato per essere inferiore a 15 min.
      NOTA: Eseguire un controllo visivo al microscopio per verificare che non rimangano grandi sfere o aggregati di cellule.
    4. Aggiungere 10 mL di GCSCs freschi pre-riscaldati mezzo di coltura completa (5 volte il volume della soluzione di distacco cellulare) per terminare la procedura di digestione e centrifugare a 800 x g a RT per 5 min.
    5. Scartare il supernatant e risundere le cellule con 1 mL di fresco mezzo di coltura completa pre-riscaldata. Semina un numero adeguato di cellule in un nuovo piatto Petri da 100 mm con 10 mL di GCSC freschi pre-riscaldati completano il mezzo di coltura e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
    6. Rifinanziato le colture di tumori dopo 3 giorni con l'aggiunta di 5 mL di mezzo fresco pre-riscaldato completo. Dopo 6 giorni, le cellule di passaggio quando le cellule tumorali crescono fino a 80-100 m di diametro.
  4. Crioconservazione dei GCSC
    NOTA: Non crioconservare le cellule GCSC aggiungendo direttamente le cellule medie alle cellule tumorali. Le cellule tumorali GCSCs devono essere digerite in singole cellule in modo che l'agente protettivo cellulare possa entrare in ogni cellula per garantire l'immagazzinamento stabile a lungo termine delle cellule. Assicurarsi che le cellule siano in una situazione sana e senza contaminazione.
    1. Raccogliere le cellule gcSCs. Centrifuga a 600 x g per 5 min.
    2. Scartare il supernatant e aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione cellulare per dissociare le cellule tumorali GCSCs a 37 gradi centigradi. Terminare la procedura di digestione aggiungendo 10 mL di gcSC completo supporto di coltura.
    3. Centrifuga a 800 x g per 5 min e raccogliere singoli GCSC.
    4. Sospendere delicatamente i GCSC con mezzo crioconservatorio privo di siero. La concentrazione finale raccomandata è 5 x 105 - 5 x 106 celle/mL.
    5. Erogare la sospensione cellulare in aliquots da 1 mL in fiale criogeniche marcate.
    6. Posizionare immediatamente i criovials contenenti le cellule in una camera isopropanolo e conservarli a -80 gradi centigradi. Trasferire le fiale in azoto liquido il giorno successivo per lo stoccaggio a lungo termine.

2. Generazione di linee GCSCs knockdown inducibili

CAUTION: Le lentivirus ricombinanti sono state designate come organismi di livello 2 dal National Institute of Health and Center for Disease Control. Il lavoro che coinvolge il lentivirus richiede il mantenimento di una struttura di Biosafety Level 2, considerando che i supernatanti virali prodotti da questi sistemi lentivirali potrebbero contenere virus ricombinanti potenzialmente pericolosi.

