In Vitro Diretto Evoluzione di una restrizione Endonucleato con più stringente specificità

Sommario

Le endonucleasi di restrizione con nuova specificità della sequenza possono essere sviluppate da enzimi che riconoscono una sequenza parzialmente degenerata. Qui forniamo un protocollo dettagliato che abbiamo usato con successo per alterare la specificità della sequenza dell'enzima NlaIV. Gli ingredienti chiave del protocollo sono la compartimentazione in vitro della reazione di trascrizione/traduzione e la selezione di varianti con nuove specificità di sequenza.

Abstract

L'ingegneria della specificità di restriction endonuclease (REase) è estremamente difficile. Qui descriviamo un protocollo multifase che aiuta a produrre varianti REase che hanno una specificità più rigorosa rispetto all'enzima parentale. Il protocollo richiede la creazione di una libreria di cassette di selezione delle espressioni (ESC) per le varianti del REase, idealmente con variabilità nelle posizioni che possono influenzare il legame del DNA. L'ESC è affiancato da un lato da una sequenza per l'attività del sito di restrizione desiderata e da un tag biotina e dall'altro da un sito di restrizione per l'attività indesiderata e da un sito di accompagnamento. Gli ESC sono trascritti e tradotti in un'emulsione di acqua in olio, in condizioni che rendono improbabile la presenza di più molecole di DNA per gocciola. Pertanto, il DNA in ogni molecola di cassetta è sottoposto solo all'attività dell'enzima tradotto e codificato. Varianti REase della specificità desiderata rimuovere il tag biotina, ma non il sito di analing primer. Dopo aver rotto l'emulsione, le molecole di DNA sono sottoposte a un pulldown di biotina, e solo quelle nel soppala vengono mantenute. Questo passaggio assicura che vengano mantenuti solo gli ESC per le varianti che non hanno perso l'attività desiderata. Queste molecole di DNA sono poi sottoposte a una prima reazione PCR. Cleavage nella sequenza indesiderata taglia il sito di rilegatura primer per uno dei primers. Pertanto, PCR amplifica solo gli ESC dalle goccioline senza l'attività indesiderata. Viene quindi eseguita una seconda reazione PCR per reintrodurre il sito di restrizione per la specificità desiderata e il tag biotina, in modo che la fase di selezione possa essere ribadita. I frame di lettura aperti selezionati possono essere sovraespressi in cellule batteriche che esprimono anche la cognate metiltransferasi del REase parentale, perché il REase appena evoluto si rivolge solo a un sottoinsieme dei siti di destinazione della metiltransferasi.

Introduzione

L'ingegneria della specificità della sequenza è estremamente complessa per le REase di classe II. In questa classe di endonucleases, il riconoscimento della sequenza e la catalisi sono strettamente intrecciati, molto probabilmente come una salvaguardia evolutiva contro la creazione di un endonuclease di specificità più ampia rispetto alla sua cognate metiltransferase, che danneggerebbe il DNA dell'ospite. L'evoluzione diretta di nuove specificità nelle cellule è ulteriormente complicata dalla necessità di proteggere il DNA dell'ospite dalla nuova attività endonuclease. Pertanto, ci sono solo pochi tentativi riusciti di ingegneria REase segnalati e tutti sfruttano le caratteristiche uniche di un particolare enzima^{1,2,3,4,5,6,7}.

Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'ingegneria della specificità che può essere utilizzato per generare varianti endonuclease che hanno una specificità più stretta rispetto a un enzima parentale che si basa sulla nostra ingegneria di successo di un endonuclease NlaIV⁸. Per qualsiasi enzima di questo tipo con una sequenza di riconoscimento arbitrario, è possibile introdurre una specificità supplementare per le basi nei fianchi. Per gli enzimi parentali che riconoscono sequenze parzialmente degenerate (come NlaIV con il suo obiettivo GGNNCC), è possibile introdurre ulteriori specificità anche all'interno della sequenza di riconoscimento. Poiché la specificità supplementare richiederà probabilmente contatti proteina-DNA, le basi appena riconosciute dovrebbero trovarsi all'interno dell'impronta dell'endonucleano parentale sul DNA. In linea di principio, è possibile impostare schemi di selezione per qualsiasi specializzazione desiderata della sequenza di riconoscimento. Tuttavia, la maggior parte delle REase che riconoscono le sequenze bersaglio palindromo e quasi palindromo sono dimeri funzionali che riconoscono solo un semi-sito del palindromo. Pertanto, è improbabile che la selezione di nuove specificità che violano la simmetria delle interazioni nucleiche proteiche funzioni. Per il dimeric NlaIV, ad esempio, la sequenza GGNNCC può teoricamente essere ristretta a GGATCC, ma si prevede che restringere la specificità a GGAACC sia più difficile. Il nostro schema prevede una selezione sia positiva che negativa.

Il processo è più efficiente quando la selezione negativa viene utilizzata anche per rimuovere le specificità in grado di fendere tutte le sequenze diverse dalla specificità più stretta preferita. Ad esempio, la selezione per GGATCC potrebbe essere combinata con l'antiselezione con GGBVCC (dove B è una qualsiasi base diversa da A e V è qualsiasi base diversa da T). Quando alcune delle possibili sequenze target non sono coperte, il risultato dell'esperimento di selezione dipende dall'efficacia della selezione positiva e negativa. Nel nostro lavoro NlaIV, abbiamo scelto per GGATCC, e contro GGSSCC (dove S è G o C), e ottenuto una specificità che, ignorando gli obiettivi di rottura della simmetria, potrebbe essere descritto come GGWWCC (dove W è A o T), suggerendo che in questo caso particolare, la selezione negativa era più importante della selezione positiva.

