In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.
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Articolo metodologico
Knockdown condizionale combinato e formazione di sfere adattate Per studiare un gene associato alla staminalizza delle cellule staminali del cancro gastrico derivato dal paziente
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono implicate nell'iniziazione del tumore, nello sviluppo e nella recidiva dopo il trattamento e sono diventate al centro dell'attenzione di molti studi negli ultimi decenni. Pertanto, è importante sviluppare metodi per studiare il ruolo dei geni chiave coinvolti nella staminalità delle cellule tumorali. Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di cancro. Si ritiene che le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) siano la radice della ricaduta del cancro gastrico, della metastasi e della resistenza ai farmaci. Comprendere la biologia dei GCSCs è necessario per far progredire lo sviluppo di terapie mirate e, infine, per ridurre la mortalità tra i pazienti. In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.
Introduzione
Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di tumori1. Nonostante i progressi nella chirurgia combinata, chemioterapia e radioterapia nella terapia GC, la prognosi rimane scarsa e il tasso di sopravvivenza a cinque anni è ancora molto basso2. La ricorrenza e la metastasi sono le ragioni principali che causano i decessi post-trattamento.
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono un sottoinsieme di cellule tumorali che possiedono la capacità di auto-rinnovarsi e generare le diverse linee cellulari che ricostituire il tumore3. Si ritiene che i CSC siano res....
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Protocollo
Tutte le sperimentazioni con cellule staminali gastriche derivate dal paziente sono state approvate nel documento del comitato eticolocale 7.
1. Coltura delle cellule staminali del cancro gastrico
- Preparazione dei GCSC completa coltura media
- Preparare il mezzo di coltura completa GCSC aggiungendo un mezzo DME/F12 fresco con i seguenti ingredienti essenziali: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% insulina/Transferrin/Sodium selenite, 0,2% glucosio, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoacido non essenziale, 10 M 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 tioglicerolo da 100 M, 100 penicillina IU/mL e 100....
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Risultati
Le cellule staminali del cancro gastrico dell'adenocarcinoma gastrico umano primario sono state covate in un mezzo di coltura privo di siero. Dopo 6 giorni, le cellule si sono espanse dal fenotipo a cella singola (Figura 1A) per formare sfere di grandi dimensioni (Figura 1B).
Per valutare la funzione della clusterina nei GCSC, le sequen.......
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Discussione
La GC è la terza causa di morte legata al cancro in tutto il mondo. I GCSC sono fondamentali nella ricaduta del cancro gastrico, nella metastasi e nella resistenza ai farmaci. L'utilizzo di GCSC da pazienti affetti da cancro gastrico ci permetterà di esplorare il loro punto debole e sviluppare i farmaci di targeting per il trattamento dei pazienti affetti da GC.
Il saggio sulla formazione della sfera è un metodo utile per esaminare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali tum.......
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Dichiarazioni
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Nature Science Foundation della provincia del Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), la Medical Scientific Research Foundation della Provincia del Guangdong (A2019405), la National Natural Science Foundation of China (81772957), la Science and Programma tecnologico della provincia del Guangdong in Cina (2017B030301016) e la Industry and Information Technology Foundation di Shenzhen (20180309100135860).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Tioglicerina | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Gibco | 2068586 | |
| EGF umano ricombinante senza animali | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Integratore (50X), senza siero | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Piastra a pozzetti multipli con attacco ultra-basso | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Conta Cellule Vetrini | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Contatore Cellulare Automatizzato | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, Alto Glucosio, GlutaMAX, Piruvato | Gibco | ||
| Idlatino di doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Gibco | 14190250 | |
| Siero fetale bovino, qualificato, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Integratore | Gibco | 35050061 | |
| insulina, transferrina, soluzione di selenio (ITS -G), 100X | Gibco | ||
| lentivirale | GeneChem | GV307 | |
| Concentratore Lenti-X | Takara | 631232 | |
| Lipofectamina 3000 Reagente di trasfezione | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Unità filtro siringa Millex-HV, 0,45 e micro; m, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi gamma | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene Provette criogeniche per conservazione generale a lungo termine | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Colture cellulari/piastre di Petri | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Siero ridotto Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillina-Streptomicina, | Gibco | liquido 15140122 | |
| pHelper 1.0 (componente gag/pol) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (componente VSVG) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| FGF-basico umano ricombinante | Peprotech | 100-18B | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Terreno di crioconservazione | ZENOAQ | 11890 | |
| Soluzione di dissociazione cellulare StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Tampone, pH 7,5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Microscopio invertito | ZEISS | Axio Vert.A1 |
Riferimenti
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
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Ristampe e permessi