  1. Generazione di particelle di lentivirus
    1. Sintetizzare 2 vettori lentivirali che trasportano shRNA inducibili mirati a clusterina umana e un vettore lentivirale di controllo non bersaglio (GV307) di GeneChem basato sulla progettazione della tabella 1 (il vettore GV307 contiene: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
    2. Seme 4 x 106 293T cellule di confezionamento lenti-virali in un piatto Petri da 100 mm con 10 mL di DMEM integrato con siero bovino fetale al 10%.
    3. Incubare le cellule 293T durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Assicurarsi che la densità delle cellule 293T sia circa il 50-80% confluente il giorno della trasfezione.
    4. Portare il siero ridotto a temperatura ambiente e preparare il tubo A e il tubo B come descritto nella tabella 2.
    5. Trasferire il tubo A nel tubo B, mescolare bene e incubare i complessi per 20 minuti a temperatura ambiente per preparare complessi lipidico-DNA.
    6. Rimuovere 5 mL di media, prima di aggiungere il complesso lipidico-DNA, lasciando un totale di 5 mL.
    7. Aggiungere 5 mL di complesso lipidico-DNA nel piatto di coltura dropwise e girare delicatamente il piatto per distribuire il complesso.
      NOTA: Erogare con cura il liquido contro la parete del piatto per evitare di disturbare le cellule 293T.
    8. Piatto di coltura incubato per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
    9. Dopo 24 ore dopo la trasfezione, rimuovere con cura il mezzo di trasfezione e sostituire delicatamente con 10 mL di DMEM pre-riscaldato integrato con 10% FBS. Incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
      NOTA: Tutti i supernatant e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
    10. Circa dopo 48 ore dopo la trasfusione, raccogliere 10 mL di supernatanti contenenti lentivirus.
      NOTA: Tutti i vasi e le punte di coltura cellulare devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
    11. Filtrare il supernatant lentivirale utilizzando un filtro poro da 0,45 m per rimuovere i detriti cellulari.
      NOTA: Tutti i filtri e le siringhe devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
    12. Trasferire il supernatant chiarito in un contenitore sterile, aggiungere Lenti-X Concentrator (1/3 volume di supernatant chiarito) da mescolare per inversione delicata.
    13. Miscela di incubazione a 4 gradi centigradi durante la notte.
    14. Campioni di centrifuga a 1.500 x g per 45 min a 4 gradi centigradi. Dopo la centrifugazione, e pellet bianco sarà visibile. Rimuovere con attenzione supernatant, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
      NOTA: Tutti i supernatant e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
    15. Rispendere delicatamente il pellet in 1 mL di DMEM integrato con 10% FBS come stock di virus, negozio a -80 gradi centigradi.
  2. Generazione di linee cellulari trasfettate stabili
    1. Seme 6 x 106 GCSC in un piatto Petri da 100 mm con DMEM da 10 mL integrato con 10% FBS per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2 (70-80% di confluenza prima dell'infezione).
    2. Aspirare il mezzo nel piatto, aggiungere le particelle lentivirali concentrate diluite con 4 mL di mezzo DMEM completo contenente reagente di polibrene (5 g/mL) nel piatto. Incubare per 18 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
      NOTA: La concentrazione ottimale di polibrene dipende dal tipo di cellula e potrebbe essere necessario testare in diverse concentrazioni per decidere le concentrazioni effettive. In caso contrario, può essere determinato empiricamente, di solito nell'intervallo di 2-10 g/mL. Tutti i tubi e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
    3. Cambiare il mezzo, sostituire con 10 mL di DMEM con 10% FBS medio e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
      NOTA: Tutto il mezzo e le punte devono essere trattati con 10% di candeggina prima dello smaltimento.
    4. Aspirare il supernante con detriti cellulari, sostituire con DMEM fresco integrato con 10% di supporto FBS contenente puramicina (2,5 g/mL) e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Sostituire quindi il DMEM fresco integrato con un supporto FBS al 10% contenente puromicina (5 g/mL) e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per ulteriori 24 h.
    5. Sciacquare due volte i GCSC aderenti con 5 mL di DPBS senza calcio e magnesio.
    6. Dissociare i GCSC con 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare pre-riscaldata e incubare 2-3 min a 37 gradi centigradi.
    7. Aggiungere 5 mL di gcSCs freschi pre-riscaldati media di coltura completa alla sospensione cellulare.
    8. Erogare 3 mL in un tubo centrifugo da 15 mL (tubo A) per crioconservare le cellule, mentre gli altri 3 mL in un tubo centrifugo da 15 mL (tubo B) per indurre la doxycycline.
    9. Tubo centrifugare A e tubo B a 800 x g per 5 min.
    10. Rispendere il pellet del tubo A con 1 mL di mezzo criopreservativo privo di siero, trasferire la fiala a -80 gradi centigradi durante la notte e rimuoverla in un deposito di azoto liquido.
    11. Aspirare il supernante e risundere le cellule del tubo B in 1 mL di nuovi gcSC pre-riscaldati completa media di coltura. Seme un numero appropriato di cellule in un nuovo piatto Petri da 100 mmL di 10 mL GCSC freschi pre-riscaldati completano il mezzo di coltura con doxycycline (Dox) (2,5 g/mL) e incubato per 48 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
      NOTA: La concentrazione ottimale di Dox può variare tra le linee cellulari. Ogni linea cellulare deve essere testata in diverse concentrazioni di Dox per decidere le concentrazioni effettive per KD e per la tossicità sulle cellule.
    12. Confermare la repressione stabile della clusterina in GCSC da parte del blotting occidentale.