Il nostro approccio inizia con la creazione di una cassetta di selezione dell'espressione (ESC). Il CES è strutturato in sezioni. Nella sezione centrale interna, ci sono varianti del frame di lettura aperto (ORF) del REase, sotto il controllo promotore T7. Questa sezione centrale del CES non può contenere alcun sito cognato per il REase progettato. Il nucleo è inserito tra due siti cognati per tipo selvaggio REase: un sito di scissione per l'attività indesiderata (contro sequenza selezionata, GGSSCC in questo esempio) e un sito di scissione per l'attività desiderata (sequenza selezionata, GGATCC nell'esempio). La fase finale della preparazione dell'ESC in PCR aggiunge biotina vicino all'attività desiderata alla fine 5' e crea una varietà di sequenze contatore selezionate (GGSSCC nell'esempio). La strategia di selezione si basa sull'uso di primer attentamente progettati al protocollo di riamplificazione ESC dopo una trascrizione in vitro/traduzione/selezione (Figura 1A). La libreria ESC è espressa in una tramazione in vitro compartimentata trancilazione emulsione acqua-in-olio^9,10,11. All'interno di ogni goccia, la specificità dell'enzima espresso influisce sullo stato dell'ESC(Figura 1B, passaggio I). Per la disposizione descritta, l'attività di scissione desiderata della proteina tradotta rimuove il tag biotina del DNA, ma non influisce sull'altra estremità ESC con la sequenza selezionata dal contatore. Quando l'emulsione viene interrotta, i frammenti biotinylati vengono rimossi dal pulldown di affinità streptavidin, in modo che rimangano solo i frammenti delle goccioline con l'attività desiderata (Figura 1B, passaggio II). Questo passaggio rimuove le varianti REase inattive. La frazione supernatante del passo pull-down viene poi amplificata dalla PCR. Nei primi primer di reazione PCR F2 e R1 sono utilizzati (Figura 1A, B, passo III). Primer F2 si lega alla sezione ESC tra la sequenza del contatore selezionato e l'estremità della molecola. Pertanto, gli ESC che esprimono varianti che sono in grado di fensciolare la sequenza selezionata del contatore (e, di conseguenza, separano i siti di legame per i primer F2 e R1 in due diverse molecole di DNA) non sono amplificate e vengono quindi rimosse dalla libreria. L'inn: R1 si lega tra il sito selezionato e il nucleo dell'ESC in modo che non sia influenzato dallo stato di scissione del sito selezionato e ripristini il sito di scissione per l'attività desiderata (GGATCC). Il ciclo è chiuso da un secondo PCR (con primer F1 e R2) che aggiunge biotina all'estremità 5' vicino al sito selezionato e ripristina la variazione progettata nel sito selezionato vicino all'estremità opposta del CES (Figura 1B, passo IV). La miscela di DNA risultante è pronta per un altro giro di selezione.

Il successo del protocollo di selezione dipende fortemente dalla corretta scelta della nuova, più rigorosa sequenza di riconoscimento degli obiettivi e da un'attenta progettazione della strategia di mutagenesi e dalla sua effettiva attuazione. Poiché è molto più facile migliorare su lievi preferenze preesistenti del REase che superarle, si consiglia di iniziare con uno studio cinetico di tutte le preferenze preesistenti. La necessità di un'attenta progettazione della mutagenesi deriva dalle dimensioni limitate di una libreria mutata che può essere elaborata dal protocollo presentato (10⁹ cloni in un unico esperimento). Pertanto tutte le 20 possibili sostituzioni di amminoacidi possono essere testate efficacemente solo in poche posizioni (vedi Discussione). La mutagenesi casuale, come la PCR (EP-PCR) soggetta a un errore come metodo alternativo, porterà a un profondo sottocampionamento della complessità esistente. Se sono disponibili informazioni relative a potenziali posizioni di amminoacidi coinvolti nei contatti con il DNA (o anche in prossimità dei nucleotidi degenerati in una sequenza cognata), dovrebbero certamente essere utilizzate per selezionare alcuni amminoacidi per la mutagenesi della saturazione guidata oligonucleotide (passaggi del protocollo 1.6-3.10).

Protocollo

1. Preparazione degli ESC

1. Metiltransferasi dei cloni del sistema di modifica delle restrizioni da progettare in un numero di copie ridotto plasmide (ad esempio, pACYC184 o pACYC174 o loro derivati).
   NOT: Il ceppo dell'ospite batterico deve essere in grado di tollerare la metilazione introdotta dall'enzima clonato e fornire un'espressione inducibile della polimerasi t7 RNA. Si raccomanda l'uso del ceppo ER2566 (portatori di mutazioni McrA, McrBC e Mrr).
2. Confermare che il DNA plasmide ricombinante è protetto contro la scissione dalla cognate endonucleato trattando 0,5 g di DNA plasmide con 10 unità di cognate REase in tampone e temperatura raccomandata dal fornitore di enzimi per 2 h.
3. Preparare celle competenti di questo ceppo.
   NOT: È possibile utilizzare qualsiasi metodo. Il progetto ingegneristico NlaIV ha utilizzato un semplice metodo di cloruro di calcio¹².
4. Costruire un plasmide ricombinante con l'ORF per il REase sotto il controllo del promotore T7 da un gruppo di esclusione diverso e con un marcatore di selezione diverso da quello contenente il gene metilamine nel passaggio 1.1. È possibile utilizzare vettori pET28 e pET30.
5. Rimuovere tutti i siti di riconoscimento per l'enzima ingegnerizzato dalla sezione del plasmide ricombinante tra il promotore di T7 e il codon di arresto dell'enzima ORF introducendo mutazioni silenziose (Figura 2, Tabella 1A).
   NOTA: se è necessario rimuovere più di un sito di questo tipo, saranno necessari più round di mutazione (passaggi da 1.5.1– 1.5.7).
   1. Utilizzare una reazione PCR interna che amplifica il plasmide a lunghezza intera con variazioni progettate introdotte alle estremità 5' dei primer (Tabella 2A).
   2. Rimuovere il DNA del modello aggiungendo 10 U di DpnI endonucleo alla 50 -L della reazione PCR, e incubare per 2 h a 37 .
   3. Risolvere i prodotti mediante elettroforesi gel agarose. Tagliare la fascia corrispondente al plasmide a tutta lunghezza e purificarla con un kit commerciale.
   4. Aggiungere 10x buffer di legatura (a una concentrazione 1x) e integrare con ATP (a 1 mM). Aggiungere 10 U di T4 polynucleotide kinase e incubare per 20 min a 37 gradi centigradi. Inattivare l'enzima riscaldando a 70 gradi centigradi per 10 minuti.
   5. Aggiungere PEG 4000 al 5%, integrare di nuovo con ATP (a 1 mM), e aggiungere 5 U di T4 DNA ligase. Incubare per 2 h a temperatura ambiente (RT).
   6. Trasformarsi in un ceppo batterico competente che trasporta la cognata metiltransferasi (passaggio 1.1).
   7. Isolare il DNA plasmide su piccola scala e confermare l'introduzione di cambiamenti di sequenza mediante sequenziamento didiosssia.
6. Introdurre siti di restrizione unici vicino alla sequenza(s) di destinazione dell'oligonucleotide mutagenesi guidata (Figura 2, Tabella 1B). Seguire i passaggi da 1.5.1– 1.5.7 per ogni sito.
   NOT: Questa fase viene eseguita solo quando viene utilizzata una mutagenesi mirata. Se si esegue la mutagenesi casuale, saltare i passaggi 2-3 e procedere alla sezione 3. Nell'esempio presentato tutti i siti sono stati introdotti a monte delle regioni interessate, ma possono essere introdotti anche a valle.
7. Primer di progettazione per l'amplificazione dell'ESC (tabella 1C).
   1. Progettare un'associazione di primer inversa a valle dell'ORF endonuclease che introdurrà il sito di riconoscimento selezionato (R1) e la versione più corta (R2) che si associa all'esterno della sequenza NlaIV selezionata e contiene biotina alla fine 5' (vedere Figura 1).
   2. Progettare un'associazione di primer in avanti (F1) all'ESC a monte del promotore T7. Questo primer dovrebbe anche introdurre varianti controselezionate della sequenza di riconoscimento originale (cioè il massimo delle variazioni di sequenza riconosciute dall'enzima originale, ad eccezione della sequenza inversa selezionata).
      NOT: Una versione più breve di questo primer (F2) che copre la sequenza distale alla sequenza controselezionata verrà utilizzata più avanti nella PCR selettiva (passaggio 5.9).

