Method Article

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

DOI:

10.3791/60806

⸱

March 30th, 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'imaging a fluorescenza multispettrale su tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) consente di rilevare più marcatori in un singolo campione di tessuto in grado di fornire informazioni sulla coespressione dell'antigene e sulla distribuzione spaziale dei marcatori. Tuttavia, la mancanza di anticorpi adatti per i tessuti fissati in formalina può limitare la natura dei marcatori che possono essere rilevati. Inoltre, il metodo di colorazione richiede molto tempo. Qui descriviamo un metodo rapido per eseguire l'imaging a fluorescenza multispettrale sui tessuti congelati. Il metodo include le combinazioni di fluoroforo utilizzate, passaggi dettagliati per la colorazione dei tessuti congelati del topo e dell'uomo e le procedure di scansione, acquisizione e analisi. Per l'analisi della colorazione, viene utilizzato un sistema di imaging a fluorescenza multispettrale semiautomatico disponibile in commercio. Attraverso questo metodo, fino a sei diversi marcatori sono stati macchiati e rilevati in una singola sezione di tessuto congelato. Il software di analisi dell'apprendimento automatico può fenotipo le cellule che possono essere utilizzate per l'analisi quantitativa. Il metodo qui descritto per i tessuti congelati è utile per il rilevamento di marcatori che non possono essere rilevati nei tessuti FFPE o per i quali anticorpi non sono disponibili per i tessuti FFPE.

Introduction

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I recenti progressi nelle tecniche di imaging microscopico hanno migliorato significativamente le nostre conoscenze e la comprensione dei processi biologici e degli stati della malattia. Il rilevamento in situ delle proteine nei tessuti tramite immunohistochimica cromogenica (IHC) viene regolarmente eseguito in patologia. Tuttavia, il rilevamento di più marcatori che utilizzano la colorazione IHC cromogenica è difficile1 e metodi più recenti per utilizzare approcci di colorazione multifluorescenza (mIF), in cui più marcatori biologici sono etichettati su un singolo campione di tessuto, sono in fase di sviluppo. La rilevazione di più marcatori b....

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Protocol

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La milza del topo e i tessuti tumorali del topo HLF1623 sono stati ottenuti dal nostro laboratorio. Il tessuto tonsillare umano è stato acquistato da un fornitore commerciale. I dettagli sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Incorporamento dei tessuti

  1. Incorporare tessuti freschi nella soluzione OCT (temperatura di taglio ottimale) e congelare con lo snap utilizzando ghiaccio secco o azoto liquido.
  2. Conservare i tessuti a -80 gradi centigradi.

2. Criosezione

  1. Tagliare 8 sezioni in un criostato con temperature fissate a -25 gradi cent....

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Results

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Rilevamento di marcatori a macchia singola su sezioni di milza congelate
Poiché il sistema di imaging semiautomatico utilizza un sistema di filtri regolabili a cristalli liquidi (LCTF) che consente una più ampia gamma di rilevamento della lunghezza d'onda25, e poiché non sono stati eseguiti passaggi di amplificazione del segnale qui, abbiamo prima ottimizzato il rilevamento dei nostri anticorpi coniugati primari per ogni marcatore al microscopio. Un esempio è illustrato nella <.......

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Discussion

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I tessuti congelati sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging mIF per rilevare tradizionalmente da tre a quattro marcatori31 su un tessuto utilizzando il metodo diretto e indiretto32. Nel metodo diretto, gli anticorpi sono coniugati a coloranti fluorescenti o punti quantici33 per etichettare il tessuto, mentre nel metodo indiretto, un anticorpo primario non coniugato viene utilizzato per etichettare il tessuto seguito da un anticorpo secondario .......

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgements

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L'imaging e l'analisi sono state fornite dal Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core dell'Università dell'Illinois a Chicago istituito con il supporto dell'ufficio del Vice Cancelliere per la Ricerca. Il lavoro è stato supportato da NIH/NCI RO1CA191317 a CLP, da NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) al Dr. A. Paller, e dal sostegno del Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center to the Immunotherapy Assessment Core presso la Northwestern University.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetone (grado istologico)Fisher ScientificA16F-1GALTessuti di fissaggio
Alexa Fluor 488 anti-topo CD3BioLegend100212Clone - 17A2; anticorpo coniugato primario
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-umano CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Clone - L26; anticorpo coniugato primario
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67BD Biosciences558617Anticorpo coniugato primario
Alexa Fluor 594 anti-umano CD3BioLegend300446Clone - UCHT1; anticorpo coniugato primario
Alexa Fluor 594 anti-topo CD8aBioLegend100758Clone - 53-6.7; anticorpo coniugato primario
Alexa Fluor 647 anti-umano CD8aBioLegend372906Clone - C8/144B; anticorpo
coniugato primarioAlexa Fluor 647 anti-topo CD206 (MMR)BioLegend141711Clone - C068C2; anticorpo coniugato primario
Alexa Fluor 647 anti-topo CD4 AnticorpoBioLegend100426Clone - GK1.5; anticorpo coniugato primario
C57BL/6 MouseCharles River Laboratories27Tessuti congelati di topo utilizzati per il training multispettrale
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EAVetrini reidratanti e lavanti Soluzione
DAPIBD Biosciences564907Colorazione dell'acido nucleico
Vetrini caricati Vetro bianco diamantato Vetrini caricatiDOT ScientificDW7590WSezioni di tessuto aderenti
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1x (senza Ca e Mg)Fisher ScientificMT21031CV Lavaggio e diluente
Gold Seal Cover SlipsThermoFisher Scientific3306Protezione dei tessuti colorati
Tonsilla normale umana OCT blocco di tessuto congelatoAMSBioAMS6023Tessuto umano congelato utilizzato per la colorazione multispettrale
Siero umano 1xGemini Bio-Products100-512Bloccante e diluente per tessuti umani
inFormAkoya BiosciencesVersione 2.4.1Software di apprendimento automatico
PerCP/Cyanine5.5 anti-umano CD4BioLegend300529Clone - RPA-T4; anticorpo coniugato primario
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11bBD Biosciences550993Clone - M1/70; anticorpo coniugato primario
PhenochartAkoya BiosciencesVersione 1.0.8Software di scansione dell'intero vetrino
ProLong Diamond Antifade MountantThermoFisher ScientificP36965Mezzo
di montaggioRicerca CriostatoLeica BiosystemsCM3050 SSezionamento dei tessuti
Superblock 1xThermoFisher Scientific37515Blocco dei tessuti di topo
Soluzione Tissue-Tek O.C.TSakura Finetek4583Inclusione dei tessuti
Vectra 3.0 Sistema automatizzato di imaging patologico quantitativo, 6 vetriniAkoya BiosciencesCLS142568Imaging multispettrale semi-automatizzato sistema
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesVersione 3.0.5Software per l'utilizzo del microscopio

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.

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Multispectral Fluorescence ImagingFrozen Tissue SectionsFluorophore CombinationsSpectral Library CreationMachine Learning AnalysisCell SegmentationAntibody Staining ProtocolSpectral UnmixingWhole Slide ScanPhenotype Mapping

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