3. Analisi della formazione della sfera

  1. Scongelare le linee GCSCs induttivi di knockdown congelate (vedere il punto 1.2).
  2. Determinare la densità delle cellule praticabili di un campione di 10 L utilizzando un contatore automatico delle cellule.
  3. Regolare il volume con il supporto di coltura completo pre-riscaldato GCSC per ottenere una concentrazione di 2 x 104 celle vitali/mL.
  4. Erogare in 3 nuovi pozzi di coltura ultra-basso-attaccamento (0,1 mL/pozzo) ogni gruppo.
  5. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% CO2. La formazione della sfera dovrebbe avvenire entro 3-10 giorni. Monitorare e registrare la visualizzazione della formazione delle cellule ogni 2 giorni.
    NOTA: Il mezzo non è raccomandato per essere cambiato in caso di qualsiasi disturbo della formazione delle cellule tumorali. Queste cellule tumorali devono essere facilmente distinte dalle cellule singole e aggregate.
  6. Determinare i risultati della formazione della tumoros facendo valutazione delle dimensioni delle cellule formate utilizzando un software di imaging.

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Risultati

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Le cellule staminali del cancro gastrico dell'adenocarcinoma gastrico umano primario sono state covate in un mezzo di coltura privo di siero. Dopo 6 giorni, le cellule si sono espanse dal fenotipo a cella singola (Figura 1A) per formare sfere di grandi dimensioni (Figura 1B).

Per valutare la funzione della clusterina nei GCSC, le sequen...

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Discussione

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La GC è la terza causa di morte legata al cancro in tutto il mondo. I GCSC sono fondamentali nella ricaduta del cancro gastrico, nella metastasi e nella resistenza ai farmaci. L'utilizzo di GCSC da pazienti affetti da cancro gastrico ci permetterà di esplorare il loro punto debole e sviluppare i farmaci di targeting per il trattamento dei pazienti affetti da GC.

Il saggio sulla formazione della sfera è un metodo utile per esaminare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali tum...

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Dichiarazioni

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Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Nature Science Foundation della provincia del Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), la Medical Scientific Research Foundation della Provincia del Guangdong (A2019405), la National Natural Science Foundation of China (81772957), la Science and Programma tecnologico della provincia del Guangdong in Cina (2017B030301016) e la Industry and Information Technology Foundation di Shenzhen (20180309100135860).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 μ m filterMilliporeSLGP033RB
1-TioglicerinaSigma-AldrichM6145
2-MercaptoetanoloGibco2068586
EGF umano ricombinante senza animaliPeprotechAF-100-15
B-27 Integratore (50X), senza sieroGibco17504044
Corning Costar Piastra a pozzetti multipli con attacco ultra-bassoSigma-AldrichCLS3474
Countess Conta Cellule VetriniInvitrogenC10228
Countess II Contatore Cellulare AutomatizzatoInvitrogenAMQAX1000
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG6152
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
DMEM, Alto Glucosio, GlutaMAX, PiruvatoGibco
Idlatino di doxiciclinaSigma-AldrichD9891
DPBS, senza calcio, senza magnesioGibco14190250
Siero fetale bovino, qualificato, AustraliaGibco10099141
GlutaMAX IntegratoreGibco35050061
insulina, transferrina, soluzione di selenio (ITS -G), 100XGibco
lentiviraleGeneChemGV307
Concentratore Lenti-XTakara631232
Lipofectamina 3000 Reagente di trasfezioneInvitrogenL3000015
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100XGibco11140050
Unità filtro siringa Millex-HV, 0,45 e micro; m, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi gammaMilliporeSLHV033RB
Nalgene Provette criogeniche per conservazione generale a lungo termineThermo Scientific5000-1020
Nunc Colture cellulari/piastre di PetriThermo Scientific171099
Opti-MEM I Siero ridotto MediumGibco31985070
Penicillina-Streptomicina,Gibcoliquido 15140122
pHelper 1.0 (componente gag/pol)GeneChempHelper 1.0
pHelper 2.0 (componente VSVG)GeneChempHelper 2.0
PolybreneSigma-AldrichH9268
FGF-basico umano ricombinantePeprotech100-18B
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761
STEM-CELLBANKER Terreno di crioconservazioneZENOAQ11890
Soluzione di dissociazione cellulare StemPro AccutaseGibcoA1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Tampone, pH 7,5Invitrogen15567027
ZEISS Microscopio invertitoZEISSAxio Vert.A1
10569044vettore 41400045

Riferimenti

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