2. Sintesi split-and-mix di Primer Mutageni

NOT: Questo passaggio viene utilizzato solo per i progetti che richiedono la mutagenesi di sottosaturazione in più di un sito. È necessario un sintetizzatore con più colonne di sintesi. Assegnare colonne per la sintesi di triplette casuali NNS codon e triplette di codone di tipo selvaggio in base alle frequenze di mutagenesi. Ad esempio, se sono disponibili sette colonne di sintesi del volume uguale ed è auspicabile un tasso di mutagenesi pari a 0,3 in un determinato sito, aggiungere codoni NNS randomizzati in 0,3 x 7 o due colonne e codoni di tipo selvaggio in 0,7 x 7 o cinque colonne (Figura 3).

1. Decidere sui siti per la mutagenesi di subsaturazione. Scegliere le frequenze di mutagenesi in base all'ipotetica importanza dei siti (vale a dire, più importante è il sito, maggiore è la frequenza), mantenendo in mente i limiti sulla complessità complessiva della biblioteca (vedi Discussione).
2. Sintetizza oligonucleotidi in tutte le colonne, fino alla tripletta che precede immediatamente il secondo sito di mutagenesi di sottosaturazione contando dal lato 3'. Non rimuovere il gruppo di protezione 5'-trityl all'ultimo ciclo di sintesi (utilizzare l'opzione trityl-on sul sintetizzatore). Il gruppo di protezione verrà rimosso all'inizio del ciclo di sintesi successivo (passaggio 1 nella Figura 3).
3. Aprire le colonne di sintesi. Raccogliere il supporto di sintesi del vetro poro (CPG) controllato in un tubo secco da 1,5 mL e mescolare vortice. Ripartizionare la resina mista CPG in nuove colonne di sintesi. Evitare di introdurre umidità, perché diminuirà la resa complessiva (passaggi 2 e 4 nella Figura 3).
4. Proseguire la sintesi, a partire dalla tripletta del sito di mutagenesi di subsaturazione. Assegnare colonne a terzine NNS randomizzate o triplette di tipo selvaggio in base alla frequenza di mutagenesi desiderata (vedere la nota precedente). Se sono presenti ulteriori siti di subsaturazione, procedere solo alla tripletta che precede il successivo sito di mutagenesi di subsaturazione. Ancora una volta, lasciare un gruppo 5'-trityl alla fine (opzione 5'-trityl-on sul sintetizzatore) (passaggio 3 in Figura 3). Quindi continuare con il passaggio 2.3.
5. Se non sono più presenti siti di subsaturazione a valle, completare la sintesi, lasciando un gruppo di 5'trityl alla fine (opzione 5'-trityl-on sul sintetizzatore) (passaggio 5 nella Figura 3).
6. Deproteggere e purificare la libreria di oligonucleotidi secondo le istruzioni del produttore della cartuccia di purificazione.
   NOT: Gli oligonucleotidi rilasciati per deprotezione dal CPG possono anche essere purificati nella fase inversa di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con tritipo-on seguito da una rimozione manuale del gruppo tritipole (1 h trattamento con 80% di acido acetico a RT) e una seconda purificazione HPLC.
7. Controllare la qualità della libreria oligonucleotide in un gel urea-PAGE.

3. Generazione di librerie di varianti

NOT: Utilizzare il plasmide ricombinante del punto 1.6.

1. Generare le librerie da oligonucleotide diretto mutagenesi.
   NOTA: in alternativa, utilizzare il protocollo EP-PCR (passaggio 3.2).
   1. Amplifica una sezione dal promotore T7 al sito enzimatico di restrizione unico che affianca la sequenza mirata alla mutagenesi (in caso di NlaIV: SalI, EcoRI o Eco52I) (Tabella 1B-C, Tabella 2B, Figura 4). Amplifica la seconda parte dall'unico sito enzimatico di restrizione fino alla fine del CES.
   2. Mescolare separatamente 5 - L delle reazioni PCR (dal punto 3.1.1) con 8 L di acqua, 1,5 L di 10x cuscinetto enzimatico di restrizione e 5 unità degli enzimi di restrizione appropriati (SalI, EcoRI o Eco52I) e incubare alla temperatura appropriata per 2 h.
   3. Risolvere i prodotti di entrambe le reazioni utilizzando l'elettroforesi gel di agarose. Tagliare le bande di dimensioni previste e purificare con un kit commerciale.
   4. Eseguire fino a 1/3 dei prodotti purificati in un gel di agarose e misurare la concentrazione di ciascuna banda purificata mediante densitometria.
   5. Impostare la legatura di due parti delle ESC in un rapporto molare 1:1 con 1x tampone di ligase e 1 U di T4 DNA ligase e incubare per 2 h a RT.
   6. Risolvere i prodotti di reazione nel gel di agarose. Ritaglia i prodotti di dimensioni previste e purifica con un kit commerciale.
   7. Amplificare i prodotti di ligazione purificati in una reazione PCR con primer F1 e R2 (Tabella 1C e Tabella 2A). Non eseguire più di 20 cicli di amplificazione.
   8. Frazionare le reazioni PCR in un gel di agarose. Tagliare i prodotti e purificarli con un kit commerciale.
   9. Eseguire un'aliquota 5 Ll della biblioteca purificata dal passo precedente nel gel di agarose e misurare la concentrazione per densitometria.
   10. Clonare un piccolo campione della libreria (fino a 5 l) e la sequenza >15 cloni per controllare la frequenza di mutazione e la distribuzione (Tabella 3). Procedere al passaggio 4.
       NOT: In alternativa, è possibile utilizzare la sequenza ad alta velocità effettiva del piccolo campione di ESC.
2. Eseguire EP-PCR.
   1. Amplificare l'ESC dal plasmide ottenuto nei punti 1.5.7 con i primer F1 e R1. Eseguire 20 cicli con la polimerasi Taq I(tabella 1B).
   2. Gel purifica il prodotto PCR.
   3. Configurare EP-PCR con 2 ng di prodotto PCR purificato del passaggio precedente ed eseguire 15 cicli di EP-PCR (Tabella 1C) con primer F1 e R1.
   4. Gel purifica il prodotto e quantificalo con la densitometria di gel.
      NOT: A causa della bassa concentrazione del prodotto EP-PCR purificato, l'uso di circa 1/3 per la quantificazione.
   5. Clonare un piccolo campione della libreria (fino a 1/5) e la sequenza >15 cloni per controllare la frequenza e la distribuzione della mutazione (Tabella 4).
      NOT: In alternativa, eseguire il sequenziamento ad alto rendimento del piccolo campione di ESC.

4. Esecuzione Compartmentalized In Vitro Trascrizione-traduzione Reazione

1. Testare l'espressione endonuclease e l'attività enzymatica nella trascrizione in vitro-traduzione.
   1. Preparare un breve substrato (200-500 bp) con un unico sito di riconoscimento per l'endonuclease situato vicino al centro della molecola in modo che la reazione di scissione possa essere facilmente rilevata.
      NOT: Il modo più semplice per preparare il substrato è l'amplificazione PCR di un frammento appropriato di qualsiasi molecola di DNA. Il substrato può essere radioetichettato o fluorescente etichettato per semplificare il rilevamento della scissione.
   2. Impostare 50 -L di una reazione di trascrizione-traduzione con 0,5 g di tipo selvaggio ESC secondo le raccomandazioni del produttore. Aggiungere il sale di magnesio (MgCl₂, MgSO₄e l'acetato di magnesio può essere testato) a 1,5 mM e la quantità appropriata di substrato dal passaggio precedente (almeno 0,5 g in caso di DNA non etichettato).
      NOT: È possibile utilizzare qualsiasi kit di trascrizione/traduzione che non contenga nucleasi attivato dal magnesio. Alcuni fornitori di kit utilizzano nucleasi per rimuovere la contaminazione del DNA durante la produzione e quindi aggiungere chelatori come inibitori di nucleatori. Tali kit non sono compatibili con questo metodo.
   3. Incubare la reazione trascrizione-traduzione secondo le istruzioni del produttore. Quindi trasferire la miscela di reazione alla temperatura ottimale per l'enzima di restrizione per 2 h.
   4. Analizzare la scissione del substrato in un gel di agarose seguito da un rilevamento appropriato (ad esempio, colorazione del DNA, visualizzazione della fluorescenza o autoradiografia) (Figura 5).
      NOT: È necessaria almeno una scissione parziale del substrato prima di procedere con la compartimentazione. Se questo non viene raggiunto, è necessaria un'ulteriore ottimizzazione della forma chimica del magnesio o la sua concentrazione.
2. Preparare una miscela surfactant ad olio aggiungendo 225 lofundi nestati 80 e 25 di Tween 80-5 mL di olio minerale in un tubo conico da 15 mL. Mescolare accuratamente invertendo delicatamente il tubo 15x.
3. Per ogni biblioteca trasferire 950 L della miscela olio-surfactant in una fiala criogenica rotonda da 2 mL, etichettare con un nome di biblioteca e trasferire sul ghiaccio. Mettere una piccola barra cilindrica (5 x 2 mm²) in ciascuna fiala.
4. Preparare una miscela di reazione di trascrizione-traduzione in vitro (50 -L per ogni libreria) secondo i suggerimenti del produttore. Integrare la miscela con cloruro di magnesio ad una concentrazione finale di 1,5 mM (vedi passo 4.1.4).
5. Distribuisci 50 gradi in tubi da 1,5 mL sul ghiaccio.
6. Aggiungere 1,7 fmole della libreria (dalla sezione 3) alla miscela di reazione sul ghiaccio.
   NOT: Non utilizzare una maggiore quantità di libreria di espressioni per l'efficienza della selezione. È fondamentale ridurre al minimo la frequenza delle goccioline acquose contenenti più molecole di DNA.
7. Preparare l'emulsione acqua-in-olio consecutivamente per ogni libreria.
   1. Mettere un piccolo becher (o una grande tazza di bottiglia) riempito con ghiaccio su un agitatore magnetico con la velocità di agitazione impostata a 1.150 giri/min.
   2. Trasferire una fiala criogenica con 950 luna di miscela di olio-surfactant e una piccola barra di agitazione dal gradino 4.3 a un becher ghiacciato sul stirrer magnetico. Verificare che la barra di agitazione stia girando.
   3. Aggiungere cinque 10 aliquote della miscela in vitro biblioteca-trascrizione-traduzione per un periodo di 2 minuti in intervalli di 30 s e continuare a mescolare per un minuto aggiuntivo. Trasferire la fiala con l'emulsione in un contenitore di ghiaccio. Procedere con la libreria successiva a partire dal passaggio 4.7.2.
   4. Dopo che tutte le librerie sono state lavorate avviare l'incubazione di tutte le librerie secondo le raccomandazioni del produttore del kit.
8. Trasferire le fiale alla temperatura ottimale per l'endonuclealo ingegnerizzato per altre 2 h e poi metterle sul ghiaccio per almeno 10 min.

5. Continuazione dell'elaborazione delle biblioteche e della selezione

1. Trasferire le emulsioni dalle fiale criogeniche in tubi freddi da 1,5 mL, aggiungere 1 L di 0,5 M EDTA e centrificarle a 13.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
2. Rimuovere la fase superiore dell'olio con una pipetta. Se un'interfase olio-acqua non è visibile, incubare il tubo per almeno 5 min a -20 gradi centigradi per congelare la fase acquosa, quindi immediatamente convogliare la fase di olio liquido.
3. Aggiungete 100 luna di 10 mM Tris HCl pH 8.0 ed eseguire immediatamente l'estrazione con 150 l di fenol:cloroformio (1:1 v/v) da un breve vortice seguito da separazione di fase di 30 s centrifugazione a 13.000 x g. Raccogliere la fase acquosa superiore.
4. Far precipitare il DNA aggiungendo 0,1 vol (15 l) di acetato di sodio da 3 M (pH - 5,2), 2,5-5 g di glicogeno e 2,5 vol (375 l) di etanolo. Incubare a -20 gradi per 1 h e centrifugare per 15 min a 13.000 x g, 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e lavare brevemente il pellet con 1 mL di etanolo freddo 70%.
5. Asciugare il DNA/pellet di glicogeno in un speedvac o all'aria secca per >5 min.
6. Sciogliere il pellet in 50 mL di 10 mM Tris-HCl (pH - 7,5). Aggiungere 5 -L di perline magnetiche streptavidin preparate secondo le istruzioni del produttore e mescolare per 1 h a RT, preferibilmente in un mixer carosello o con vortice delicato.
7. Separare le perline su un supporto magnetico e raccogliere il liquido arricchito nel DNA senza biotina.
8. Concentrare il DNA mediante precipitazioni etanolo (passi da 5.4–5.5).
9. Sciogliere il DNA concentrato dal passo precedente in 5 l di acqua e utilizzare come modello in una reazione PCR con primer F2 e R1 (Tabella 1A).
   NOT: Per evitare problemi con la contaminazione del modello e ridurre al minimo gli artefatti PCR, utilizzare la polimerasi Taq (non Pfu o Phusion) ed eseguire 18–20 cicli con il tempo di estensione proporzionale alla dimensione del modello (1 kb e 1 min) (vedere la tabella 2B).
10. Frazionare il prodotto PCR in un gel di agarose e ritagliare il prodotto di dimensioni previste. Alcune sbilvifia indicano che ci sono prodotti di diverse dimensioni (vedere Figura 6). Purificare il DNA dalla lastra di gel con un kit commerciale.
11. Eseguire una seconda reazione PCR con un massimo di 50 ng di DNA dal passaggio 5.10 e primer F1 e R2 utilizzando lo stesso protocollo come nel passaggio 5.9. Procedere con la purificazione del prodotto come descritto nel 5.10. Il DNA purificato dopo la quantificazione mediante densitometria di gel di agarose (non la spettroscopia UV) può essere utilizzato nel prossimo ciclo di selezione in vitro (passaggio 4.6).

6. Varianti di schermo per la specificità della sequenza alterata

1. Clona le varianti selezionate.
   1. Digerire il prodotto dal passo 5.10 per 2 h con 10 U di enzimi di restrizione appropriati per la clonazione dell'ORF nel vettore di espressione (per NlaIV: NcoI e XhoI) nella temperatura e nel buffer raccomandati dal fornitore dell'enzima. Risolvere i prodotti con elettroforesi gel agarose e isolare il frammento di dimensione previsto.
   2. Preparare il vettore plasmide (ad esempio, pET28) con una doppia scissione con gli stessi enzimi del punto 6.1.1 e il gel purifica il prodotto con un kit di purificazione del gel di DNA commerciale.
   3. Stimare le concentrazioni di vettore e inserto per densitometria con elettroforesi gel agarose.
   4. Impostare una legatura con 1-5 U di T4 DNA ligase e vector:insert molar ratio 1:3–1:5 in 1x buffer ligase raccomandato dal fornitore di enzimi. Incubare per 2 h a RT e introdurre in batteri ospiti appropriati (dal punto 1.3) per trasformazione o elettroporazione¹².
   5. Selezionare gli estrasformanti su piastre LB contenenti l'antibiotico appropriato (50 g/mL di kanamicina per i vettori pET28 o pET30) e l'1% di glucosio.
2. Esprimere varianti proteiche.
   1. Inoculare colonie singole dalla trasformazione (fino a 24 cloni possono essere facilmente elaborati in un solo tratto) in 2 mL di LB con kanamycin (50 g/mL) e l'1% di glucosio e crescere durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione.
   2. Inoculare 15 mL di LB caldo (37 gradi centigradi) contenente 100 g di kanamicina e senza glucosio con 0,75 mL della coltura durante la notte e incubare a 37 gradi centigradi con agitazione vigorosa.
      NOT: Possono essere utilizzati tubi di centrifuga 50 mL o 100 mL di flaconi Erlenmayer.
   3. Aggiungere 176 l of glicerol a 1 mL di coltura notturna (concentrazione finale di glicerolo - 15%) mescolare accuratamente e congelare a -70 gradi centigradi.
   4. Dopo 2–3 h supplemento 15 mL della coltura (dal passo 6.2.1) con IPTG a 1 mM e cultura per un ulteriore 5 h.
   5. Raccogliere il pellet batterico con una centrifugazione (10.000 x g, 4 , 10 min) e congelare a -70 gradi centigradi.
3. Purificare le varianti proteiche.
   1. Trasferire 20 l di sospensione della resina di affinità di nichel in un buffer B1 di 200 gradi in un tubo da 1,5 mL con un'ampia punta pipetta del foro, mescolare delicatamente e centrifugare (5.000 x g, 30 s, 4 gradi centigradi). Rimuovere il supernatante con la pipa e lasciare il tubo sul ghiaccio.
   2. Risospendere il pellet batterico dal punto 6,2,5 in 300 gradi l di B1 da vortice vigoroso. Trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 mL.
   3. Aggiungere 3 luna di 100x cocktail di inibitore della proteasi e soluzione lisosomica in B1 (concentrazione finale di 1 mg/mL). Disintegra le cellule per sonicazione con una sonda dotata di punta. Utilizzare sei raffiche 10 s per campione con >15 s tempo di raffreddamento punta in ghiaccio in mezzo. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio per tutto il tempo.
   4. Detriti di cellule di Pellet per centrifugazione (2 min, 12.000 x g, 4 gradi centigradi) e trasferiscono 250 l di supernatant nella resina dal punto 6.3.1.
   5. Mescolare per 15 min in una stanza fredda, preferibilmente in un mixer carosello o da vortice delicato.
   6. Centrifuga (5.000 x g,30 s, 4 gradi centigradi) e aspirare il supernatante con una pipetta.
   7. Aggiungere 500 l of W tampone e sospendere delicatamente la resina. Centrifuga (5.000 x g,30 s, 4 gradi centigradi) e aspirare il supernatante con una pipetta.
   8. Ripetere il passaggio 6.3.7.
   9. Aggiungere 20 l di tampone E, risospendere delicatamente la resina e lasciare il campione sul ghiaccio per 2-5 min. Centrifugi (5.000 x g, 30 s, 4 gradi centigradi) e raccogliere il supernatante.
   10. Ripetere il passaggio 6.3.9. Supernatanti in piscina.
   11. Analizzare i campioni di proteine in base a SDS-PAGE (5-10 ) (Figura 7).
4. Schermo per le varianti con la specificità alterata.
   1. Asdire l'attività di scissione sul DNA lambda batteriophage. Il campione proteico può costituire fino al 10% del volume di reazione finale. Un totale di 2 , lofilio di campione proteico per 0,5 g di DNA e 2 h di tempo di reazione è un buon punto di partenza.
   2. Analizzare i prodotti di reazione da agarose gel elettroforesi insieme ai prodotti generati dall'enzima di tipo selvaggio. Selezionare i cloni che generano modelli di scissione chiaramente distinguibili da quello generato dall'enzima di tipo selvaggio per ulteriori analisi (Figura 8).

Risultati

Questo protocollo è solo uno strumento per aumentare la frequenza delle varianti desiderate di un REase ingegnerizzato impoverindo (ma non eliminando) due classi indesiderate: enzimi inattivi e endonucleases con invariata specificità della sequenza di caratteri selvatici. D'altra parte, poiché cambiare la specificità di REase è estremamente difficile, trovare anche una di queste varianti che produce un modello di scissione diverso dall'enzima di tipo selvaggio in un singolo screening di 24 cloni dovrebbe essere considerato un successo. Nelle nostre mani i migliori schermi potrebbero identificare fino al 20% delle varianti promettenti (Figura 8A).

Il risultato positivo dipende fortemente dalla qualità di una biblioteca (cioè una frequenza limitata delle sostituzioni e dalla loro distribuzione casuale) e dalla cattura efficiente della popolazione biotinylata dei membri della biblioteca (passaggi da 3,6 a 3,7). Entrambi i problemi possono essere rilevati. La qualità della libreria deve essere controllata prima della selezione sequenziando il maggior numero possibile di cloni (>15) o la sequenza diretta della libreria mediante la sequenza ad alta velocità effettiva (passaggio 3.10, tabella 3). Se la maggior parte dei cloni selezionati non è attiva, questa è una chiara indicazione di fallimento della selezione di cattura streptavidin. Un effetto simile si osserva nel caso di librerie che subiscono molti cicli di selezione, perché tali librerie sono molto probabilmente dominate da varianti inattive sfuggite al passaggio di selezione di cattura streptavidin (Figura 8B). Pertanto, è consigliabile eseguire lo screening dopo ogni ciclo di selezione e sviluppare ulteriormente varianti propromesse selezionate manualmente piuttosto che dipendere dall'iterazione della selezione.

Figura 1: Selezione in vitro di una nuova specificità della sequenza basata sull'ingegneria NlaIV. (A) L'organizzazione della cassetta di espressione/selezione (ESC) comprende due siti di riconoscimento per REase, 1) la sequenza selezionata (GGATCC) vicino all'estremità destra e 2) la sequenza contatore selezionato (GGSSCC) vicino all'estremità sinistra, così come il promotore T7p e T7t-T7 e il terminatore T7. I siti di associazione primer sono mostrati di seguito. Cleavage per tipo selvaggio e varianti NlaIV selezionate sono mostrati rispettivamente come triangoli rossi e verdi. (B) Fasi del ciclo di selezione: I) Emulsione delle mischie di reazione trascrizione-traduzione-cleavazione con la libreria ESC; II) Tutto il DNA biotinylato viene catturato su particelle magnetiche rivestite con streptavidina e rimosse, rimuovendo così la codifica delle varianti inattive; III) Gli ESC che codificano i REases con attività di tipo selvaggio (cioè quelli in grado di fendere la sequenza GGSSCC) vengono eliminati perché la scissione della sequenza separa i siti di legame per i primer avanti e indietro. Pertanto, non si verifica alcuna amplificazione di questi ESC; IV) L'input per il prossimo round di selezione viene creato mediante l'aggiunta di biotina all'estremità destra e la reintroduzione della variazione del contatore delle sequenze selezionate sull'estremità sinistra. Ristampato da Czapinska et^{al. 8} con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Preparazione dell'ESC. Il frammento derivato dal costrutto originale in un vettore di espressione contenente NlaIV ORF sotto il controllo del promotore T7 è stato modificato per essere adatto per l'espressione/selezione. Il sito di NlaIV a valle del NlaIV ORF è stato rimosso e siti unici (SalI, EcoRI ed Eco52I) che sono stati utilizzati per mutagenizzare posizioni selezionate sono stati introdotti nel NlaIV ORF come mutazioni silenziose. Il costrutto finale è stato amplificato con primer di fianco che ha introdotto due siti NlaIV a fianco: la sequenza contatore selezionato (GGSSCC) a sinistra e la sequenza selezionata (GGATCC) a destra. Il primer inverso ha anche introdotto la biotina. I Primer utilizzati nella creazione di ECS mutati sono indicati come frecce blu ed etichettati di seguito (vedere la tabella 1B,C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Schema di sintesi divisa e mix. L'esempio si riferisce alla sintesi del primer MutB in cui è stata introdotta una sequenza NNS con frequenza 0,8 in quattro posizioni (vedere anche la tabella 3). Si noti che la sintesi chimica viene effettuata da 3' a 5', ma tutte le sequenze sono mostrate in formato canonico 5'-3' di orientamento (cioè procede da destra a sinistra in questo schema). Le sequenze di tipi selvaggi nelle posizioni mutagenizzate vengono visualizzate in verde mentre le sequenze mutageni NNS sono in rosso. Il sito di riconoscimento SalI che viene successivamente utilizzato per introdurre mutazioni nelle ESC è sottolineato. Sono indicati i punti di miscelazione e divisione dei passaggi (2 e 4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Uso di siti di enzimi di restrizione unici nella mutagenesi mirata all'oligonucleotide. La strategia di introduzione della mutazione è mostrata su un esempio della costruzione di biblioteche A-C (vedi passaggi da 3.1 a 3.7). Ristampato da Czapinska et^{al. 8} con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Scissione endonucleolytica in trascrizione-traduzione in vitro. (A) Cleavage di un substrato di prova in buffer REase ottimale: 1) Substrato, 612 bp PCR prodotto con un unico sito di riconoscimento NlaIV; 2) Prodotti Cleavage, 355 bp e 257 bp. (B) Cleavage in una reazione di trascrizione in vitro-traduzione (contenente 0,5 g di ESC): 1-2) 15 -ll di traduzione trancrion in vitro senza substrato (linea 2: reazione integrata con 1,5 mM MgCl₂); 3-4) 15 aliquote di trascrizione in vitro-traduzione con 1 g di substrato di prova; (linea 4: reazione integrata con 1,5 mM MgCl₂). Marcatore di dimensione S-DNA (pBR322 digerito con MspI). I campioni sono stati risolti nel 6% di PAGE nativo. Il DNA era macchiato di bromuro di etidio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Prodotti della prima PCR nel ciclo di selezione. Vedere la figura 1B, il passaggio III; passaggio del protocollo 5.10. I set di colonne 1 e 2 sono aliquote di due librerie diverse caricate in triplice copia. Standard di dimensioni S-DNA (DNA lambda digerito con HindIII ed EcoRI). La freccia indica la posizione dell'ESC a lunghezza intera (1.050 bp). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: varianti NlaIV purificate per un ulteriore screening in mini scala. Vedere il passaggio 6.3.11. Ogni riga contiene un 10 aliquote di una variante diversa. Standard di peso molecolare S-protein. La massa molecolare della sottounità NaIV REase è di 29,9 kDa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Esempi di screening delle varianti NlaIV per l'alterazione della specificità della sequenza. Vedere il passaggio 6.4.2. (A) Screening riuscito con alta frequenza di varianti promettenti. S - Marcatore di dimensione del DNA, DNA lambda sedato con HindIII ed EcoRI; tipo selvaggio (wt) - DNA lambda selvato con tipo selvaggio NlaIV; - substrato di DNA lambda, non scisso; altre colonne, varianti con un'attività molto bassa. Le varianti sono etichettate ! - varianti promettenti che producono un modello di scissione distinto dall'enzima di tipo selvaggio; ? : varianti che potrebbero anche avere modificato la preferenza di sequenza. (B) Screening infruttuoso, con una maggioranza di varianti inattive e una variante con un modello di scissione apparentemente inalterato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Selezione alternativa per legatura. Questa alternativa può essere utilizzata per tutte le REases che generano estremità appiccicose. Qui presentiamo un protocollo di esempio per uno schema di selezione per l'enzima MwoI (inedito). I) Sequenza selezionata (situata all'estremità destra dell'ESC) con residui definiti visualizzati in rosso e variazione selezionata della sequenza cognate mostrata in blu. Tra parentesi sotto il contatore selezionato sequenza da posizionare all'estremità sinistra del CES è mostrato; II) Prodotto della scissione MwoI; III) Dopo aver terminato la trascrizione/traduzione in vitro, i prodotti vengono purificati e la legatura viene eseguita con l'adattatore in eccesso. Solo i prodotti di scissione che sono stati scissi nella sequenza selezionata possono partecipare alla legatura. Pertanto, le varianti inattive vengono eliminate e il passaggio di pulldown non è necessario. Il prodotto di scissione nel contatore selezionato sequenza (all'estremità sinistra del CES, non mostrato) non può partecipare a questa legatura perché l'estremità sporgente dell'adattatore non è complementare alla sequenza contatore selezionato; IV) La PCR selettiva utilizza la stessa strategia del protocollo principale per eliminare le varianti con la specificità della sequenza degenerata di tipo selvaggio (Disl di associazione dell'introduzione dell'adattatore F1 al sito selezionato del contatore), mentre le varianti inattive vengono eliminate dall'inversione predefinita selettiva che non può essere associata allo zio (e quindi non modificata dalla legatura dell'adattatore) all'estremità destra. Nel ciclo successivo il processo può essere iterato utilizzando un adattatore identico al prodotto di scissione della fase precedente (cioè la "cassetta cleaved" nel pannello III) e un appropriato primer inverso selettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Primer utilizzati nell'ingegneria NlaIV. Le sequenze dei siti di restrizione menzionati nei commenti sono sottolineate. Le lettere minuscole indicano sequenze che non hanno complementi nei modelli di DNA. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Tabella 2: Condizioni di reazioni PCR da utilizzare nel protocollo. T_m - temperatura di fusione del primer (se T_m è diverso per i primer, deve essere utilizzato il T_m inferiore). Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Tabella 3: Risultati del controllo di qualità di due primer mutageni sintetizzano con la strategia split-and-mix. I codoni mutagenizzati sono indicati con [XXX]. Un numero di indice inferiore indica la posizione di un amminoacido codificato. Adattato da Czapinska et^{al. 8} con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Tabella 4: Risultati di EP-PCR. Parametri principali derivati dall'analisi di sequenza di 22 cloni di ECS. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Discussione

Il protocollo di selezione qui descritto è stato testato per NlaIV⁸, una dimeric pd-(D/E)XK fold recognition sequence che riconosce un sito di destinazione palindromico con basi NN centrali e catalizza un taglio finale smussato tra le basi NN. NlaIV è stato scelto perché la scissione tra le basi NN suggerisce che queste basi sono vicine alla proteina nel complesso. In linea di principio, il protocollo potrebbe essere utilizzato per qualsiasi restrizione specifica della sequenza endonuclease, monomerico o dimeric, di qualsiasi gruppo di piegatura, catalizzando le rotture a doppio filo di qualsiasi barattolo, indipendentemente dal fatto che i domini catalitici e di specificità coincidano (come nell'esempio NlaIV) o siano separati (ad esempio, FokI). Inoltre, il protocollo in linea di principio è utile non solo per la generazione di nuove specificità enzimatiche più strette, ma potrebbe anche essere utilizzato per eliminare le attività delle stelle o per creare endonucleasi ad alta fedeltà. Tuttavia, tutto questo non è stato ancora testato. In particolare, l'eliminazione mirata dell'attività stellare può essere complicata, perché gli stessi residui di amminoacidi potrebbero essere coinvolti nel legame con le basi desiderate e indesiderate. Le fasi in vitro descritte in questo protocollo non si limitano alla selezione delle specificità ristrette, ma potrebbero anche essere utilizzate per selezionare specificità altrimenti modificate. Tuttavia, c'è poi un problema con le endonucleasi varianti: se lo spettro dei substrati include nuovi bersagli non scissi dalla endonucleasi parentale, in generale non c'è un buon modo per proteggere le cellule dagli effetti nocivi di questa attività. Al contrario, se la specificità endonuclease viene solo ridotta, gli obiettivi sono un sottoinsieme dei bersagli di tipo selvatico, e quindi il cognato metiltransferase già disponibile dovrebbe essere completamente protettivo.

Il nostro protocollo differisce per diversi aspetti da molti protocolli di evoluzione diretti. La diversità dei fotogrammi di lettura aperti viene generata una volta all'inizio dell'esperimento, non in ogni iterazione. Inoltre, è creato dalla sintesi split-and-mix, piuttosto che da EP-PCR. Per le sostituzioni NNS dei codoni, come usato in questo lavoro, ci sono (4 x 4 x 2)⁶ combinazioni di 1,07 x 10⁹ per sei posizioni. Pertanto, ogni variante è presente in media una volta su 1,7 fmoles di ESC. Questa capacità può essere aumentata a sette posizioni utilizzando la sintesi con una miscela di 20 precursori di trinucleotidi che viene offerta da Glen Research o diminuendo la frequenza di mutazione in posizioni meno promettenti con la sintesi di oligonucleotidi split-and-mix. Se possibile, si raccomanda di limitare l'entità della variazione a sei posizioni. Ovviamente, tale mutagenesi di targeting richiede alcune conoscenze preesistenti su almeno le regioni del REase coinvolte nel binding del substrato. Il protocollo split-and-mix per generare diversità presenta chiari vantaggi rispetto all'EP-PCR. Utilizzando EP-PCR, abbiamo ottenuto varianti e sequenze invariate che trasportano otto sostituzioni per ESC NlaIV nello stesso EP-PCR (Tabella 4). La libreria di EP-PCR contiene una frazione sostanziale di cloni che dovrebbero essere evitati (sequenze di tipo selvaggio, sostituzioni multiple, mutazioni frameshift e senza senso e mutazioni in luoghi che difficilmente influenzano la specificità della sequenza).

Il nostro protocollo si differenzia anche da molti altri protocolli di evoluzione diretti per la presenza di due passaggi di selezione sequenziali. La selezione positiva assicura che l'attività desiderata venga mantenuta, altrimenti il tag biotina non viene rimosso e la sequenza di codifica può essere rimossa tramite pull-down. È tecnicamente possibile che l'emergere fortuito di una nuova specificità non sovrapposta (ad esempio, GCATGC) possa portare alla rottura del tag biotina, se un sito di scissione adatto è presente vicino alla scissione desiderata, ma non altrove. Tuttavia, questo dovrebbe essere altamente improbabile. La selezione negativa rimuove i frame di lettura aperti che codificano per gli enzimi che hanno ancora l'attività indesiderata. Questo passaggio non è strettamente obbligatorio, perché il protocollo arricchirà comunque la libreria di output con varianti che sono in grado di fendere la sequenza di selezione ma non in grado di fendersi altrove nell'ESC, rendendolo quindi inadatto per l'amplificazione PCR. Tuttavia, l'efficacia della selezione dovrebbe essere inferiore perché gli enzimi con la specificità della sequenza originale non verranno rimossi dall'output e supereranno le varianti promettenti con specificità alterata, ma anche una diminuzione dell'attività enzimatica. Si noti che a livello di popolazione, le sequenze di destinazione desiderate e indesiderate possono, ma non devono essere, degenerare. Nell'esempio NlaIV, l'anti-bersaglio è stato degenerato e il bersaglio non degenerato. Anche quando c'è degenerazione a livello di popolazione, in una sola goccia è presente un solo bersaglio (non degenerato). Nel nostro protocollo, le sequenze target e anti-target vengono reintrodotte ad ogni ripetizione dei passaggi di selezione. Pertanto, un telaio di lettura aperto deve codificare un enzima in grado di fendere tutti i possibili bersagli, e incapace di fendere uno qualsiasi degli anti-bersagli, per sopravvivere a più round di selezione. Si noti che la necessità di reintrodurre la destinazione antiselezione a ogni iterazione del protocollo impone due PCR sequenziali. Il primo PCR utilizza un primer che anneals al di fuori del anti-bersaglio, in modo che la scissione dell'anti-bersaglio previene la reazione PCR. Il secondo PCR richiede un primer che va oltre l'anti-bersaglio e reintroduce l'anti-bersaglio, per assicurarsi che durante più round di selezione, ogni frame di lettura aperto venga testato rispetto a tutte le varianti dell'anti-bersaglio.

Per gli enzimi che generano estremità appiccicose, è possibile utilizzare un protocollo alternativo correlato basato su un metodo descritto in precedenza per l'isolamento di REase ORF^10. L'esaurimento delle varianti inattive da parte dell'acquisizione di biotina utilizzata nei nostri esperimenti viene sostituita nel protocollo alternativo dalla legatura dell'adattatore compatibile con una sequenza utilizzata come sito di associazione di primer in un PCR selettivo (Figura 9). Solo gli ESC che producono enzimi con la specificità selezionata generano estremità che supportano la legatura e saranno pertanto selezionate. La sequenza dell'estremità appiccicosa della sequenza contatore eselected deve essere progettata in modo tale da non poter partecipare alla legatura con gli adattatori. L'iterazione del processo di selezione può essere facilmente ottenuta passando da due adattatori diversi e di conseguenza due diverse primer inverse nella PCR selettiva.

Anche con nuovi protocolli, il compito di ingegneria nuove specificità in vitro è ancora molto impegnativo. Per le REase di tipo tipico II, la specificità della sequenza e l'attività endonucleolitica dipendono dalle stesse regioni proteiche. È quindi difficile modificare l'uno senza influenzare l'altro. Il successo è reso più probabile da una strategia che tiene conto dell'impronta dell'enzima, rispetta la simmetria delle interazioni proteina-DNA e si basa su preferenze enzimatiche preesistenti, che dovrebbero essere determinate in anticipo negli esperimenti biochimici, come è stato fatto per l'esempio NlaIV⁸.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1000Å Supporto CPG (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	Possono essere utilizzati anche altri fornitori
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
Kit di estrazione del gel GeneJET Thermo	Scientific	K0691	Qualsiasi altro kit può essere utilizzato Cartuccia
purificazione del DNA Glen-Pak	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
		pET 28a	Al suo posto può essere utilizzato qualsiasi altro vettore con promotore T7 a monte del sito di plycloning
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Thermo Scientific	F530S	Al suo posto può essere utilizzato qualsiasi altro polimero termofilo ad alta fedeltà e altamente processuale
Foglio d'acciaio poroso	Biosset	40-063
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Endonucleasi di restrizione	Thermo Scientific		Ovviamente possono essere utilizzati altri fornitori, enzimi
Streptavidina Perline magnetiche	New England Biolabs	S1420S	Possono essere utilizzati anche altri fornitori. Abbiamo testato positivamente i letti dei
prodotti chimici Sigma Synthesis, tra cui i fosforamidi	Carl Roth		Possono essere utilizzati anche altri fornitori
Colonne di sintesi (diverse dimensioni)	Biosset
T4 DNA ligasi	Thermo Scientific	EL0011	È possibile utilizzare qualsiasi altra ligasi